Etude III : Involvement of vascular endothelial growth factor receptor-1 and -2 in

endothelial cells to galectin-1 and galectin-3

Au vu des résultats des deux premières études, nous pensons que les galectines-1 et -3 pourraient jouer un rôle dans l’angiogenèse des lymphomes. Ce rôle est très certainement complexe et est illustré, en partie, par le fait que l’expression endothéliale de ces galectines est différente entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. Alors que certains lymphomes systémiques sont caractérisés par une expression endothéliale de galectine-1, les CE des vaisseaux de certains LPSNC sont caractérisées par une expression de galectine-3. Ces expressions différentes de galectines selon l’organe hôte sont à intégrer avec la notion générale d’hétérogénéité des CE. Celle-ci s’observe également entre les CE des vaisseaux normaux et les TAECs. Suite à ces observations, nous avons décidé d’étudier l’implication de la galectine-1 et de la galectine-3 extracellulaires sur deux modèles in vitro de CE (cellules HUVEC et EA.hy926).

1. Justification du choix des modèles in vitro

Comme les TAECs présentent un phénotype et un profil d’expression de gènes et de protéines différents des CE quiescentes (Introduction point 3.1.2.4), il nous a semblé important d’étudier des lignées de CE différentes.

Cependant, il est difficile d’isoler des TAECs du fait du microenvironnement complexe constitué des composants de la paroi vasculaire, de la MEC, des cellules stromales et tumorales. De nombreuses études in vitro de l’angiogenèse tumorale sont réalisées avec les cellules HUVEC.

La revue de la littérature nous a permis de poser l’hypothèse que la lignée de CE EA.hy926 pourrait s’apparenter aux TAECs. La lignée EA.hy926 est un hybridome entre des HUVEC et la lignée de carcinome pulmonaire A549 (Edgell et coll. 1983). Or, les cellules tumorales peuvent fusionner avec les CE et cette fusion a été proposée comme un des mécanismes pouvant expliquer le fait que les CE associées aux lymphomes présentent les mêmes anomalies cytogénétiques que les cellules lymphomateuses (Introduction point 3.4.1.2) (Mortensen et coll. 2004; Streubel et coll. 2004). La lignée EA.hy926 conserve les caractéristiques des CE (Edgell et coll. 1983). Cependant, ces cellules présentent une faible (voire une absence) d’expression de CD34 et d’intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), comme cela a déjà été observé pour les TAECs (Griffioen et coll. 1996; Hellwig et coll. 1997; Lidington et coll. 1999; Unger et coll. 2002). De précédentes études, résumées Table 28, ont comparé la lignée EA.hy926 et la lignée HUVEC en terme de profil d’expression génique et protéique et de réponse aux facteurs de croissance, mettant en évidence des similarités mais

soulignant également des différences phénotypiques et biologiques entre ces cellules (Baranska et coll. 2005; Boerma et coll. 2006; Claise et coll. 1999; Lidington et coll. 1999; Thomas et coll. 1997).

La première partie de cette étude a pour but de valider notre hypothèse que la lignée EA.hy926 pourrait être considérée comme un modèle in vitro de TAECs et HUVEC un modèle de CE normales.

1.1 Comparaison morphologique des lignées HUVEC et EA.hy926

Ces deux lignées présentent la capacité de former un réseau de tubes lorsqu’elles sont cultivées sur un substrat de matrigel. Alors que les tubes formés par les HUVEC sont fins et bordés d’une seule couche de CE, les tubes formés par les cellules EA.hy926 sont complexes et anarchiques, plus larges et bordés de plusieurs couches de cellules (Figure 43).

1.2 Comparaison de l’expression des gènes des lignées HUVEC et EA.hy926

Cette comparaison a été réalisée à partir des données de l’étude de Boerma et coll. dans laquelle le transcriptome de ces deux lignées a été analysé (chapitre Matériel et Méthodes point 2.1.2).

Nous y avons identifié 606 gènes surexprimés dans la lignée EA.hy926 par rapport à la lignée HUVEC et 2174 sous-exprimés. Parmi ces gènes, nous avons ciblé notre analyse sur les gènes associés aux TAECs ou à l’angiogenèse. La Table 29 détaille les variations d’expression entre la lignée EA.hy926 et la lignée HUVEC de différents gènes associés à l’angiogenèse ou aux TAECs. Parmi les gènes surexprimés dans la lignée EA.hy926, certains ont déjà été associés aux TAECs tels que, par exemple, le CD44, le tumor endothelial marker 8 (TEM8 ou

ANTXR1), l’intégrine β3 et l’intégrine β5 (Erdreich-Epstein et coll. 2000; Griffioen et coll. 1997; St Croix et coll. 2000; Ying et Hofseth 2007). Parmi les gènes sous-exprimés par les cellules EA.hy926, le facteur de von Willebrand et le VEGFR2 ont déjà été observés comme sous-exprimés dans les TAECs (Chen et Gorski 2008; Kume 2009; Schellerer et coll. 2007; Scoditti et coll. 2010; Shiao 2003; Zhang, Neiva et coll. 2010).

1.3 Comparaison de l’expression de protéines des lignées HUVEC et

EA.hy926

L’analyse par Western Blot montre que, comparativement à la lignée HUVEC, la lignée EA.hy926 se caractérise par une expression protéique plus élevée de VEGFR1, de CD44 et à un moindre degré de CD13. A l’opposé, on observe une diminution de l’expression de VEGFR2 par rapport à la lignée HUVEC (Figure 44). Il faut noter qu’on n’observe pas de différence pour l’expression de galectine-1 et de galectine-3 entre les deux lignées (Figure 44).

Ces données nous ont amené à penser que le VEGFR1 pourrait être un biomarqueur des TAECs. Pour valider cette hypothèse, nous avons analysé sa distribution au sein d’un panel de tissus humains normaux et tumoraux.

1.4 Expression des récepteurs au VEGF par les CE de tissus humains

normaux et tumoraux

Les résultats précédents (sections 1.1-1.3) nous confortent dans le choix d’utiliser ces deux lignées comme modèles d’angiogenèse tumorale et non tumorale.

Une des caractéristiques importantes et peu connue est le faible taux d’expression de VEGFR1 dans les CE normales comparativement aux TAECs. Nous avons donc évalué, de manière semi-quantitative, l’expression de VEGFR1 et de VEGFR2 par les CE des vaisseaux de tissus humains normaux et tumoraux à l’aide des TMA (Figure 45).

Nous montrons que le VEGFR1 est peu exprimé dans les CE normales (tant en ce qui concerne l’intensité de marquage que le nombre de vaisseaux marqués) comparativement aux TAECs (p<0.001 ; Figures 45B-C). A l’opposé, l’expression de VEGFR2 est plus faible dans les TAECs. En effet, l’intensité de marquage est significativement diminuée dans les TAECs en comparaison aux CE normales (p=0.012 ; Figures 45B-C).

L’ensemble de ces résultats supportent donc notre hypothèse que la lignée EA.hy926 présente des caractéristiques plus proches des TAECs en comparaison à la lignée HUVEC.

2. Effets biologiques des galectines-1 et -3 extracellulaires sur les

lignées HUVEC et EA.hy926

2.1 Modulation de la croissance cellulaire

La Figure 46A illustre les effets des galectines-1 et -3 sur la croissance des cellules HUVEC. 10 µg/ml de galectine-1 induit une augmentation significative de la croissance cellulaire (augmentation moyenne de 47% par rapport au contrôle ; p=0.001). Nous n’avons pas observé de modulation de la croissance cellulaire induite par la galectine-3 et l’effet observé lors de l’ajout de la combinaison des galectines-1 et -3 est d’amplitude similaire à celui observé pour la galectine-1 seule (augmentation moyenne de 35% par rapport au contrôle ; p=0.007).

La lignée EA.hy926 présente une réponse différente aux galectines comme illustré en Figure 46B. La galectine-1 seule ou la galectine-3 seule n’ont pas d’effet sur la croissance cellulaire (augmentation moyenne de moins 10% par rapport au contrôle) tandis que la combinaison de ces deux galectines à 10µg/ml a un effet synergique (augmentation moyenne de 42% par rapport au contrôle ; p=0.005).

2.2 Modulation de la formation de tubes

En ce qui concerne les cellules HUVEC, la galectine-1 et la galectine-3 induisent la formation de tubes avec un effet additif pour la combinaison des deux galectines (augmentation moyenne par rapport au contrôle de 56%, 43% et 91% pour 10µg/ml de galectine-1, 10µg/ml de galectine-3 et 10µg/ml de chacune de ces galectines respectivement) (Figures 46C et E).

Par contre, l’effet de la combinaison des deux galectines est synergique sur la formation de tubes par les cellules EA.hy926 (augmentation moyenne par rapport au contrôle de 12.8%, 32.1% et 135.5% pour 1µg/ml de galectine-1, 1µg/ml de galectine-3 et 1µg/ml de chacune de ces galectines respectivement) (Figures 46D et F).

2.3 Modulation de l’activation des récepteurs au VEGF

La stimulation des CE par les galectines ne modifie pas l’expression protéique du VEGFR1 et du VEGFR2 évaluée par Western Blot (Figure 47).

Pour les cellules HUVEC, l’ajout de galectine-3 induit une augmentation significative (p=0.04) de la phosphorylation du VEGFR2. La combinaison des galectines-1 et -3 (1µg/ml) induit également une augmentation significative (p=0.0002) de la phosphorylation du

VEGFR2. Par contre, l’ajout de galectines ne modifie pas la phosphorylation du VEGFR1 (Figures 48A-B).

Pour les cellules EA.hy926, la combinaison des deux galectines induit une augmentation significative de la phosphorylation de VEGFR1 (p=0.008 ; Figure 48C). De plus, l’ajout de galectine-1, de galectine-3 ou de leur combinaison (1µg/ml) induit également une augmentation significative de la phosphorylation du VEGFR2 (p=0.04, p=0.04 et p=0.009 respectivement ; Figure 48D).

Cette activation du VEGFR2 est inhibée par l’ajout de 50mM de lactose mais pas par le sucrose (Figure 49), démontrant que l’activation du VEGFR2 induite par les galectines dépend de leurs interactions avec les β-galactosides.

Nous avons validé que la formation de tubes induite par la combinaison des galectines nécessitait l’activation des VEGFRs. En effet, l’ajout de vatalanib, un inhibiteur des tyrosine kinases du VEGFR2 et du VEGFR1, inhibe celle-ci (données non illustrées).

2.4 Modulation de l’activation des voies de signalisation suite à l’activation

des récepteurs au VEGF

Comme décrit dans l’Introduction (point 3.2.1.2), les voies de signalisation majeures liées à l’activation de VEGFR2 sont les voies de la PLC-γ, PI3K, Src, FAK et Hsp27. Nous avons donc étudié l’activation des acteurs principaux de ces voies. Les modulations du statut de phosphorylation de ERK1/2, Akt, Src, FAK et Hsp27 par les galectines ont été caractérisées par des tests ELISA réalisés sur les CE EA.hy926.

Nous n’avons pas observé de modification de phosphorylation des protéines Akt, FAK et Src. La Figure 50 illustre que la galectine-1 a tendance à augmenter la phosphorylation d’ERK1/2 (augmentation moyenne de 36% par rapport au contrôle) et d’Hsp27 (augmentation moyenne de 26% par rapport au contrôle). Cet effet est inhibé lors de l’ajout de vatalanib, inhibiteur des tyrosine kinases du VEGFR1 et VEGFR2.

La galectine-3 seule induit une phosphorylation statistiquement significative d’ERK1/2 (augmentation moyenne de 101% par rapport au contrôle ; p=0.002) et de Hsp27 (augmentation moyenne de 40% par rapport au contrôle ; p=0.007). L’addition de vatalanib inhibe cette phosphorylation, démontrant que cette activation d’ERK1/2 et de Hsp27 est médiée par l’activation des VEGFRs (Figure 50).

La combinaison des galectines-1 et -3 présente un effet additif sur la phosphorylation d’ERK1/2 (augmentation moyenne de 142% par rapport au contrôle ; p=0.00002) et de Hsp27

(augmentation moyenne de 56% par rapport au contrôle ; p=0.00001). Cet effet est inhibé par l’addition de vatalanib (Figure 50).

En conclusion, la réponse des CE aux galectines-1 et -3 est différente selon la lignée cellulaire.

La galectine-1 extracellulaire dans notre modèle de cellules endothéliales normales (cellules HUVEC) augmente la croissance cellulaire ainsi que la formation de tubes sans mise en évidence de phosphorylation significative de VEGFR1 et de VEGFR2. Dans notre modèle de TAECs (cellules EA.hy926), la galectine-1 extracellulaire ne favorise pas la croissance cellulaire et est faiblement angiogénique via l’activation du VEGFR2. En ce qui concerne la galectine-3, nous avons observé dans nos deux modèles des résultats similaires, à savoir une absence d’effet sur la croissance cellulaire et un effet positif sur la formation de tubes s’accompagnant d’une phosphorylation de VEGFR2. Les effets angiogéniques de la galectine-1 et de la galectine-3 s’accompagnent donc d’une activation de VEGFR2 sans activation de VEGFR1.

Le résultat le plus original de cette troisième étude consiste en la mise en évidence d’un effet synergique de la galectine-1 et de la galectine-3 sur la croissance et la formation de tubes des cellules EA.hy926, alors qu’il n’est qu’additif pour les cellules HUVEC. L’activation du VEGFR1, en plus de l’activation du VEGFR2, pourrait expliquer l’effet synergique que nous avons observé pour les cellules EA.hy926 lors de l’ajout de la combinaison des deux galectines. Les voies de signalisation activées en aval des récepteurs au VEGF suite à l’ajout de ces galectines impliquent la voie de ERK1/2 et de Hsp27.

Ces données soulignent également, de par les réponses différentes observées pour les cellules HUVEC et EA.hy926, l’intérêt d’utiliser des modèles de cellules endothéliales plus proches d’un contexte tumoral comme la lignée EA.hy926.