L’étude de l’expression protéique de la galectine-1 et la galectine-3 sur du tissu humain nous a permis de nous rendre compte que ces protéines, considérées comme ubiquitaires, présentent des profils d’expression différents, dépendant du tissu hôte. A partir de notre série de lymphomes systémiques et de lymphomes primitfs du système nerveux central (LPSNC), nous avons observé que l’expression endothéliale de ces galectines est variable selon le tissu hôte tandis que leur expression par les cellules lymphomateuses est similaire quelle que soit la localisation.
Galectines et cellules lymphomateuses
En ce qui concerne la galectine-1 et les LNH, les études publiées portent seulement sur deux sous-groupes de lymphomes: les DLBCL et les LA (Juszczynski et coll. 2007; Rodig et coll. 2008; Rust et coll. 2005).
Pour les DLBCL, une expression de galectine-1 par les cellules lymphomateuses n’est observée que pour 0 à 7% des cas analysés. Dans notre série de lymphomes systémiques, 3 cas de DLBCL sur 16 (19%) présentaient une positivité faible et focale pour la galectine-1 au sein des cellules lymphomateuses. Rodig et coll. considèrent un cas comme positif si l’intensité de marquage est modérée ou forte dans plus de 50% des cellules lymphomateuses. En appliquant ces critères, aucun cas de notre série de DLBCL systémiques n’est considéré comme positif pour la galectine-1. Nos résultats concordent donc avec les données de ces deux études (Juszczynski et coll. 2007; Rodig et coll. 2008).
Pour les LA, les données publiées sont contradictoires quant aux cellules exprimant la galectine-1. Pour Rodig et coll., 95% des LA sont caractérisés par une expression de galectine-1 par les cellules lymphomateuses tandis que pour Rust et coll., les LA sont caractérisés par une expression de galectine-1 par les cellules stromales sans expression par les cellules lymphomateuses (Rodig et coll. 2008; Rust et coll. 2005). Notre série ne comportait qu’un seul cas de lymphome anaplasique qui se caractérise par une positivité faible et focale de la galectine-1 au sein des cellules lymphomateuses et une positivité marquée des cellules stromales, y compris les CE. Une étude pour évaluer l’expression de la galectine-1 sur une large série de LA est donc nécessaire afin d’éclaircir le rôle potentiel de la galectine-1 dans ce sous-groupe de lymphome.
Alors que l’expression de galectine-1 au sein des cellules lymphomateuses des LNH est anecdotique, nous avons observé une expression marquée et diffuse de galectine-3 par les cellules lymphomateuses de 50% des DLBCL de localisation systémique et de 17% des LPSNC. Ces résultats observés par des méthodes immunohistochimiques et confirmés par RT-PCR quantitative concordent avec les données de la littérature en ce qui concerne les DLBCL systémiques (Andreasson et coll. 2009; Hoyer et coll. 2004; Kim, Lee et coll. 2008; Konstantinov et coll. 1996). Shipp et coll. ont également publié que les taux d’ARNm de la galectine-3 sont parmi les gènes les plus discriminants entre les DLBCL et les LF (Shipp et coll. 2002). Toutefois, dans notre étude, nous avons observé un cas de LF exprimant diffusément la galectine-3.
Les DLBCL sont considérés comme un sous-groupe hétérogène rassemblant des lymphomes aux caractéristiques biologiques et moléculaires différentes mais à l’aspect histologique similaire. Ces différences moléculaires ont été soulignées par Alizadeh et coll. qui, par une étude de profil d’expression de gènes, ont identifié au sein des DLBCL deux sous-groupes : le groupe GC (germinal centre) et le groupe ABC (activated B-cell). Les patients atteints d’un DLBCL de type GC présentent une meilleure survie (survie à 5 ans de 76 % vs 16% pour les types GC et ABC respectivement) (Alizadeh et coll. 2000). Il serait intéressant d’investiguer si l’expression de galectine-3 est liée à l’un de ces sous-groupes moléculaires et d’étudier son rôle diagnostique.
L’un des points originaux de ce travail est l’expression de galectine-3 par certains LPSNC. De prime abord, il peut paraître étonnant que les LPSNC, entité au comportement biologique et clinique particulier, présentent le même profil d’expression des galectines que les DLBCL systémiques. Cependant, différentes études ont démontré que les DLBCL systémiques et les LPSNC présentent des caractéristiques moléculaires similaires (Sierra del Rio et coll. 2009) au point que Montesinos-Rongen et coll. montrent que ces deux entités ne peuvent être différenciées sur base de leur transcriptome (Montesinos-Rongen et coll. 2008). Malgré la mise en évidence d’une expression de galectine-3 dans certains DLBCL et dans certains LPSNC, nous n’avons pas pu établir de relation clinique ou pronostique. Au sein des DLBCL systémiques, nous n’avons pas observé que l’expression de galectine-3 est un facteur de mauvais pronostic, comme l’ont mis en évidence Kim et coll. dans une étude ultérieure portant sur 39 cas (Kim, Lee et coll. 2008). Cette discordance peut être dûe au faible nombre de cas de DLBCL dans notre série (16 cas).
Plusieurs études réalisées sur des lignées lymphomateuses mettent en évidence un rôle protecteur de la galectine-3 contre l’apoptose (Hoyer et coll. 2004; Yang et coll. 1996).
L’acquisition par les cellules lymphomateuses d’une résistance à l’apoptose est une étape fondamentale dans le développement des lymphomes. Alors que pour certains sous-groupes histologiques, les voies métaboliques apoptotiques impliquées dans la lymphomagenèse sont de mieux en mieux comprises, la lymphomagenèse des DLBCL est très peu connue. La galectine-3, par son effet anti-apoptotique, pourrait donc être la voie de résistance à l’apoptose des DLBCL. De plus, le déséquilibre des processus apoptotiques est également impliqué dans les mécanismes de résistance aux agents chimiothérapeutiques (Pommier et coll. 2004); dans différentes lignées cellulaires de cancers solides, l’expression cytosolique de galectine-3 inhibe l’apoptose induite par différents agents chimiothérapeutiques (Fukumori et coll. 2007). Il serait donc intéressant d’étudier l’implication de l’expression de galectine-3 dans les mécanismes de résistance à la chimiothérapie des DLBCL.
En ce qui concerne les LH, nous avons mis en évidence une expression de galectine-1 par les cellules de Reed-Sternberg dans 4/14 cas (29%) et de galectine-3 dans 2/14 cas (14%). Deux équipes se sont également intéressées à l’expression de galectine-1 dans les LH et ont confirmé l’expression de galectine-1 par les cellules de Reed-Sternberg (62 à 100% des cas) (Gandhi et coll. 2007; Juszczynski et coll. 2007; Rodig et coll. 2008). Il faut toutefois souligner que ces équipes ont utilisé un anticorps polyclonal alors que nous avons privilégié l’utilisation d’un anticorps monoclonal ; ceci peut expliquer que nous observons un plus faible pourcentage de cas caracctérisés par une expression de galectine-1 par les cellules de Reed-Sternberg.
Cette expression de galectine-1 par les cellules de Reed-Sternberg a été proposée comme un des mécanismes d’échappement à la réponse immunitaire anti-tumorale puisque cette expression est associée à une diminution de l’infiltrat lymphocytaire T CD8+ (Gandhi et coll. 2007). De plus, in vitro (coculture), l’inhibition d’expression de galectine-1 des cellules de Reed-Sternberg par des techniques d’ARN interférence entraine une augmentation de la viabilité des lymphocytes T de type Th1 (Juszczynski et coll. 2007).
A l’opposé de l’expression focale des galectines-1 et -3 par les cellules de Reed-Sternberg, nous avons observé que les LH de forme sclérose nodulaire se caractérisent par une expression de galectine-1 et de galectine-3 au sein des fibroblastes. Ces observations sont à mettre en relation avec différentes études qui démontrent le rôle de la galectine-1 et de la galectine-3 dans les phénomènes de fibrose intervenant dans différentes pathologies (Henderson et coll. 2006; Maeda et coll. 2003; Wang et coll. 2000). Il serait donc intéressant
d’étudier le rôle potentiel des galectines-1 et -3 dans les mécanismes de fibrose observés dans les LH de forme sclérose nodulaire.
Galectines et cellules endothéliales
Les résultats les plus intéressants des deux premières études portent sur l’expression des galectines-1 et -3 par les CE. Si l’expression de galectine-1 et de galectine-3 par les cellules lymphomateuses présentent un profil similaire indépendant de la localisation tumorale, il n’en est pas de même pour les CE. Nous avons observé une différence d’expression endothéliale de galectine-1 et -3 entre les tissus lymphoïdes normaux et les lymphomes systémiques d’une part et entre les lymphomes systémiques et les LPSNC d’autre part. En effet, tandis que les CE des vaisseaux des ganglions lymphatiques normaux présentent un profil d’expression galectine-1 négatif, galectine-3 positif, les CE des vaisseaux de certains lymphomes systémiques sont caractérisées par une expression de galectine-1. Au contraire, les CE de certains LPSNC sont caractérisées par une expression diffuse et marquée de galectine-3 sans expression de galectine-1. En ce qui concerne les tissus normaux, l’expression endothéliale des galectines-1 et -3 au sein du SNC a été peu étudiée et nous n’avons trouvé que l’étude de Bresalier et coll. qui mentionne une expression endothéliale focale de galectine-3 au sein du SNC normal (Bresalier et coll. 1997). Une expression endothéliale de galectine-1 au sein des LH a été également mentionnée par ailleurs (Gandhi et coll. 2007; Rodig et coll. 2008). Nous proposons donc la galectine-1 et la galectine-3 comme biomarqueurs des CE associées aux lymphomes, en soulignant toutefois la nécessité de tenir compte de la localisation tumorale. Ces données complètent celles de la littérature qui proposent la galectine-1 comme biomarqueur des TAECs des carcinomes prostatiques, coliques et oraux (Clausse et coll. 1999; Hsieh et coll. 2008; Thijssen et coll. 2006) et la galectine-3 comme biomarqueur des hépatocarcinomes (Jia et coll. 2010).
Tandis que l’expression de galectine-3 par les cellules lymphomateuses n’a pas d’impact pronostique, l’expression endothéliale de galectine-3 est un facteur de mauvais pronostic dans les LPSNC. Ces travaux soulignent l’importance, dans l’évaluation de nouveaux biomarqueurs pronostiques ou théranostiques, de préciser les types cellulaires exprimant ces cibles. A cette fin, les techniques d’immunohistochimie offrent, par rapport aux autres techniques d’évaluation telle que la PCR ou le Western Blot, le contrôle morphologique indispensable.
Alors que l’expression endothéliale de galectine-3 est un facteur de mauvais pronostic pour les LPSNC, un tel impact n’a pas été observé pour l’expression endothéliale de galectine-1 par les vaisseaux des lymphomes systémiques. Ceci peut être lié, d’une part, à la difficulté de récolter un suivi clinique pour tous les patients (établi pour 37 cas/56) et, d’autre part, à l’impossibilité de calculer le score IPI (décrit dans le chapitre Introduction point 1.1.4.2), considéré actuellement comme le score pronostique le plus utilisé en pratique clinique. De plus, il s’agit d’une série rétrospective dont les cas les plus anciens remontent à 1995, époque où les tests de biologie moléculaire n’avaient pas encore été intégrés aux classifications anatomopathologiques. En effet, la première classification des lymphomes intégrant certains critères moléculaires (classification REAL) a été publiée en 1994 et a été validée en 1997. La publication de la première édition de la classification des tumeurs hématopoïétiques et des tissus lymphoïdes de l’OMS intégrant les critères cliniques, morphologiques, immunophénotypiques et moléculaires, date de 2001. Elle est considérée par les experts en pathologie lymphomateuse comme étant le début d’une nouvelle ère dans la prise en charge des patients atteints de lymphome (Jaffe et coll. 2008). Chaque cas de notre série a été revu et classé selon cette classification de l’OMS (2001, première édition) (Jaffe et Harris 2001) sur base des examens morphologiques et immunohistochimiques. Les tests de biologie moléculaire (caryotype, PCR) à la recherche des anomalies génétiques spécifiques de certains sous-groupes de lymphomes n’ont été réalisés que pour une minorité de patients de notre série. Avant d’affirmer que la galectine-1 endothéliale n’est pas un facteur pronostique, il faudrait réaliser une étude prospective dans laquelle seront intégrés non seulement les critères morphologiques et immunohistochimiques mais aussi les tests de biologie moléculaire ainsi que les scores cliniques pronostiques.
Nous sommes conscients du fait que l’expression endothéliale d’une protéine ne limite pas le rôle de cette protéine à l’angiogenèse. L’expression endothéliale de galectine-1 et de galectine-3 dans les lymphomes systémiques et cérébraux suggère également une implication de ces galectines dans l’échappement des cellules lymphomateuses à l’immunosurveillance. En effet, des études in vitro et in vivo (modèles d’inflammation) ont montré que les cellules endothéliales exprimant la galectine-1 peuvent induire l’apoptose des lymphocytes T ou diminuer leur migration transendothéliale, entrainant une réponse immunitaire tissulaire diminuée (He et Baum 2006; Norling et coll. 2008; Perillo et coll. 1995.). Cependant, dans des modèles murins tumoraux implantés chez des souris sauvages ou KO pour la galectine-1, l’infiltrat lymphocytaire est similaire alors que la DMV tumorale est diminuée chez les souris
KO. Ces résultats suggèrent un rôle angiogénique de la galectine-1 sans implication de la réponse immune anti-tumorale (Thijssen et coll. 2010; Thijssen et coll. 2006). Le rôle de la galectine-3 dans l’échappement à la réponse immunitaire anti-tumorale est moins bien décrit. A l’inverse de la galectine-1, la galectine-3 est considérée comme pro-inflammatoire. Cependant, elle régule également la réponse lymphocytaire T, induit l’apoptose des lymphocytes T et inhibe la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes, et de ce fait, présente également une action dans l’échappement à la réponse immune anti-tumorale (Klyosov et coll. 2008; Liu et Rabinovich 2005). Contrairement à la galectine-1, le rôle de l’expression endothéliale de galectine-3 dans la régulation de la réponse immunitaire n’a pas encore été décrit.
Les résultats des deux premières études de ce travail soulignent l’importance du tissu hôte dans l’expression endothéliale des galectines. Ces différences d’expression endothéliale de galectine-1 et de galectine-3 selon la localisation tumorale soulignent la diversité des CE. Comme mentionné dans l’introduction (point 3.1.1.1), les CE présentent des caractéristiques particulières selon l’organe qu’elles vascularisent. De plus, le développement d’un cancer induit des modifications majeures du phénotype et de la biologie des CE.
Dans ce travail, nous avons effectivement observé la présence d’HEC dans le contexte des LPSNC et nous avons démontré que l’HEC est un facteur de mauvais pronostic dans les LPSNC.
Les modifications induites par l’environnement tumoral s’observent également par les différences dans le profil d’expression des récepteurs au VEGF comparativement au tissu normal. Nous avons observé que les TAECs in vivo sont caractérisées par une augmentation d’expression de VEGFR1 et une diminution d’expression de VEGFR2. Ce travail réalisé à partir de carcinomes humains pulmonaires, thyroïdiens, gastriques, coliques et rénaux complète les données de la littérature démontrant ces variations d’expression de VEGFR1 et de VEGFR2 pour les carcinomes « tête et cou » (Zhang, Neiva et coll. 2010). Cette régulation inverse de l’expression de VEGFR1 et de VEGFR2 a également été observée in vitro dans des conditions d’hypoxie et de stimulation par le VEGF, conditions mimant un envirronnement tumoral et s’accompagnant d’une surexpression endothéliale de VEGFR1 et une sous-expression de VEGFR2 (Imoukhuede et coll. 2011, Ulyatt et coll. 2011). Ces différences d’expression endothéliale des VEGFRs doivent être validées sur une plus grande série de tumeurs humaines dans le but de mieux comprendre la régulation de l’expression des
VEGFRs. Ces données sont primordiales pour le développement de thérapies ciblées agissant contre ces récepteurs. En effet, la diminution d’expression endothéliale de VEGFR2 observée dans les cancers pourrait expliquer un effet thérapeutique inférieur à celui attendu lors de traitements anti-angiogéniques ciblant le système VEGF/VEGFR2.
Malgré qu’il soit largement accepté que les TAECs sont différentes des CE normales, la plupart des études d’angiogenèse in vitro sont réalisées à l’aide de cellules HUVEC que l’on peut considérer comme des CE normales. La revue de la littérature et la caractérisation de la lignée EA.hy926 nous permettent de proposer cette lignée comme modèle in vitro de TAECs. Cette lignée est un hybridome entre la lignée HUVEC et la lignée de cancer pulmonaire A549 (Edgell et coll. 1983). Or, les CE et les cellules tumorales peuvent fusionner et ce mécanisme a été proposé pour expliquer que les CE associées aux lymphomes présentent les mêmes anomalies cytogénétiques que les cellules lymphomateuses (Mortensen et coll. 2004; Streubel et coll. 2004).
La comparaison des profils d’expression des gènes des cellules HUVEC et EA.hy926 nous a permis de mettre en évidence que différents gènes surexprimés dans les TAECs le sont également dans les cellules EA.hy926. De plus, les tubes formés lorsque ces cellules sont cultivées sur matrigel présentent également un aspect différent; les tubes formés par les cellules EA.hy926 sont plus hétérogènes comme ce que l’on peut observer dans les vaisseaux tumoraux. Enfin, ces cellules présentent un profil d’expression des récepteurs au VEGF similaire à celui des TAECs (plus hautes expressions de VEGFR1 et plus basses expressions de VEGFR2).
Nous n’avons pas observé de variation de l’expression des galectines-1 et -3 entre ces deux lignées. Or, comme discuté ci-dessus, différentes publications et les résultats de nos deux premières études soulignent une différence d’expression de galectine-1 ou de galectine-3 entre les CE normales et les TAECs in vivo. L’aspect positif de l’absence de variation d’expression de galectine-1 et de galectine-3 entre les lignées HUVEC et EA.hy926 est la possibilité d’étudier l’effet des galectines extracellulaires sans être biaisé par des différences d’expression endogène de ces deux galectines.
Une limitation doit cependant être soulignée concernant ces deux modèles. La comparaison de ces deux lignées doit être réalisée avec prudence puisque celles-ci sont cultivées de manière différente. Les facteurs de croissance présents dans les milieux de culture sont donc probablement différents. Une approche intéressante serait de cultiver la lignée EA.hy926 dans les mêmes conditions que la lignée HUVEC. Il serait également intéressant d’investiguer les
différences entre les lignées HUVEC et EA.hy926, cultivées dans les mêmes conditions, en ce qui concerne leur perméabilité, leur capacité de migration et de dégradation de la membrane
basale et leur organisation en trois dimensions de manière à préciser les deux modèles. Ces modifications phénotypiques et biologiques des CE induites par le contexte tumoral
peuvent être le reflet des différents mécanismes d’angiogenèse. Comme mentionné dans l’introduction (point 3.1.2.2), les mécanismes de vascularisation tumorale varient selon le type, la localisation et le grade tumoral. Ceci peut expliquer le fait que les bénéfices cliniques sont variables lors des traitements anti-angiogéniques. D’une part, certaines tumeurs ne répondent pas aux traitements anti-angiogéniques et, d’autre part, certaines tumeurs développent une résistance après une réponse initiale. Comme détaillé dans l’Introduction (point 3.5.2), différents mécanismes ont été proposés pour expliquer les phénomènes de résistance dont l’activation ou la surexpression de voies de signalisation angiogéniques alternatives (Bergers et Hanahan 2008; Ebos et coll. 2009; Feron 2004). La revue de la littérature (Introduction point 3.3) fait apparaître les galectines-1 et -3 comme des molécules angiogéniques.
Les résultats de ce travail suggèrent un rôle angiogénique de la galectine-1 dans les lymphomes systémiques et de la galectine-3 dans les LPSNC.
Notre hypothèse d’un rôle angiogénique de la galectine-1 a été renforcée par le fait que cette expression endothéliale de galectine-1 est corrélée à une DMV élevée. Toutefois, nous sommes conscients des limitations de l’évaluation de la DMV comme reflet de l’angiogenèse. De nombreuses controverses sont rapportées à ce sujet dans la littérature (Nico et coll. 2008; Sharma et coll. 2005; Vermeulen et coll. 2002). L’évaluation de la DMV présente de larges variations méthodologiques selon les études (Vermeulen et coll. 2002). Ces différences méthodologiques incluent, entre autre, l’anticorps utilisé pour la détection des vaisseaux et la méthode de comptage. Trois anticorps sont généralement utilisés comme marqueurs endothéliaux : le facteur VIII-related antigen, le CD31 et le CD34. Bien que ces marqueurs soient considérés comme des marqueurs panendothéliaux, aucun n’est totalement spécifique des CE. En effet, le facteur VIII-related antigen est aussi exprimé par les plaquettes, le CD31 par les plasmocytes et le CD34 par les cellules stromales périvasculaires. L’utilisation de marqueurs panendothéliaux évalue aussi bien les vaisseaux préexistants que les vaisseaux néoformés. L’utilisation de biomarqueurs plus spécifiques des CE impliquées dans les phénomènes d’angiogenèse tel que le CD105 a été proposée pour différencier les vaisseaux néoformés (Nico et coll. 2008; Vermeulen et coll. 2002). Différentes méthodes de comptage manuel des vaisseaux ont été développées (en fonction de hots spots ou d’une lumière
vasculaire). Le comptage manuel de la DMV est sujet à beaucoup de subjectivité. Nous avons donc privilégié une analyse quantitative assistée par ordinateur afin de limiter cette subjectivité. Comme décrit dans l’Introduction (point 3.1.2.2), toutes les tumeurs ne dépendent pas de l’angiogenèse par bourgeonnement pour établir leur vascularisation. D’autres variables morphologiques (distance intercapillaire) et biologiques (expression de facteurs angiogéniques) ont également été proposées comme moyen d’évaluation de l’angiogenèse et doivent être validées par des études prospectives (Nico et coll. 2008). Malgré