Expression de protéines

L’étude de l’expression de différentes protéines de lysats cellulaires d’EA.hy926 et d’HUVEC a été réalisée par la technique de Western Blots. Cette technique se base sur l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer des protéines selon leur masse moléculaire. Ces protéines sont ensuite transférées du gel sur une membrane où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt (anticorps primaire). La membrane est ensuite exposée à un anticorps secondaire couplé à une enzyme permettant la visualisation de la protéine étudiée. Les anticorps primaires ainsi que les conditions spécifiques utilisés sont rapportés Table 20. L’anticorps anti-tubuline a été utilisé comme contrôle de charge.

2.2.2 Immunohistochimie 2.2.2.1 Technique

Des coupes sériées de 5 µm d’épaisseur ont été réalisées au sein de chaque bloc de tissu enrobé en paraffine. La première et la dernière lame ont été colorées à l’hématoxyline-éosine afin de réaliser un contrôle morphologique, les autres lames étant utilisées pour la réalisation des immunomarquages par la méthode biotine-streptavidine (Figure 30). Les anticorps primaires et les conditions spécifiques utilisés sont rapportés Table 21. Pour chaque cas analysé, la qualité de fixation des tissus a été évaluée par la mise en évidence d’une expression adéquate de la vimentine. Des contrôles positifs externes sont réalisés pour tous les anticorps. Des contrôles négatifs sont réalisés par l’utilisation d’un sérum immun en remplacement de l’anticorps primaire.

2.2.2.2 Analyse semi-quantitative

Pour les lymphomes systémiques (Etude I - 56 cas), l’expression des galectines au sein des cellules lymphomateuses des LNH a été évaluée selon les critères suivants : pas de marquage, rares cellules marquées ou marquage diffus.

Pour les LH, la positivité ou négativité a été évaluée en fonction des différents types cellulaires : cellules de Reed-Sternberg et population réactionnelle.

L’expression des galectines a également été évaluée au sein des CE des lymphomes systémiques selon les critères suivants : intensité de marquage (pas de marquage, faiblement marqué ou fortement marqué) et pourcentage de vaisseaux marqués (pas de marquage, <30%, 30-60% ou >60% de vaisseaux marqués).

Pour les LPSNC (Etude II - 46 cas), l’expression des galectines a été évaluée au sein des cellules lymphomateuses et des CE selon les critères suivants : intensité de marquage (pas de marquage, faiblement marqué ou fortement marqué) et pourcentage de marquage (pas de marquage, <30%, 30-60% ou >60%). L’expression des galectines au sein des cellules lymphomateuses et des CE a été considérée comme positive lorsque les cellules présentaient une forte intensité de marquage et/ou que le pourcentage de cellules marquées était supérieur à 60%.

Dans la troisième étude, l’expression de VEGFR1 et VEGFR2 au sein des CE a été évaluée selon les critères suivants : intensité de marquage (pas de marquage, faiblement marqué ou fortement marqué) et le nombre de vaisseaux marqués par spot.

2.2.2.3 Analyse quantitative

L’analyse quantitative a été réalisée par analyse d’image (Figure 31) à l’aide du logiciel Histolab (Alphélys, France). Cette quantification a été réalisée en suivant un protocole de standardisation d’acquisition des images, de détection du marquage et de collecte des données comme publié par Decaestecker et coll. (Figure 32) (Decaestecker et coll. 2009). Nous avons développé le logiciel pour caractériser l’expression de galectine-1 par les CE des vaisseaux des ganglions lymphatiques normaux et des lymphomes systémiques. Pour chaque cas, 30 vaisseaux ont été choisis aléatoirement et entourés manuellement. Ensuite, au sein de ces vaisseaux, l’intensité de marquage, la surface de tissu analysé ainsi que la surface marquée sont détéctées automatiquement. L’intensité de marquage pour chaque vaisseau correspond à l’intensité intégrée totale (c’est-à-dire la somme des intensités de chaque pixel positif) divisée par la surface de tissu analysé (Quick Score). Le vaisseau est considéré comme galectine-1 positif si cette intensité de marquage est > 1 (unités arbitraires). Pour chaque cas,

l’expression de galectine-1 a été ensuite évaluée à l’aide de deux paramètres : l’intensité moyenne du marquage vasculaire (moyenne arithmétique de l’intensité des 30 vaisseaux) et le pourcentage de vaisseaux marqués (c’est-à-dire avec une intensité >1).

2.2.2.4 Analyse de la densité microvasculaire

La DMV, marqueur d’angiogenèse le plus courament utilisé, est la mesure de la surface ou du nombre de vaisseaux par surface de tissu (Nico et coll. 2008; Vermeulen et coll. 2002). La DMV a été analysée quantitativement par le rapport de la surface vasculaire marquée par l’anticorps anti-CD31 sur la surface tissulaire totale. Pour chaque cas de lymphome systémique, entre 100 et 432 champs (moyenne: 226 champs représentant une surface moyenne de 10 mm²) ont été analysés. La surface marquée par l’anticorps anti-CD31 ainsi que la surface de tissu analysé sont détectées automatiquement. Comme pour l’analyse quantitative de l’expression de galectine-1, la quantification a été réalisée en suivant un protocole de standardisation d’acquisition des images, de détection du marquage et de collecte des données (Figure 32) (Decaestecker et coll. 2009).

2.2.3 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

La technique d’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) a été utilisée pour mesurer la phosphorylation de VEGFR1, VEGFR2, FAK, Src, ERK1/2, Akt et Hsp27.

La technique d'ELISA se déroule en différentes étapes. Les puits d’une plaque 96 puits sont

coatés avec l’anticorps de capture qui reconnaît la protéine d’intérêt (protéine totale). Le lysat cellulaire est ensuite appliqué dans les puits. Après rinçage, un anticorps biotinylé de détection spécifique des phosphotyrosines (pour le VEGFR1 et le VEGFR2) ou spécifiques de la protéine phosphorylée (pour les autres tests) est ajouté sur la plaque. L’ajout d’une enzyme (peroxidase de raifort) couplée à la streptavidine et de son substrat (tétramethylbenzidine) permet la quantification de la protéine étudiée. La concentration protéique des lysats cellulaires est mesurée grace à un test colorimétrique (méthode de Bradford) et les résultats des différentes conditions ont été normalisés par la concentration protéique des lysats cellulaires. Pour chaque expérience, un contrôle positif a été réalisé à l’aide de la protéine phosphorylée récombinante fournie dans le kit ELISA. La technique d’ELISA a été réalisée selon les instructions du fournisseur (R&D systems). Deux expériences indépendantes ont été réalisées en triplicat.