UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Pharmacie
IMPLICATION DES RECEPTEURS SIGMA ET DE LEURS LIGANDS DANS
LA BIOLOGIE DES CANCERS
Véronique Megalizzi
Laboratoire de Toxicologie
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
Année Académique 2010-2011
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Pharmacie
IMPLICATION DES RECEPTEURS SIGMA ET DE LEURS LIGANDS DANS
LA BIOLOGIE DES CANCERS
Véronique Megalizzi
Laboratoire de Toxicologie
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
Composition du Jury:
Prof. Jean-Paul Dehaye
Prof. Jean-Michel Kauffmann (Président)
Prof. Véronique Fontaine
Prof. Christine Decaestecker (Promoteur)
Prof. Marc Van Damme (co-Promoteur)
Prof. Tangui Maurice Prof. Isabelle Salmon
Année Académique 2010-2011
Remerciements
Ce travail de recherche et sa rédaction ont été un vrai plaisir en soi, les péripéties qui les ont entourés ont été moins gaies, mais néanmoins formatrices.
Je ne saurais que trop témoigner de ma « reconnaissance », mot qui dans ce contexte prend toute la plénitude de son sens, à mon promoteur le Professeur Christine Decaestecker : formateur et fil d’Ariane, Merci.
Toute ma gratitude va a mon chef de service et co-promoteur le Professeur Marc Van Damme, pour m’avoir offert en tant que personnel PATGs cette possibilité, donné cette chance de concrétiser mes travaux de recherche dans la réalisation de ce travail de thèse.
Je remercie tout particulièrement le Professeur Olivier Debeir, sans l’expertise, la réalisation d’outils, « la patience » et la gentillesse duquel, la majeure partie de ces travaux n’aurait pû être réalisée.
Je remercie aussi Marie le Mercier, Aminata Nacoulma, Benjamin Le Calvé, Sandrine Rorive, Sebastien Sauvage, Elhadj Baldé, Ivan Adanja pour leurs amicaux échanges et discussions scientifiques.
Mais aussi mes collègues actuels et passés des services de toxicologie et de bioanalytique, toxicologie et chimie physique appliquée, pour leurs amitié et encouragements.
Je remercie ici tous les académiques de la faculté de pharmacie qui m’ont soutenue pendant ce travail.
Merci également à mes collègues PATGs pour leur soutien.
Merci enfin à toute ma famille, pour ce qu’elle « est ».
Table des matières
ABREVIATIONS ... 6
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ... 10
1. CONTEXTE GENERAL ET MOTIVATIONS DU TRAVAIL ... 10
2. LES GLIOMES ... 11
2.1. CLASSIFICATIONHISTOPATHOLOGIQUEETPRONOSTIC ... 11
2.2. TUMORIGENESEETRECIDIVEDESTUMEURSGLIALES ... 13
2.3. TRAITEMENT ... 14
2.3.1. La chirurgie ... 14
2.3.2. Radiothérapie et chimiothérapie ... 14
2.3.3. Les thérapies ciblées ou « targeted therapy » ... 15
2.3.3.1. Facteurs de croissance et leurs récepteurs ... 16
2.3.3.2. Anti-angiogenèse ... 16
2.3.3.3. Anti-métalloprotéinases ... 17
3. LA BIOLOGIE DES GLIOMES ... 17
3.1. ALTÉRATIONSMOLÉCULAIRESAUSEINDESTUMEURSGLIALES ... 17
3.2. LESDIFFERENTSTYPESDEMORTCELLULAIRE ... 20
3.2.1. L'apoptose ... 20
3.2.2. L’autophagie... 21
3.3. LESTRESSCELLULAIRE ... 23
3.3.1. Activation des mécanismes de réparation ou d'adaptation en réponse au stress cellulaire ... 23
3.3.2. Le stress du réticulum endoplasmique ... 24
3.4. LAMIGRATIONDESCELLULESGLIALESTUMORALES... 25
3.4.1. Description générale du processus migratoire ... 25
3.4.2. Le cytosquelette d’actine ... 27
3.5. AGRESSIVITEETCHIMIORESISTANCEDESGLIOBLASTOMES ... 28
3.5.1. Implication du glutamate et du glucose ... 28
3.5.2. Rôle de la MGMT ... 29
3.5.3. Rôle des pompes à efflux ... 30
3.5.4. Résistance des cellules migrantes à l’apoptose ... 30
3.5.5. Le stress du RE ... 31
4. LES RECEPTEURS SIGMA ET LEURS LIGANDS ... 32
4.1. LESRS-SIGMA,LEURSFONCTIONSPRINCIPALES,LEURSNIVEAUXD’EXPRESSIONETLOCALISATIONS PREFERENTIELLES ... 32
4.1.1. Le R-sigma1 ... 34
4.1.2. Le R-sigma2 ... 35
4.2. LESRS-SIGMADANSLESYSTEMENERVEUXCENTRAL ... 36
4.2.1. Implication des Rs-sigma dans l'apprentissage et la mémoire... 36
4.2.2. Implication des Rs-sigma dans les maladies psychotiques ... 37
4.2.3. Implication des Rs-sigma dans l’accoutumance aux drogues ... 38
4.3. LESRS-SIGMAETLESCANCERS ... 38
4.3.1. Expression des Rs-sigma dans les cellules et tissus cancéreux ... 38
4.3.2. Utilisation potentielle des ligands aux Rs-sigma dans le diagnostic et la thérapie du cancer ... 40
4.3.2.1. Dans l’imagerie tumorale ... 40
4.3.2.2. Pour la délivrance ciblée de médicaments ... 40
4.3.2.3. Pour leur potentiel thérapeutique ... 41
4.3.3. Les voies de signalisation potentielles de transduction du signal des Rs-sigma ... 43
4.3.3.1. Modulation de protéines du cytosquelette ... 43
4.3.3.2. Modulation du Ca2+ intracellulaire ... 43
4.3.3.3. Modulation des composants majeurs de la membrane plasmique et des radeaux lipidiques ... 44
4.4. LESLIGANDSEXOGENESDUR-SIGMA1ETUDIESDANSLEPRESENTTRAVAIL ... 45
CHAPITRE 2 : OBJECTIF DU TRAVAIL ... 48
CHAPITRE 3 : MATERIEL ET METHODES ... 49
1. LES MODELES EXPERIMENTAUX IN VITRO ... 49
2. ORIGINE DES MEDICAMENTS ET LIGANDS UTILISES ... 49
3. MISE EN EVIDENCE DE L’EXPRESSION DU R-SIGMA1 DANS LES DIFFERENTS MODELES ... 50
3.1. PARRT-PCR... 50
3.2. PARWESTERNBLOTTING ... 51
3.3. PARIMMUNOFLUORESCENCE ... 53
3.4. PARIMMUNOHISTOCHIMIESUR« TISSUEMICROARRAY »(TMA) ... 53
4. MISE EN EVIDENCE DES EFFETS DES LIGANDS DU R-SIGMA1 IN VITRO ... 54
4.1. PREPARATIONDESSOLUTIONSSTOCKSDELIGANDS ... 55
4.2. EVALUATIONDELAVIABILITEETDUTAUXDECROISSANCECELLULAIREGLOBAL ... 55
4.2.1. Test colorimétrique MTT ... 55
4.2.2. Test de vidéomicroscopie ... 56
4.3. CARACTÉRISATIONDUPROCESSUSDEDIVISIONCELLULAIRE ... 57
4.4. CARACTERISATIONDUPROCESSUSDERECOLONISATIONCELLULAIRE(TESTDELACICATRICE) ... 58
4.5. CARACTERISATIONDUPROCESSUSDEMOTILITECELLULAIRE ... 59
4.6. ANALYSEDEL’ORGANISATIONDUCYTOSQUELETTED’ACTINEPARFLUORESCENCE ... 59
4.7. ANALYSEDELACONCENTRATIONINTRACELLULAIREDECALCIUMPARSPECTROFLUORIMETRIE ... 60 4.8. ANALYSEDESPROTÉINESIMPLIQUÉESDANSLESPROCESSUSDECHIMIORESISTANCEDESCELLULES
MIGRANTES ... 61
4.8.1. Par test Elisa ... 61
4.8.2. Par Western blotting ... 62
4.9. MISEENEVIDENCEDEPROCESSUSMOLECULAIRES... 62
4.9.1. Processus de mort cellulaire par cytométrie de flux ... 62
4.9.1.1. Détermination du réarrangement de glycolipides membranaires impliqués dans le processus d’apoptose ... 62
4.9.1.2. Analyse des vésicules acides cytoplasmiques impliquées dans le processus d’autophagie ... 63
4.9.2. Analyse du taux d’expression de diverses protéines impliquées dans l’autophagie par western blotting ... 63
4.9.3. Identification de cibles moléculaires ... 64
4.9.3.1. Par western blotting ... 64
4.9.3.2. Par immunofluorescence ... 64
5. MISE EN EVIDENCE DES EFFETS DES LIGANDS DU R-SIGMA1 IN VIVO ... 65
5.1. CARACTÉRISTIQUESDUMODÈLEU373ETRÉALISATIONDESTESTSINVIVO ... 65
5.2. CARACTÉRISTIQUESDUMODÈLEHS683ETRÉALISATIONDESTESTSINVIVO ... 66
5.3. DESCRIPTIONDUMODÈLEHUMAINDECARCINOMEPULMONAIREA549ETRÉALISATIONDESTESTS INVIVO ... 67
6. ANALYSES STATISTIQUES ... 67
6.1. TESTSNON-PARAMETRIQUES ... 67
6.2. L’ANALYSEDESURVIE ... 68
CHAPITRE 4 : RESULTATS ... 69
1. EXPRESSION DU R-SIGMA1 DANS LES GLIOMES DE HAUT-GRADE ... 69
1.1. AUNIVEAUDESARNM ... 69
1.2. AUNIVEAUPROTEIQUE ... 70
2. EFFETS IN VITRO DE 12 LIGANDS DES RS-SIGMA SUR LA VIABILITE DE CELLULES DE GLIOMES HUMAINS .. ... 71
3. ETUDES DES EFFETS ANTI-TUMORAUX DU 4-IBP À 10µM IN VITRO ... 72
3.1. INHIBITIONDELACROISSANCECELLULAIRE ... 72
3.2. INHIBITIONDELADIVISIONCELLULAIRE ... 72
3.3. INHIBITIONDELARECOLONISATIONCELLULAIRE ... 73
4. ETUDES DES EFFETS ANTI-TUMORAUX IN VITRO DE DIVERS LIGANDS DU R-SIGMA1 À DES CONCENTRATIONS PROCHES DE L’IC50 ... 74
4.1. EFFETSSURLEPROCESSUSDERECOLONISATION ... 74
4.2. EFFETSSURLAPROLIFERATION ... 80
5. CARACTERISATION DES EFFETS DU 4-IBP SUR LA MOTILITE CELLULAIRE IN VITRO A DES CONCENTRATIONS INFERIEURES A L’IC10 ... 80
5.1. INHIBITIONDELAMOTILITECELLULAIREETRIGIDIFICATIONDUCYTOSQUELETTED’ACTINE ... 80
5.2. ABSENCED’EFFETSURLACONCENTRATIONDECALCIUMINTRACELLULAIRE ... 81
6. CARACTERISATION DES EFFETS DU 4-IBP SUR LA SENSIBILITE A LA CHIMIOTHERAPIE ... 82
6.1. POTENTIALISATIONDESEFFETSCHIMIOTHERAPEUTIQUESINVITRO ... 82
6.2. ABSENCED’EFFETINVITROSURLAVOIEPI3K/AKT ETL’APOPTOSE ... 82
6.3. POTENTIALISATIONDESEFFETSCHIMIOTHERAPEUTIQUESINVIVO... 83
7. CARACTERISATION DES EFFETS DU DONEPEZIL SUR LA SENSIBILITE A LA CHIMIOTHERAPIE... 83
8. ETUDES DES EFFETS IN VITRO DU 4-IBP SUR DIVERS PROCESSUS MOLECULAIRES ... 84
8.1. EFFETSPRO-APOPTOTIQUESDU4-IBP A 10 µM ... 84
8.2. EFFETSPRO-AUTOPHAGIQUESDU4-IBP ... 84
8.3. EFFETSDU4-IBPSURDESPROTEINESDESTRESSCELLULAIRE ... 85
8.4. IDENTIFICATIONDERHO-GDIETGCS COMMECIBLESDU4-IBP... 86
CHAPITRE 5 : DISCUSSION ... 88
1. EXPRESSION DU R-SIGMA1 ET REPONSE CELLULAIRE AUX LIGANDS ... 88
2. EFFETS ANTI-PROLIFERATIF ET INDUCTEUR DE MORT ... 90
3. EFFETS ANTI-MIGRATOIRE ET DE CHIMIOSENSIBILISATION ... 92
4. IMPLICATION DU STRESS DU RE DANS LA CHIMIORESISTANCE DES GLIOBLASTOMES ET LEUR CHIMIOSENSIBILISATION PAR LES LIGANDS DU R-SIGMA1 ... 93
5. LES LIGANDS DU R-SIGMA1, DES MEDICAMENTS A REPROFILER ... 94
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 96
BIBLIOGRAPHIE ... 98
ANNEXES ... 117
ABREVIATIONS
4-IBP : N-(N-Benzylpiperidin-4-yl)-4-iodobenzamide 5HT : neurotransmetteur de la sérotonine
ABC : ATP binding cassette transporter ADN : acide desoxyribonucléique Akt : serin/threonin kinase B protein AIC : 5-aminoimidazole-4-carboxamide AIF : apoptosis inducing factor
AP-1 et AP-2 : protéines activatrices 1 et 2 ARN : acide ribonucléique
ARP2/3 : Actin Related Protein 2/3
ATCC : American Type Culture Collection
ATF4 et ATF6 : activating transcription factor 4 and 6 ATP : adenosine triphosphate
BCNU : bischloroéthyl nitrosourée BCA : Acide bicinchonique
bFGF : basic fibroblast growth factor BMPs : Bone morphogenetic proteins BSA : albumine de veau,
BTSCs : Brain Tumor Stem Cells CAS : Crk-associated substrat
CCNU : chloroéthylcyclohexyl nitrosourée CDK : cyclin-dependent kinases
CDNR : Cell Division Number Ratio CHOP : C/EBP homologous protein CSCs : cellules souches cancéreuses DMSO : dimethyl sufoxide
DMT : N, N-dimethyltryptamine DTG : 1,3-di-o-tolylguanidine
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor ERAD : ER-associated degradation
ERK : extracellular signal-regulated protein kinase
FAK : kinase d’adhésion focale FCS : sérum de veau fœtal
GABA : neurotransmetteur glutamatergique GAPs : GTPase-activating proteins
GATA-1 : globin transcription factor 1 GBM : glioblastome
GCS : Glucosyle ceramide synthase GDIs : Rho GDP-dissociation inhibitors GEFs : guanine-nucleotide-exchange factors GFAP : glial fibrillary acidic protein GGR : global growth ratio
GRP-78 : glucose-regulated proteine 78 (ou BiP) GRP-94 : glucose-regulated proteine 94
GSL : glycosphingolipide
HIF-1hypoxie inductible facteur 1 alpha
HRP : Horse Radish Peroxydase Hsp : heat shock protein
IGFs : Insulin-like Growth Factors
IGFBP2/IGFII : insulin-like growth factor binding protein 2 / insulin-like growth factor II IGFR : Insulin-like Growth Factor Receptor
IL-6RE : interleukin 6 responsive element
IP3R-3 : Inositol 1,4,5-triphosphate Receptor Type 3 IPAG : 1-(4-Iodophenyl)-3-(2-adamantyl)guanidine
IRE1 : inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease IRM : imagerie par résonance magnétique nucléaire
kb : kilo bases kDa : kilo Dalton
Kd : constante de disociation ou d’affinité Ki : constante d’ionisation
LMP : lysosomal membrane permeabilization LTP : long-term potentation
LTD : long-term depression
MAM : mitochondrion-associated ER membrane
MAP-LC3 : microtubule-associated protein 1 light chain 3
MAPK : mitogen-activated protein kinase
MCT2 et MCT4 : monocarboxylate transporters 2 and 4 MDR1 : Multidrug resistance 1
MGMT : O6-methylguanine-DNA methyltransférase MEC : matrice extracellulaire
MEM : minimal essentiel de Eagle MMPs : métalloprotéinases matricielles
MRDO : Maximal Relative Distance to the Origine MT1-MMP : MMP membranaire de type 1
mTOR : Mammalian Target of Rapamycin
MTT : 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-diphényltétrazolium bromide NFB : nuclear factor-B
NMDA : N-methyl-D-aspartate
NMD : nonsense-mediated mRNA decay candidate NPCs : cellules gliales progénitrices
NSCLC : non small cell lung cancer OMS : Organisation Mondiale de la Santé
ORP150: oxygen regulated protein (p150 ou HYOU1) PARP : Poly ADP-Ribose polymérase
PBS : phosphate buffered saline
PCV : procarbazine/lomustine/vincristine
PDGFR : Platelet Derived Growth Factor Receptor PERK : protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase PET : positron emission tomography
PI3K : phosphatidylinositol 3-Kinase
PIP3 : phosphatidyl inositol 3,4,5 triphosphate PKC : protéine kinase C
PTEN : phosphatase and tensin homolog RAS : rat sarcoma protein
RE : réticulum endoplasmique
RhoGDI : Rho guanine dissociation inhibitor ROS : reactive oxygen species
RONS : Reactive oxygen or nitrogen species RPMI 1640 : milieu de Moore
R-sigma1 et R-sigma2 : récepteur sigma 1 et sigma 2
RT-PCR : Reverse transcription polymerisation chain reaction siRNA : petit ARN interférent
SNC : système nerveux central
SPECT : single photon emission computed tomography Src : sarcome tyrosine kinase proteine
SWAR : scratch wound area ratio TCA : tricarboxylic acid cycle
TGF et TGFß transforming growth factor alpha and beta TMZ : temozolomide
TNF : tumor necrosis factor
TNF-R1 : tumor necrosis factor receptor 1 TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand TRB3 : tribbles-related protein 3
TRPC1 : transient receptor potential cation channel 1 TUNEL : Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling UPR : unfolded protein response
UV : ultra violet
VCAM : vascular cell adhesion molecule VEGF : vascular endothelial growth factor WASP : Wiskott-Aldrich Syndrome Protein
Chapitre 1 : INTRODUCTION
1. CONTEXTE GENERAL ET MOTIVATIONS DU TRAVAIL
Les tumeurs cérébrales représentent environ 10% des tumeurs solides de l’adulte, et 30% de celles de l’enfant (Kleihues et Cavenee, 2000 ; Louis et coll. 2007a,b). Bien que les tumeurs cérébrales primaires soient relativement rares (6 à 10 personnes/100000/par an) par rapport aux autres cancers, elles constituent une source importante de mortalité et morbidité (Bondy et coll., 2008). Parmi les tumeurs cérébrales primaires, les gliomes sont les tumeurs les plus fréquemment rencontrées avec une incidence moyenne de 5 cas par 100000 habitants par an.
Les glioblastomes (GBM) représentent 60 à 70% de ces tumeurs et malgré de récents progrès dans leur traitement, leur pronostic reste sombre (Stupp et coll., 2005). Les gliomes malins sont caractérisés par une prolifération cellulaire importante, un taux élevé de néo-angiogenèse et une migration diffuse des cellules tumorales gliales dans le parenchyme cérébral, ce qui rend impossible une résection chirurgicale complète. De plus, les cellules gliales tumorales migrantes opposent une résistance particulière aux traitements chimiothérapiques de type pro- apoptotique, causant une récidive quasi inévitable de ce type de tumeur. La compréhension des aspects moléculaires à la base de la prolifération, de la migration et de la chimiorésitance des cellules gliales tumorales est donc essentielle pour élaborer des approches ciblées capables d’entraver ces processus (Giese et coll., 2003 ; Nakada et coll., 2007).
La littérature mentionne plusieurs stratégies qui permettraient, en théorie, de court-circuiter la résistance à l’apoptose des cellules tumorales gliales migrantes. Il s’agirait entre autres :
de réduire le taux d’activation des voies de signalisation contrôlées par PI3K /Akt /mTOR et NFB, qui diminuerait le taux de croissance des gliomes malins (Joy et coll., 2003), ainsi que le taux de migration des cellules tumorales isolées dans le parenchyme cérébral (Hosoi et coll., 1998 ; Gammeltoft et coll., 1988) ;
de réduire le taux de migration des cellules tumorales gliales afin de restaurer un certain degré de sensibilité à des agents chimiothérapiques pro-apoptotiques (Giese et coll., 2003 ; Shingu et coll., 2003) ;
d’endiguer l’export des agents chimiothérapiques par les pompes à efflux surexprimées dans les gliomes (Bronger et coll, 2005) ;
d'induire d’autres processus de mort cellulaire que l’apoptose, car les cellules tumorales gliales migrantes sont plus sensibles à d’autres formes de mort cellulaire (Liu et coll., 2010).
Ces besoins de nouvelles stratégies thérapeutiques ont motivé ce travail qui se focalisera sur le potentiel antitumoral des ligands du R-sigma1 dans les glioblastomes. Ainsi, nous montrerons que les ligands des Rs-sigma sont capables de produire certains des effets visés dans les stratégies ci-dessus, dont la réduction de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses avec une certaine potentialisation des chimiothérapies. Ces propriétés ouvrent de nouvelles perspectives en thérapie anticancéreuse pour cette famille de ligands, dont plusieurs membres sont déjà utilisés depuis de nombreuses années comme antipsychotiques (Archison et coll., 2007 ; Maurice et coll., 2006 ; Spruce et coll, 2004).
Dans la suite de ce chapitre introductif, nous préciserons différentes notions impliquées dans le présent travail. Nous présenterons ainsi différents aspects cliniques concernant les gliomes (classification, évolution et traitements). Nous détaillerons ensuite des notions propres à la biologie de ces tumeurs qui seront examinées lors de nos travaux (prolifération, mort et migration cellulaire, ainsi que la chimiorésitance). Finalement, nous aborderons le sujet central de notre travail : les Rs-sigma et leurs ligands.
2. LES GLIOMES
2.1. CLASSIFICATION HISTOPATHOLOGIQUE ET PRONOSTIC
Au sein des tumeurs cérébrales primaires, les tumeurs gliales (ou gliomes) sont les plus fréquemment rencontrées (plus de 50% chez l’adulte). Les tumeurs gliales peuvent être subdivisées en tumeurs présentant une différenciation histologique astrocytaire (75% des gliomes), oligodendrogliale (5-6%), oligoastrocytaire (mixte) ou épendymaire (moins de 10%) (Kleihues et Cavenee, 2000 ; Louis et coll., 2007a). Ces sous-groupes incluent des tumeurs de différents niveaux d’agressivité et de malignité classés, d’après l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), en quatre grades de malignité (grade I à IV) dépendant principalement de l’évaluation de cinq caractéristiques : densité cellulaires, atypies cellulaires, mitose, prolifération vasculaire et nécrose. Le Tableau 1 présente le classement des tumeurs gliales d’origine astrocytaire (astrocytomes) ou oligodendrogliale (oligodendrogliomes), plus
particulièrement étudiées dans ce travail.
Les tumeurs astrocytaires de grade I désigne des tumeurs bénignes, non infiltrantes, souvent bien circonscrites et pour lesquelles une simple résection chirurgicale est généralement curative. A l’inverse, les tumeurs astrocytaires de grade II (astrocytomes), III (astrocytomes anaplasiques) et IV (glioblastomes ou GBM) appartiennent au groupe des astrocytomes diffus, des tumeurs qui infiltrent diffusément le parenchyme cérébral (Figure 1). Par ailleurs, les tumeurs de grade II et III progressent au cours du temps en GBM. Bien qu’extrêmement malignes et associées à un mauvais pronostic, la majorité de ces tumeurs ne métastasient pas à l’extérieur du SNC (Ohgaki et Kleihues, 2005). La survie moyenne des patients atteints d’un astrocytome de grade II est supérieur à 5 ans, de 2 à 3 ans pour les astrocytomes de grade III et de moins d’1 an pour les GBM (Louis et coll., 2007a ; Ohgaki et Kleihues, 2005). Les GBM peuvent se développer de novo (GBM primaires qui représentent plus de 95% des GBM) ou par la progression d’une tumeur de grade II ou III (GBM secondaires) (Louis et coll., 2007a). Ces deux types de GBM sont associés à des tranches d’âge différentes, des pronostics différents et des anomalies moléculaires différentes sur lesquelles nous reviendrons plus en détail à la section 3.
La classification de l’OMS décrit deux grades parmi les tumeurs oligodendrogliales : les oligodendrogliomes de grade II et les oligodendrogliomes de grade III ou anaplasiques. Le taux de survie à 10 ans des oligodendrogliomes de grade II est de 54%, et de 34% pour les grades III. De façon analogue aux tumeurs astrocytaires de haut grade, les oligodendrogliomes anaplasiques apparaissent soit à partir de l'évolution d'oligodendrogliomes de grade II, soit de novo (Kleihues et Cavenee, 2000 ; Louis et coll., 2007a). De par leur profil moléculaire, les tumeurs oligodendrogliales ont généralement un meilleur pronostic et sont plus sensibles à la chimiothérapie que les tumeurs astrocytaires, comme nous le détaillerons à la section 3.1. ci-dessous (Louis, 2006).
Les tumeurs oligoastrocytaires présentent un profil mixte composées de cellules tumorales astrocytaires et oligodendrogliales, et représentent environ 2% de l’ensemble des gliomes (Decaestecker et coll., 1997 ; Hart et coll., 1974 ; Louis et coll., 2007a). Ces tumeurs mixtes peuvent être de grade II ou de grade III. Cependant, certains GBM semblent être caractérisés par des foyers de cellules tumorales dont le phénotype est d’origine oligodendrogliale (Decaestecker et coll., 1998 ; Klink et coll., 2010 ; Salvati et coll., 2009). Bien que de plus amples données clinico-pathologiques soient nécessaires avant de pouvoir considérer ce type de GBM comme une nouvelle entité (Louis et coll., 2007 b), différents profils génétiques ont été récemment mis en évidence (Klink et coll., 2010). Des résultats préliminaires tendent à
montrer que la présence d’une composante oligodendrogliale au sein de GBM serait associée à un meilleur pronostic (Salvati et coll., 2009).
Dans le cadre de ce travail, nous nous intéresserons aux tumeurs gliales de haut-grade, et plus particulièrement aux glioblastomes.
2.2. TUMORIGENESE ET RECIDIVE DES TUMEURS GLIALES
Une évolution clonale et/ou l’existence de cellules souches cancéreuses constituent deux hypothèses mutuellement non exclusives pouvant expliquer la tumorigenèse et la récidive des gliomes malins. L’hypothèse d’une évolution clonale suppose qu’une instabilité génétique au sein de cellules gliales normales entraînerait l’émergence de sous-populations cellulaires arborant différentes anomalies génétiques. Ces sous-populations cellulaires seraient alors séquentiellement sélectionnées par le microenvironnement tumoral durant la progression du cancer ou lors d’un traitement agressif (cf. section suivante). Suivant la pression de sélection, chacune de ces sous-populations peut devenir prédominante et contribuer au développement et à la progression tumorale. De plus, après un traitement donné, les sous-populations qui opposent la meilleure résistance pourraient aussi être sélectionnées par l’environnement tumoral et réinitier cette tumeur.
L’hypothèse des cellules souches cancéreuses (CSCs) suppose que, tout comme le tissu normal, le tissu tumoral contient ses propres cellules souches dites « cellules souches cancéreuses ». Parmi les cellules tumorales, seules celles qui possèdent les caractéristiques de multipotence (différenciation) et d’auto-renouvellement des cellules souches seraient capables d’initier le développement de la tumeur (Xie, 2009). La mise en évidence de ces CSCs a été réalisée dans un grand nombre de tumeurs et leur étude a montré que plusieurs de leurs propriétés les rendent particulièrement résistantes aux traitements et chimiothérapies conventionnelles que nous décrivons ci-dessous (Xie, 2009). Quatre aspects suivants peuvent être soulignés : i) les CSCs sont relativement quiescentes ; ii) elles expriment un grand nombre de transporteurs ABC (ATP binding cassette transporter) qui permettent l’export efficace des molécules thérapeutiques (Lou et Dean, 2007) ; iii) comparées aux autres cellules tumorales, les CSCs ont la capacité de réduire les dommages à l’ADN induits par les radiations, en maintenant un faible taux de ROS (reactive oxygen species) (Bao et coll., 2006 ; Diehn et coll., 2009) ; iv) enfin, les CSCs peuvent activer certaines voies de signalisation de la survie cellulaire, telle la voie PI3K-Akt pour inhiber l’apoptose (Eyler et coll., 2008 ; Hambardzumyan et coll., 2008).
Un grand nombre de travaux atteste l’existence de telles cellules souches dans les tumeurs
primaires de cerveau humain, ce sont les BTSCs (Brain Tumor Stem Cells). Ces BTSCs pourraient résulter d’altérations génomiques oncogéniques apparaissant dans les cellules souches neurales (NSCs) et les cellules gliales progénitrices (NPCs) (Sanai et coll., 2005).
Leur caractère « souche d’auto-renouvellement » serait fortement conditionné à leur proximité avec des niches vasculaires, et dépendant de voies clés de signalisation, telles que Notch, Wnt ou BMPs, TGFß et Sonic Hedgehog, qui tiennent un rôle crucial dans la différenciation neuronale (Sanai et coll., 2005 ; Xie, 2009).
2.3. TRAITEMENT
Les gliomes de haut grade de malignité auxquels nous nous sommes intéressés dans ce travail sont des tumeurs qui restent aujourd’hui incurables. L’approche thérapeutique variera selon la situation clinique (âge, condition générale et neurologique du patient) et les résultats des examens radiologiques et du diagnostic (Kleihues et Cavenee, 2000 ; Louis et coll., 2007b).
2.3.1. La chirurgie
La résection chirurgicale la plus large possible de la tumeur infiltrante représente toujours l’étape principale du traitement des gliomes de haut grade (Hsiek et Lesniak, 2005). Le caractère « complet » ou non de la résection chirurgicale, évaluable (à un niveau macroscopique) par imagerie postopératoire, joue un rôle important dans le devenir du patient. Bien que la résection chirurgicale d’un gliome de haut grade ne soit jamais curative, l’étendue de cette résection est positivement corrélée à la survie des patients porteurs d’un GBM (Van Meir et coll., 2010). Le guidage par fluorescence permet aujourd’hui de faciliter la réalisation de résections macroscopiques larges de ces tumeurs (Van Meir et coll., 2010).
Pour les gliomes de haut grade (grade III et IV), un traitement postopératoire est généralement préconisé. Nous ne décrirons ci-dessous que les thérapies standards, à savoir la radiothérapie combinée à la chimiothérapie, ainsi que les thérapies ciblées dans le cadre desquelles s’inscrit notre travail.
2.3.2. Radiothérapie et chimiothérapie
Pour les astrocytomes de grade III et IV (haut grade de malignité), le traitement post- opératoire préconisé combine radiothérapie et chimiothérapie. Des études cliniques randomisées de phase III concernant des GBM primaires ont montré que, comparée à la radiothérapie seule, l’utilisation concomitante de temozolomide (TMZ) augmentait de plus de
16% le taux de survie des patients à 2 ans (Stupp et coll., 2009).
Le TMZ est un agent alkylant imidazotetrazine de seconde génération qui ne nécessite pas de métabolisation hépatique pour produire un agent actif. Il agit comme une prodrogue, qui à pH physiologique va libérer l’AIC (le 5-aminoimidazole-4-carboxamide), et l’ion methyldiazonium capable de méthyler les bases guanines en position O6 et N7 de l’ADN. En effet, en s’appariant de manière erronée avec la thymine, l’O6-methylguanine entraîne une cascade de réponses qui va finalement conduire à la mort cellulaire (Neidle et Thurston, 2005 ; Paus et coll., 2007 ; Stupp et coll, 2005). Ce traitement qui peut être administré oralement, offre un réel espoir dans la chimiothérapie des gliomes diffus. Il s’est montré efficace tout d’abord dans le traitement des GBM récidivants, tout en maintenant ou en améliorant la qualité de vie des malades, et a ensuite été approuvé en utilisation combinée avec la radiothérapie pour les GBM nouvellement diagnostiqués (Stupp et coll., 2005).
L’utilisation du TMZ seul ou en combinaison avec d’autres agents est à l'étude dans différentes phases cliniques pour les gliomes de grades II et III, les métastases cérébrales ainsi que d’autres cancers, comme le mélanome ou les cancers du poumon à petites cellules réfractaires aux thérapeutiques classiques (Refractory Small Cell Lung Cancer) (Mutter et Stupp, 2006) (ClinicalTrials.gov).
En cas d’échec du traitement avec le TMZ, les nitrosourées, tels le bischloroéthyl nitrosourée (BCNU, carmustine) et le chloroéthylcyclohexyl nitrosourée (CCNU, lomustine), sont aujourd’hui les agents alkylants de chimiothérapie les plus communément utilisés en seconde ligne pour le traitement des gliomes malins.
Les oligodendrogliomes (grade II et III) se distinguent par une constellation unique d’altérations génétiques incluant la perte concomitante des bras chromosomiques 1p et 19q chez 60 à 80% des tumeurs étudiées (Cairncross et coll., 1998). Les patients présentant ce profil moléculaire bénéficient d’une meilleure réponse à la chimiothérapie combinant la procarbazine, la lomustine et la vincristine (PCV), avec un taux de réponse de l’ordre de 70%
pour une survie de 18 à 20 mois (Burton et Prados, 2000).
2.3.3. Les thérapies ciblées ou « targeted therapy »
On entend par « targeted therapy » les traitements qui ciblent (généralement avec une action inhibitrice) des molécules (protéines) surexprimés par les cellules gliales tumorales et responsables de la progression tumorale (prolifération, migration, angiogenèse) ou de la résistance aux traitements conventionnels. Ces traitements ciblés peuvent s’utiliser seuls ou en
combinaison avec la radiothérapie ou le TMZ. Les ligands des récepteurs sigma étudiés dans ce travail pourraient rejoindre ce type d’arsenal thérapeutique. Les sections ci-dessous présentent des exemples de cibles les plus communément visées.
2.3.3.1. Facteurs de croissance et leurs récepteurs
Les récepteurs des facteurs de croissance sont des récepteurs tyrosine kinase comprenant l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), le PDGFR (Platelet Derived Growth Factor Receptor), et l’IGFR (Insulin-like Growth Factor Receptor). Leur disfonctionnement, généralement dû à des amplifications et/ou mutations, mène à l’accélération de la progression des gliomes malins. De petites molécules inhibitrices de ces récepteurs, tels l’Erlotinib ou l’Imatinib (inhibiteur de la tyrosine-kinase de l'EGFR et inhibiteur des tyrosines kinases de FGFR3/PDGFR respectivement) ou des anticorps bloquants ont été développés, mais n’ont montré qu’une activité anti-tumorale limitée. Seul 10% des patients présentant un GBM semblent répondre à ce type d’inhibiteur utilisé en monothérapie (Butowski et coll., 2006 ; Raizer et coll., 2004).
2.3.3.2. Anti-angiogenèse
Ce type de thérapie a deux cibles possibles : (i) les cellules endothéliales microvasculaires recrutées dans le site tumoral, et vise ainsi à inhiber ainsi leur prolifération et leur migration, ou (ii) l’activité de protéines secrétées par les cellules tumorales et stimulant le processus d’angiogenèse, tels les facteurs de croissance VEGF (vascular endothelial growth factor), TGF (transforming growth factor-alpha) et bFGF (basic fibroblast growth factor) (Figure 2). Les gliomes de haut grade présentent des taux élevés d’angiogenèse et constituent donc une cible appropriée pour ces traitements. A l’heure actuelle, différents molécules capables d’inhiber la formation de nouveaux vaisseaux sanguins sont à l’étude. La thalidomide (inhibiteur de VEGF et bFGF), seul ou en combinaison avec la radiothérapie ou le TMZ, est en Phase II d’essai clinique sur des patients présentant une récidive de gliome de haut grade, (http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00521482?term=glioblastoma&rank=91).
D’autres stratégies, utilisant des anticorps anti-VEGF comme le bevacizumab (Avastin®) en combinaison avec l’irinotecan, sont également en cours d’évaluation clinique (http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00039468?term=glioblastoma&rank=119)
(Butowski et coll., 2006). Des études précliniques ont démontré l’activité anti-angiogénique de l’enzastaurin, un inhibiteur spécifique de la protéine kinase C (PKC) – (dont l’induction se fait à travers la voie de signalisation du VEGF), dans divers modèles de tumeurs incluant
des gliomes (Teicher et coll., 2001).
2.3.3.3. Anti-métalloprotéinases
Les métalloprotéinases matricielles (MMP) sont des endopeptidases zinc-dépendantes qui dégradent la membrane basale et la matrice extracellulaire facilitant ainsi la croissance, l’invasion et la progression tumorale. Les MMP sont souvent surexprimées par les tumeurs et notamment les gliomes, qui surexpriment généralement les MMP-2, MMP-7, MMP-9 ou encore la MMP membranaire de type 1 (MT1-MMP). Des inhibiteurs spécifiques de certaines de ces enzymes (marimastat, metastat et prinomastat) ont été évalués mais n’ont pas donné de résultats probants (Hidalgo et coll., 2001). Plus récemment, il a été démontré que tout comme la MMP-7, la MMP-9 était capable d’induire la protéolyse du complexe IGFBP2/IGFII (insulin-like growth factor binding protein 2 / insulin-like growth factor II), libérant ainsi le facteur de croissance IGFII connu pour augmenter les capacités de croissance et de motilité des cellules cancéreuses astrocytaires (Rorive et coll., 2008). Dès lors, l’activité de ces deux MMP peut être considérée comme un événement post-traductionnel important impliqué dans l’agressivité des astrocytomes. Leur inhibition spécifique pourrait constituer une nouvelle approche dans le traitement des astrocytomes.
3. LA BIOLOGIE DES GLIOMES
Du fait de l’importance de sa dissémination locale, la résection chirurgicale d’un gliome malin n’est jamais curative. Après la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, les cellules gliales tumorales qui infiltrent le parenchyme cérébral en périphérie du bloc tumoral réséqué chirurgicalement donneront lieu à une récidive tumorale. Dans les sections qui suivent, nous aborderons différentes propriétés biologiques des gliomes impliquées notamment dans les échecs thérapeutiques actuels dont : i) les altérations génétiques caractéristiques des tumeurs gliales, ii) les différents types de mort cellulaire, iii) le stress cellulaire et du réticulum endoplasmique, iv) la migration des cellules gliales tumorales, et enfin v) certains processus de chimiorésistance.
3.1. ALTÉRATIONS MOLÉCULAIRES AU SEIN DES TUMEURS GLIALES Les altérations moléculaires présentes dans les gliomes se sont révélées extrêmement variables même dans le cas de tumeurs de type histologique et de grade identique. Cette
hétérogénéité contribue à la limitation actuelle de la prédiction de survie du patient sur la seule base de la classification classique des gliomes (Tableau 1). Une connaissance du phénotype génétique pourrait amener à une meilleure prédiction de la survie et de la réponse aux thérapies des patients atteints de gliomes. Ainsi, des progrès importants ont été réalisés ces dernières années dans le recensement des altérations moléculaires présentes dans les gliomes (Gladson et coll, 2010).
La formation et l’évolution des gliomes d’un grade II vers un grade III puis IV est le résultat de l’accumulation d’altérations génétiques impliquant des gènes régulant la prolifération, la mort et la différentiation cellulaire (Ohgaki et Kleihues, 2007 ; Watanabe et coll., 2009).
Tout récemment, sur base d’analyses génomiques une nouvelle classification des GBM en 4 groupes a été proposée. Elle repose sur des altérations de gènes touchant des acteurs clés tels que l’EGFR, NF1 (neurofibromatosis type 1), PDGFRA et IDH1 (isocitrate dehydrogenase 1). Chacune de ces altérations définit respectivement les sous-types « classique » (qui se caractérise aussi par une absence d’altération du gène TP53), « mésenchymal » et « proneural » ; le dernier sous-groupe, dit « neural », reste hétérogène sans identification d’altérations spécifiques (Brennan et coll., 2009 ; Verhaak et coll., 2010).
De façon intéressante, la réponse à une thérapie agressive semble varier selon les différentes classes. Le plus grand bénéfice thérapeutique a été observé dans le sous-type « classique » tandis qu’aucun bénéfice n’a été observé dans le sous-type « proneural » (Verhaak et coll., 2010).
Parmi les principales altérations observées dans les gliomes de haut grade, la protéine nucléaire p53, codée par le gène TP53 localisé sur le chromosome 17p13.1, joue un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire, la réponse au dommage de l’ADN et l’apoptose, et donc dans la croissance tissulaire normale ou pathologique (Lane, 1992). La perte de l’activité de la protéine p53 est impliquée dans la formation de gliomes de bas grade et la progression vers un GBM secondaire. Les mutations du gène TP53 sont observées dans 50 à 60% des astrocytomes de haut grade et les GBM secondaires, mais ne touche que 28% des GBM primaires (Ohgaki et Kleihues, 2007). Par contre ces mutations ne sont observées que dans 10 à 30% des oligodendrogliomes de haut grade (Watanabe et coll., 2009).
Les glioblastomes présentent fréquemment la perte du bras long du chromosome 10q où se situe le gène suppresseur de tumeur PTEN (phosphatase and tensin homolog). Celui-ci est muté dans 30 à 44% des gliomes de haut grade et particulièrement dans les glioblastomes primaires (Louis, 2006).
L’hyperméthylation du promoteur du gène codant pour la MGMT, apparaît dans 36% des GBM primaires et 75% des GBM secondaires indiquant une meilleure réponse de ces derniers au TMZ (Ohgaki et Kleihues, 2007).
Les mutations du gène IDH1 entraînent une inhibition de l’activité enzymatique de la protéine correspondante opérant la conversion de l’isocitrate en -cétoglutarate. Dans le cytoplasme cellulaire, où l’enzyme IDH1 représente la principale source de NADPH, son inhibition provoque une augmentation du stress oxydatif et de la sensibilité à l’apoptose (Lee SM et coll., 2002). Toutefois, ces mutations permettraient à IDH1 de changer de substrat pour convertir, à partir de la glutamine, l’-cétoglutarate en 2-hydroxyglutarate. Cette dernière aurait un rôle oncogène notamment en permettant la stabilisation du facteur hypoxique inductible (HIF1) (Dang et coll., 2009). Ainsi la présence de ce type de mutation est associée à une augmentation de la survie des patients porteurs de gliomes notamment de haut grade (Christensen et coll, 2011) mais pourrait-être aussi associée à un manque de réponse aux traitements thérapeutiques agressifs (les altérations IDH1/PDGFR étant associées au sous-type « proneural » des GBM). Au sein des tumeurs cérébrales, ces mutations du gène IDH1 sont spécifiques des gliomes et s’observent dans 54 à 88% des astrocytomes diffus et 65 à 79% des oligodendrogliomes. Plus particulièrement, ces mutations se retrouvent dans 50 à 82% des GBM secondaires et sont nettement plus rares (maximum 5%) dans les GBM primaires (Ichimura et coll., 2009 ; Watanabe et coll, 2009).
De nombreux facteurs de croissance comme l’EGF, le PDGF le VEGF et leurs récepteurs sont surexprimés par les tumeurs gliales. Les tumeurs astrocytaires de haut grade présentent, de plus, une amplification et/ou une mutation du gène pour l’EGFR. Une mutation de ce gène induit une augmentation de l’agressivité tumorale par réduction de l’apoptose et augmentation de la prolifération cellulaire (Nagane et coll., 1996 ; Gladson et coll, 2010). Plus de 60% des glioblastomes primaires présentent cette amplification et/ou une mutation de l’EGFR, par contraste avec les glioblastomes secondaires qui présentent souvent des mutations du gène TP53. Les patients atteints d’un oligodendrogliome ne sont, quant à eux, que très rarement concernés par l’amplification de l’EGFR (Paus et coll., 2007).
La co-délétion 1p19q est reconnue comme étant un des événements précoces de l’oncogenèse des tumeurs oligodendrogliales. Cette anomalie génétique caractérise 60 à 80% des oligodendrogliomes de haut grade, mais n’est que très peu observée dans les astrocytomes de haut grade et les GBM (respectivement 14 % et 3%) (Ichimura et coll., 2009). Cette co- délétion est un marqueur de meilleur pronostic, associée à une meilleure chimiosensibilité
(Louis, 2006). Il est intéressant de noter qu’au sein des oligodendrogliomes 90% des patients porteurs d’une co-délétion 1p19q sont également porteurs d’une méthylation du gène codant pour la MGMT, ce qui laisse suspecter un rôle pronostique de cette méthylation dans le traitement des oligodendrogliomes (Paus et coll., 2007).
3.2. LES DIFFERENTS TYPES DE MORT CELLULAIRE
Quatre formes essentielles de mort cellulaire sont décrites en fonction des activités cellulaires dynamiques ayant entrainé la destruction de la cellule : la nécrose, l’apoptose, l’autophagie et la catastrophe mitotique. Dans le contexte particulier de la thérapie anticancéreuse, la sénescence qui correspond à un arrêt de croissance permanent est aussi considérée comme un type de mort cellulaire. Les dérégulations des voies de signalisation qui contrôlent chacune de ces cinq formes majeures de mort cellulaire sont impliquées dans la tumorigenèse (Okada et Mak, 2004 ; Ricci et Zong, 2006).
Nous ne détaillerons ci-après que les types de mort cellulaire concernés par notre travail, à savoir l’apoptose et l’autophagie (Tableau 2).
3.2.1. L'apoptose
L'apoptose est le mécanisme de mort cellulaire programmée de type I qui permet l'autodestruction de cellules déficientes ou surnuméraires, suite à l'activation d'une cascade de gènes et de protéines impliquant la famille des cystéines-protéases nommées caspases (Okada et Mak, 2004).
Les premières manifestations morphologiques de l'apoptose se caractérisent par une perte de contact entre cellules, une contraction cellulaire, une désintégration de l'enveloppe nucléaire avec fragmentation de l'ADN génomique (clivage de la chromatine) et une condensation du cytoplasme avec relargage du cytochrome c de la mitochondrie dans le cytoplasme (Kluck et coll., 1997 ; Yang et coll., 1997). La mort par apoptose conduit finalement à la fragmentation de la cellule qui va former des corps apoptotiques dotés d'une membrane intacte contenant des organelles, des fragments nucléaires et un cytoplasme condensé qui seront finalement phagocytés soit par des phagocytes spécifiques ou par des cellules voisines, sans le déclenchement d'une réaction inflammatoire.
Les différentes études effectuées sur ce mécanisme ont mis en évidence l'existence de deux voies principales d'induction de l'apoptose : la voie intrinsèque (ou mitochondriale) et la voie extrinsèque (ou des récepteurs de mort cellulaire) telles qu’illustrées à la Figure 3 (Okada et Mak, 2004). La voie intrinsèque implique une réception du signal au niveau de la
mitochondrie qui fait intervenir les membres de la famille Bcl-2, famille de protéines régulatrices connues pour leurs activités pro-apoptotiques (telles que Bax et Bak) ou anti- apoptotiques (telles que Bcl-2 et Bcl-XL). La voie extrinsèque s’appuie sur une réception de signal au niveau de la membrane plasmique, dont plusieurs récepteurs connus appartiennent à la famille des récepteurs TNF (tumor necrosis factor) tels que Fas, TNF-R1 (tumor necrosis factor receptor 1 ) ou TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) (Borner et coll., 2003;
Reed et coll., 2000).
Dans notre travail, nous utiliserons l’annexin V et la protéine PARP (Poly ADP-Ribose polymérase) comme marqueurs de l’apoptose. En effet, au cours du processus de mort cellulaire par apoptose certaines enzymes spécifiques (tel l’aminophosphatidyl translocase) vont être recrutées et provoquer l’exposition à la surface cellulaire de phosphatidylsérine.
Celles-ci sont normalement uniquement présentes sur le feuillet interne de la membrane.
L’exposition des phosphatidylsérines à la surface des cellules constitue une étape précoce du processus d’apoptose qui pourra être déterminée par un marquage à l’annexin V (couplée à un fluorochrome) qui a une haute affinité pour la phosphatidylsérine. La protéine PARP (Poly ADP-Ribose polymérase), impliquée dans la réparation de l’ADN, est une enzyme nucléaire mais aussi le substrat des caspases-3 et 7 activées durant la mort cellulaire programmée de type I. Ces caspases clivent la protéine PARP de 113 kD en fragments d’approximativement 89 kD et 24 kD. La détection du fragment de 89 kD par un anticorps anti-PARP, est utilisée comme marqueur de la mort cellulaire programmée de type I.
3.2.2. L’autophagie
L’autophagie est un mécanisme de mort cellulaire programmée de type II. Elle est stimulée en diverses situations de stress. Comme nous le préciserons ci-dessous, elle peut aussi, paradoxalement, représenter un mécanisme de survie cellulaire, par notamment le recyclage des acides aminés et l’élimination des macromolécules et des structures cellulaires altérées (Kondo, 2005).
Dans la littérature, trois formes d’autophagie ont été décrites : la macroautophagie, l’autophagie couplée ou dépendante des protéines chaperonnes, et la microautophagie. La forme la plus répandue est la macroautophagie. Cette dernière implique la formation de vésicules cytosoliques à double membranes, les autophagosomes, qui séquestrent des portions du cytoplasme. La fusion de l’autophagosome avec le lysosome forme l’autolysosome. Les hydrolases lysosomales contenues dans le lysosome vont alors dégrader le matériel
cytoplasmique et éventuellement recycler des acides aminés, nucléotides et acides gras pour maintenir la synthèse de macromolécules et la production d’énergie nécessaire à la survie cellulaire (Klionsky, 2005 ; Levine, 2007) (Figure 4). Les autres formes d’autophagie ne seront pas décrites ici car non abordées dans ce travail. Par la suite, la macroautophagie sera simplement désignée sous le terme « autophagie ».
Dans divers types de cancers, les cellules sont capables de survivre à de longues périodes de privation d’éléments nutritifs et présentent un taux important d’autophagie. Dans ce sens, le déclenchement du mécanisme d’autophagie serait en faveur de la survie des cellules cancéreuses (Hait et coll., 2006). Toutefois, de nombreuses études sur la thérapie anticancéreuse ont montré que la mort des cellules dérivées de divers tissus cancéreux (sein, colon, prostate et cerveau) pouvait être déclenchée par le mécanisme d’autophagie (Kondo et coll., 2005 ; Ogier-Denis et Codogno, 2003 ; Okada et Mak, 2004). Ainsi, le processus d’autophagie serait un équilibre extrêmement sensible entre la mort et la survie des cellules cancéreuses. Une autophagie sévère peut promouvoir ou réguler la mort cellulaire par apoptose, et sous certaines conditions elle ne peut être déclenchée que dans le cas où l’induction de l’apoptose est inhibée (Figure 5) (Hait et coll., 2006 ; Jin et White, 2007 ; Liu et coll., 2011). D’autres études, in vitro comme in vivo, ont révélé que l’autophagie pouvait être une cible thérapeutique intéressante pour induire la mort cellulaire dans des cancers agressifs, tels que les glioblastomes, au sein desquels les cellules migrantes sont particulièrement résistantes à l’apoptose (Kanzawa et coll., 2004 ; Natsumeda et coll., 2011).
La Figure 6 détaille les voies de signalisation impliquées dans le mécanisme d’autophagie.
Dans notre travail, nous utiliserons deux marqueurs d’autophagie : la protéine Beclin1 et la protéine MAP-LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3).
La protéine Beclin1 est la première protéine qui a montré un lien direct entre la tumorigenèse et l’interruption du mécanisme autophagique. La protéine Beclin1 de 60kDa se lie à la phosphatidylinositol 3-kinase de type III (PI3K-III) pour former dans le cytoplasme un complexe indispensable à la formation de l’autophagosome. La mise en évidence d’une augmentation d’expression de la protéine Beclin1 est considérée comme un marqueur précoce du processus autophagique (Kondo, 2005). La protéine MAP-LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) est aussi un marqueur du processus autophagique. Sans activation d’autophagie, la protéine soluble LC3 sous sa forme I (19 kDa) est répartie de façon homogène dans le cytoplasme. Dès l’initiation d’un mécanisme autophagique, la protéine LC3
sous sa forme II (15 kDa) s’associe avec la double membrane de l’autophagosome (Figure 4).
L’augmentation de son expression sous la forme LC3-II ou le passage d’une distribution homogène à une vacuolarisation de la protéine est donc un signe de présence d’un processus autophagique (Kanzawa et coll., 2004).
3.3. LE STRESS CELLULAIRE
Le stress cellulaire est un mécanisme complexe d'activation de voies de signalisation qui, selon le contexte conduit, soit à la mort cellulaire dite « programmée » (apoptose ou autophagie), soit à l'induction de mécanismes d'adaptation. La compréhension des mécanismes de la réponse cellulaire au stress est particulièrement importante dans le contexte des thérapies anti-cancéreuses qui, pour la plupart, recourent à l'utilisation d'agents chimiques ou physiques toxiques pour détruire les cellules tumorales.
Nous ne détaillerons ici que le stress cellulaire engendré par les protéines de stress étudiées dans le cadre de notre travail.
3.3.1. Activation des mécanismes de réparation ou d'adaptation en réponse au stress cellulaire
Une agression extérieure de la cellule peut engendrer une accumulation de protéines altérées ou mal conformées suite à des anomalies de leur structure tertiaire; cette accumulation va, par conséquent, augmenter l’expression de protéines chaperonnes, ce qui induit la réponse au stress cellulaire.
Les protéines Hsp (heat shock proteins) sont des protéines chaperonnes présentes dans toutes les cellules, aussi bien au niveau du cytoplasme que dans la mitochondrie, le reticulum endoplasmique (RE) ou le noyau, et sont synthétisées lors d'un stress ou d’un choc. Leur fonction de chaperonne (souvent médiée par l’ATP) est nécessaire aux repliements conformationnels de certaines protéines, à la formation de complexes multiprotéiques, au transport protéique à travers les membranes et au ciblage de certaines d’entre-elles en vue de leur dégradation lysosomale (Larsen, 2005). Il existe chez l’humain au moins 8 protéines Hsp très homologues mais très inégalement exprimées et réparties au sein de différents types cellulaires. Elles jouent un rôle essentiel dans la croissance des tumeurs, tant en promouvant la prolifération de cellules qu'en inhibant le programme de mort cellulaire. Des études récentes indiquent que la protéine Hsp90 joue un rôle extracellulaire important dans l’étape d’invasion des métastases, notamment à travers leur liaison à une protéine clé de l’invasion de la matrice extracellulaire, la métalloprotéinase matricielle de type II (Calderwood et coll.,
2006). Les Hsp ont aussi une fonction déterminante dans les étapes effectrices de l’angiogenèse. Elles sont ainsi devenues des cibles pour la conception de molécules anticancéreuses et des inhibiteurs d’Hsp90 seraient prometteurs dans des expérimentations cliniques(Calderwood et coll., 2006).
Dans les cellules normales, la protéine de choc thermique Hsp70 est peu exprimée en l’absence de stress cellulaire, mais voit sa concentration augmenter fortement à la suite de stimuli physiques et chimiques. Elle est la plus ubiquitaire des Hsp et est généralement considérée comme le marqueur principal du stress cellulaire.
Contrairement aux cellules normales, Hsp70 est abondamment exprimée dans les cellules cancéreuses (lignées et tumeurs) et cette expression est corrélée à une faible différenciation, à une capacité de prolifération élevée, à une propension aux métastases et à la résistance à divers agents cytotoxiques (Larsen, 2005). Elle stabilise la membrane lysosomale, conférant à la cellule tumorale une certaine résistance aux processus de mort cellulaire faisant intervenir les enzymes lysosomales. Suite à un stress cellulaire l’augmentation de Hsp70 protège également les cellules tumorales de l’apoptose, en inhibant les voies de signalisation en amont et en aval de la caspase-3 (Jaattela et al. 1998), en empêchant la libération du cytochrome c mitochondrial suite à un stress et en inhibant la formation de l’apoptosome sous sa forme active via interaction avec Apaf-1. Hsp70 peut également se fixer à l’AIF (apoptosis inducing factor) pour l’inhiber.
Les protéines de stress Hsp70 et Hsp90, aussi bien cytosoliques que nucléaires, ont leur homologue dans le RE : les protéines GRP-78 (glucose-regulated proteine 78) /ou BiP (immunoglobulin heavy chain binding protein) et GRP-94 (glucose-regulated proteine 94), qui participent au stress du reticulum endoplasmique (Haas et coll., 1994), voir ci-dessous.
GRP-78 est connue pour être présente à la surface d’une large variété de cellules cancéreuses et de tissus issus de biopsies de cancers.
3.3.2. Le stress du réticulum endoplasmique
Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est défini comme une perturbation de la balance entre la capacité et la demande de repliement conformationnel des protéines imposées au RE.
Les voies de signalisation intracellulaire déclenchées par un stress et permettant de restaurer l’homéostasie du RE sont appelées UPR (unfolded protein response). La réponse UPR et le système ERAD (ER-associated degradation) qui lui est associé se recouvrent partiellement
dans leur fonction d’élimination des protéines agrégées, non assemblées ou mal repliées du RE (Fewell et coll., 2001). Le système ERAD cible et rétrotransloque ces protéines vers le cytosol afin qu’elles puissent y être dégradées par le protéasome. Les protéines chaperonnes jouent un rôle clé dans la sélection et la solubilisation des substrats par le système ERAD.
Bien que la réponse UPR tente de faire survivre la cellule, elle peut engendrer la mort cellulaire si le stress est trop intense ou s’il perdure, déclenchant alors des réponses apoptotiques ou non-apoptotiques, comme illustré à la Figure 5 (Healy et coll., 2009).
Dans le cadre de notre travail, nous avons étudié la protéine BiP/GRP-78, l’un des acteurs de stress du RE qui est essentiel au ciblage par l’ERAD des substrats solubles (Fewell et coll., 2001). BiP/GRP-78 est une protéine calcium-dépendante qui, grâce à l’hydrolyse d’ATP, promeut le repliement conformationnel et prévient l’agrégation des protéines dans le RE.
Cette protéine chaperonne, initialement liée avec le facteur de transcription ATF6 (activating transcription factor 6), les kinases PERK (protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase) et l’IRE1 (inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease), se dissocie lors d’un stress du RE pour interagir avec les protéines mal conformées (Cox et coll., 1997 ; Healy et coll., 2009 ; Kimata et coll., 2004). Ces dissociations via différents acteurs enclenchent alors la réponse UPR (unfolded protein response) (Rutkowski et Kaufman, 2004). Sa surexpression ou son utilisation dans des approches siRNA (petit ARN interférent) a montré que BiP/GRP- 78 contribuait à favoriser la croissance tumorale et conférait une résistance cellulaire au traitement anticancéreux (Li et Lee, 2006). Nous y reviendrons dans la section 3.5.5 dans le contexte de la chimiorésistance.
3.4. LA MIGRATION DES CELLULES GLIALES TUMORALES
3.4.1. Description générale du processus migratoire
Pour envahir le tissu sain, les cellules tumorales utilisent des mécanismes migratoires similaires à ceux utilisés par les cellules normales durant des processus physiologiques comme l’embryogenèse, la cicatrisation ou la circulation des cellules immunitaires. La migration implique au moins trois étapes biologiques interdépendantes : a) l’adhésion cellulaire c-à-d l’interaction de la cellule avec les composants de la matrice extracellulaire et les cellules adjacentes, b) la motilité cellulaire qui nécessite des modulations morphologiques impliquant notamment le cytosquelette d’actine (Figure 7), et c) l’invasion cellulaire qui implique la dégradation de matrice extracellulaire (MEC) par divers enzymes protéolytiques
