UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DE MEDECINE
Institut de Recherche en Biologie Humaine et Moléculaire Promoteur: Prof. M. Parmentier
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Sohy Denis
Etude de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines CCR2, CCR5 et CXCR4
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Gilbert Vassart de m’avoir accueilli au sein de l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire.
Merci au professeur Marc Parmentier de m’avoir permis d’entreprendre une thèse de doctorat et de m’avoir donc accueilli au sein de son équipe.
Un merci tout particulier à Jean-Yves Springael pour ses conseils avisés et pour avoir été la dans les moments difficiles de ma thèse. Sans lui ce manuscrit n’existerait sans doute pas.
Merci à ma famille de m’avoir permis d’entreprendre des études et de m’avoir soutenu lors de la réalisation de celles-ci.
Merci à l’équipe, Audrey, Aude, Patricia, Thalie, Laurence, Souphalone, Cédric, Olivier, Xavier et Patrick pour leurs aides diverses et la bonne humeur si importante qui régnait dans le groupe.
Merci aux personnes de mon bureau, Barbara, Pierre et Hakim pour l’ambiance de feu, le soutien et les bonnes blagues qui permettent de tenir le coup et de venir au boulot toujours avec le même sourire.
Merci à toutes les personnes du C5.114, Sandra, Julie et Régis mais aussi aux techniciennes de la génétique Amandaline et Mélina, pour leurs conseils experts aussi bien professionnels que privés.
Merci à mes amis biologistes et autres de Namur, François, Audrey, Sofia, Delphine, Lolo, Jérémie, Aline, Sophie, Isa et j’en passe qui ont toujours été la pour s’amuser, sortir et pour m’avoir écouté.
Table des matières
TABLE DES MATIERES ... 3
ABSTRACT... 5
RESUME DE LA THESE ... 6
1. INTRODUCTION ... 9
1.1.LES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G ... 9
1.1.1.GENERALITES ... 9
1.1.2.STRUCTURE DES GPCRS ... 9
1.1.3. ACTIVATION DES GPCRS ET TRANSDUCTION DU SIGNAL ... 10
1.1.4.FAMILLES STRUCTURELLES DE GPCRS ... 12
1.1.4.1. Famille 1 ou A ... 12
1.1.4.2. Famille 2 ou B ... 13
1.1.4.3. Famille 3 ou C ... 13
1.1.4.4. Autres familles ... 14
1.1.5. MECANISMES DE REGULATION DES GPCRS ... 15
1.2.LES CHIMIOKINES ET LEURS RÉCEPTEURS ... 15
1.2.1.GENERALITES ... 15
1.2.2.CLASSIFICATIONS STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE ... 16
1.2.2.1. Classification structurale ... 16
1.2.2.2. Classification fonctionnelle ... 17
1.2.3.INTERACTIONS ENTRE LES CHIMIOKINES ET LEURS RECEPTEURS ... 18
1.2.4.LE RECEPTEUR CCR2 ... 20
1.2.5.LE RECEPTEUR CCR5 ... 21
1.2.6.LE RECEPTEUR CXCR4 ... 23
1.3.LE CONCEPT DE DIMÉRISATION ... 25
1.3.1.GENERALITES ... 25
1.3.2.DIMERISATION DES GPCRS ... 27
1.3.4.DIMERISATION DES RECEPTEURS AUX CHIMIOKINES ... 29
1.3.4.1. Généralités ... 29
1.3.4.2. Rôle du ligand ... 30
1.3.5.INTERACTION ALLOSTERIQUES ENTRE PROTOMERES ... 32
1.4.IMPLICATIONS DE LA DIMÉRISATION DES GPCRS SUR LA PHARMACOLOGIE DU RÉCEPTEUR 38 2. BUT DU TRAVAIL... 41
3. MATERIEL ET METHODES ... 43
3.1.VECTEURS D’EXPRESSION ... 43
3.2.LIGNEES CELLULAIRES ... 43
3.3.PURIFICATION DE CELLULES NATIVES ... 44
3.4.TRANSFECTIONS ... 45
3.5.CYTOMETRIE DE FLUX (FACS) ... 46
3.6.MESURE DE L’EXPRESSION DE RÉCEPTEURS À LA SURFACE CELLULAIRE ... 46
3.7.BRET(BIOLUMINESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER) ... 47
3.8.ANALYSE FONCTIONNELLE :TEST AEQUORINE ... 49
3.9.PRÉPARATION DE MEMBRANES DE CELLULES ... 50
3.10.DOSAGE DE PROTÉINES ... 50
3.11.TEST DE LIAISON DE CHIMIOKINES AUX RECEPTEURS ... 51
3.12.DISSOCIATION DE LIGAND RADIOMARQUÉ ... 51
3.13.CHIMIOTACTISME ... 52
3.14.AIR POUCH ... 52
4. ALLOSTERIC TRANS-INHIBITION BY SPECIFIC ANTAGONISTS IN CCR2/CXCR4 HETERODIMERS ... 53
5. ALLOSTERIC TRANS-INHIBITION IN CCR2, CCR5 AND CXCR4 OLIGOMERS... 64
6. DISCUSSION GENERALE ... 90
7. CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES ... 97
8. BIBLIOGRAPHIE ... 99
Abstract
Dimerization has recently emerged as an important feature of G protein-coupled receptors.
Although it is well established that GPCRs are able to form homo and heterodimers, the functional consequences of such interactions remain often unclear. Previous studies have shown that the chemokine receptors CCR2 and CCR5 form homo- and hetero-oligomer and identified a negative binding cooperativity of allosteric nature between the binding site of CCR2 and CCR5 in cells co-expressing both receptors. In the present work, we have extended this study to CXCR4, more distantly related structurally than CCR5 and CCR2.
Therefore, while CCR5/CCR2 heterodimers might constitute a model of how receptor homodimers behave, CCR2/CXCR4 and CCR5/CXCR4 heterodimers represent more likely the average situation when two (or more) chemokine receptors are co-expressed in a leukocyte population. We show by Bioluminescent Resonance Energy Transfer (BRET) that these receptors form constitutive homo and heterodimers. We describe that the negative binding cooperativity observed for CCR5/CCR2 heterodimers also stands for CCR2/CXCR4 and CCR5/CXCR4 heterodimers. When the receptors are coexpressed, a CXCR4-specific chemokine (SDF-1) can compete for the binding of a CCR2-specific tracer (MCP-1) and of a CCR5-specific tracer (MIP-1β) and vice-versa. The allosteric nature of this interaction was demonstrated by non equilibrium binding assays measuring the dissociation rate of tracers in the absence or presence of competitors. Negative binding cooperativity between CCR2 or CCR5 and CXCR4 was demonstrated in primary leukocytes, excluding that these observations might be due to overexpression of the receptors in our recombinant model systems. We also show that the specific antagonist of CXCR4 (AMD3100) can compete for the binding of a CCR2-specific tracer (MCP-1) and of a CCR5-specific tracer (MIP-1β), and vice versa (TAK-779 versus SDF-1), only when the two receptors are coexpressed. This is the first demonstration that allosteric interactions across chemokine receptor heterodimers also involve small molecule antagonists and that a chemokine receptor antagonist influences the functional response of another receptor on which it does not bind. Such functional effects were demonstrated in calcium mobilization assays on recombinant systems, in chemotaxis assays on lymphoblasts and in in vivo air pouch assays.
Résumé de la thèse
La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice- versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo.
Abréviations
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
AMD3100: 1,1'-[1,4-Phenylenebis(methylene)]bis-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane octahydrochloride
AMPA: α-Amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate AMPc: Adénosine MonoPhosphate Cyclique
ATP : Adénosine TriPhosphate
BRET: Bioluminescence Resonance Energy Transfer CB: CannaBinoïd
CD4 : Cluster of Differenciation CFP: Cyan Fluorescent Protein CHO: Chinese Hamster Ovary
CRLR: Calcitonin Receptor-Like Receptor DAG: DiAcylGlycérol
DMEM: Dulbecco Modified Eagle's minimal Essential Medium DMSO : DiméthylSulfOxyde
DOP: Delta Opioid Receptor DR: Dopamine Receptor
DsRED2: Discosoma sp. red fluorescent protein 2 EDTA : Ethylène Diamine TétraAcétate
ERK : Extracellular Regulated Kinase
EYFP: Enhanced Yellow Fluorescent Protein FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter FBS : Foetal Bovine Serum
FCS : Foetal Calf Serum
FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer FSH: Follicle-stimulating Hormone
GABA : γ-AminoButyric Acic GDP : Guanosine DiPhosphate GEF: GTP/GDP Exchange Factor GFP : Green Fluorescent Protein Gp120: GlycoProtein 120
GPCR : G-Protein Coupled Receptor GPR50: G protein-coupled receptor 50 GRK : G-protein Receptor Kinase GTP : Guanosine TriPhosphate HCC: Hemofiltrate CC Chemokine HCG: Human chorionic gonadotropin HEK : Human Embryonic Kidney HELA: Henrietta Lacks cells
HL60: Human promyelocytic Leukemia cells 60 IL: InterLeukine
IP3 : Inositol 1,4,5-triPhosphate KOP: Kappa Opioid Receptor LH: Luteinizing Hormone
MAP-Kinase : Mitogen Activated Protein Kinase MC1: MelanoCortin
MCP : Monocyte Chemotactic Protein
mGluR: metabotropic Glutamate Receptors MIF: Migration Inhibitory Factor
MIP : Macrophage Inflammatory Protein MOP : Mu Opioid Receptor
MSH: Melanocortin Stimulating Factor NK: Natural Killer
PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cell PBS : Phosphate Buffer Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PIP2 : Phosphatidyl Inositol 4,5-diPhosphate PKA : Protéine Kinase A
PKC : Protéine Kinase C
RAMP: Receptor Activity-Modifying Protein
RANTES : Regulatory upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted RET: Resonance Energy Transfer
Rluc : Renilla luciferase rpm : Rotation Par Minute
SDF : Stromal cell Derived Factor
TAK-779 : N,N-Dimethyl-N-[4-[[[2-(4-methylphenyl)-6,7-dihydro-5H-benzohepten-8- yl]carbonyl]amino]benzyl]tetrahydro-2H-pyran-4-aminium
T1R1: Taste Receptor 1
TM: segment TransMembranaire TSH : Thyroid Stimulating Hormone VIH : Virus d’Immunodéficience Humaine WT : Wild Type
YFP : Yellow Fluorescent Protei
1. INTRODUCTION
1.1. Les récepteurs couplés aux protéines G
1.1.1. Généralités
L’activité de toute cellule est régulée par des signaux extracellulaires transmis à l’intérieur de la cellule via différentes classes de récepteurs, dont la grande majorité appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs). Les GPCRs constituent une famille structurale de protéines présentes dans tout le règne animal. Plus de 800 gènes codent pour ces récepteurs (Lander et al., 2001;Venter et al., 2001), et occupent environ 3% du génome humain.
Les GPCRs sont responsables de la sensibilité des cellules à une grande variété de stimuli extracellulaires, allant des photons à des macromolécules comme des hormones glycoprotéiques et des protéases, en passant par des dérivés d’acides aminés, des peptides, des lipides, des nucléotides, des ions… et sont donc impliqués dans de nombreux phénomènes physiologiques et pathologiques (Bockaert and Pin, 1999). A l’heure actuelle, ces récepteurs constituent la cible de 26% des agents thérapeutiques (Klabunde and Hessler, 2002) et beaucoup de récepteurs découverts lors des dix dernières années, incluant la plupart des récepteurs aux chimiokines, ont été incorporés dans des programmes de recherche de nouvelles molécules à intérêt thérapeutique (Johnson et al., 2004;Proudfoot, 2002).
1.1.2. Structure des GPCRs
Etant donné l’énorme intérêt de cette famille de récepteurs en thérapeutique humaine, de nombreuses études ont eu pour objectif de comprendre la structure tridimensionnelle de ces protéines, ainsi que les relations reliant leur structure et leur fonction. La seule structure de GPCR connue à l’heure actuelle est celle de la rhodopsine bovine (Li et al., 2004;Okada and Nakamichi, 2004;Okada et al., 2004;Palczewski et al., 2000).
Des comparaisons de séquence entre les GPCRs montrent l’existence de différentes familles qui ne partagent pas d’homologie évidente. Toutefois, tous les GPCRs sont caractérisés par une structure générale commune. Celle-ci est constituée par sept segments transmembranaires hydrophobes, formant le noyau central du GPCR. Ces segments transmembranaires sont reliés entre eux par des boucles hydrophiles de tailles variables, et portent à leurs extrémités, d’une part un domaine N-terminal extracellulaire, et d’autre part, un domaine C-terminal intracellulaire (Figure 1). Chaque segment transmembranaire est composé de 20 à 25 résidus. Il a été estimé que les surfaces extracellulaire et intracellulaire du faisceau d’hélices transmembranaires de la rhodopsine bovine, modèle structurel de tous les GPCRs, couvraient respectivement une surface de 42 x 20 Ǻ et 31 x 22 Ǻ (Unger and Schertler, 1995).
Une autre caractéristique commune de tous les GPCRs est la présence de deux cystéines, situées au niveau de la première et de la seconde boucles extracellulaires. Ces cystéines forment un pont disulfure important pour la structure tridimensionnelle et la stabilisation de la conformation des sept segments transmembranaires. Outre les variations de séquences, les GPCRs diffèrent de par la taille des domaines N-terminaux, C-terminaux, et des boucles intracellulaires, leur conférant ainsi des propriétés spécifiques.
1.1.3. activation des GPCRs et transduction du signal
Les sept segments transmembranaires forment un faisceau d’hélices étroitement associées, et un changement de conformation au sein de ces segments est probablement responsable de l’activation de ces récepteurs. De manière générale, le modèle accepté à l’heure actuelle est que la liaison d’un agoniste au récepteur entraîne son activation, consistant en une ouverture du domaine cytosolique. Ce réarrangement conformationnel des hélices composant les domaines transmembranaires résulte d’un mouvement vers l’extérieur de la sixième hélice transmembranaire d’environ 8 Ǻ et des TM3 et TM7 de 2 à 3 Ǻ (Altenbach et al., 2001;Farrens et al., 1996), ce qui a pour conséquence de découvrir les sites de liaison des protéines G hétérotrimériques. En effet, les changements d’orientation des segments transmembranaires ont pour effet d’affecter la conformation de la deuxième et de la
troisième boucles intracellulaires, respectivement liées à TM3 et TM6, qui constituent des sites clés dans la reconnaissance et l’activation des protéines G hétérotrimériques (Figure 2).
L’activation des GPCRs par leur ligand initie alors des cascades de signalisation intracellulaire très variées. La majeure partie des réponses physiologiques qui sont observées suite à l’activation de ces récepteurs passe par leur interaction avec des protéines qui lient des nucléotides guanyliques (protéines G).
Une autre caractéristique commune de tous les GPCRs est donc que l’initialisation de la cascade de transduction du signal se produit en réponse à l’interaction avec les protéines G hétérotrimériques. L’activation des protéines G hétérotrimériques consiste en la catalyse de la réaction d’échange du GDP, lié à la sous-unité , pour du GTP (activité GEF, pour
« guanosyl nucleotide exchange factor ») (Lefkowitz et al., 1993). La liaison de GTP par la sous-unité entraîne sa dissociation des sous-unités d’une part et du GPCR d’autre part.
La sous-unité -GTP et le dimère stable libérés du GPCR peuvent tous deux transmettre le signal à leurs protéines effectrices (Figure 3).
Les GPCRs peuvent être grossièrement classés en fonction du type de sous-unité G qu’ils sont capables d’activer. En effet, les protéines G se distinguent les unes des autres par leur sous-unité α, qui leur confèrent leur spécificité dans la transduction du signal. On peut classifier les protéines G selon la propension de leur sous-unité α à moduler l’action de tel ou tel effecteur (Figure 4). Les protéines de la famille G s et G olf activent les adénylyl cyclases (AC), enzymes catalysant la production d’AMPc à partir d’ATP, alors que les protéines de la famille G i, comprenant les sous-unités αi et αo jouent un rôle d’inhibition sur ces mêmes enzymes. Les protéines de la famille G q, qui comprennent notamment les sous-unité αq, α11 et α16 stimulent les phospholipases C, enzymes responsables de l’hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (ou PIP2) en 1,4,5-triphosphate (ou IP3), messager secondaire provoquant le libération de calcium des compartiments de stockage intracellulaires, et en diacylglysérol (ou DAG). Enfin, la famille des protéines G12 et G13
activent les facteurs d’échange de GTP associés à la protéine Rho (Table 1).
Certains GPCRs de la même classe agissent sur différentes protéines G. Par exemple, les récepteurs muscariniques à l’acétylcholine M1, M3 et M5 lient les protéines Gq/11, alors
que les récepteurs M2 et M4 agissent sur les protéines Gi/Go (Berstein et al., 1992;Parker et al., 1991;Smrcka et al., 1991). Il existe également, pour des GPCRs qui activent une classe de protéines G, des couplages préférentiels. Par exemple, le récepteur C5a possède un couplage Gα16 préférentiel par rapport à tous les autres membres de la famille Gαq (Lee et al., 1995). De plus, il existe des récepteurs qui sont naturellement couplés à différentes protéines G. Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (LH/CG,FSH, TSH) stimulent –avec une efficacité variable - à la fois la production d’AMPc et d’inositol phosphate via leur interaction avec les protéines Gs et Gq (Kosugi et al., 1992;Segaloff and Ascoli, 1993;Van Sande et al., 1990).
1.1.4. Familles structurelles de GPCRs
Les récepteurs couplés aux protéines G sont subdivisés en six familles, dont trois majeures. Ces trois familles incluent les récepteurs apparentés à la rhodopsine et au récepteur 2-adrénergique (famille 1 ou A), les récepteurs apparentés aux récepteurs au glucagon (famille 2 ou B) et la famille des récepteurs métabotropiques (famille 3 ou C) (Figure 5).
Ces familles de GPCRs se différencient à plusieurs niveaux, tels que la similarité de séquence, l’organisation des extrémités amino- et carboxy-terminales et la taille des boucles intracellulaires et extracellulaires.
1.1.4.1. Famille 1 ou A
La famille 1 (ou A), qui compte environ 150 membres connus, est la famille la plus nombreuse et la mieux étudiée de récepteurs couplés aux protéines G. Cette famille regroupe les récepteurs activés par des photons, des neurotransmetteurs, des amines biogènes tels les catécholamines et l’histamine, ou des ligands peptidiques. Elle comporte notamment 26 récepteurs aminergiques, plus de 50 récepteurs peptidiques et 80 récepteurs orphelins (Gether, 2000) et est caractérisée par des extrémités COOH et NH2 de longueur variable.
D’un point de vue phylogénétique, la famille 1 peut être divisée en 5 à 6 sous- groupes, selon les auteurs (Bockaert and Pin, 1999;Gether, 2000). Le sous-groupe 1a est
constitué de récepteurs répondant à de petits ligands et dont le site de liaison est situé dans une cavité formée par les segments transmembranaires 2, 3, 5 et 6. Le sous-groupe 1b, quant à lui, inclut les récepteurs aux peptides dont les sites de liaison impliquent l’extrémité amino- terminale et les boucles extracellulaires en plus de la partie extérieure du faisceau d’hélices transmembranaires, alors que le sous-groupe 1c reprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques tels le FSH, LH et TSH, dont les sites de contact au ligand se situent au niveau du grand domaine amino-terminal.
L’homologie de séquence au sein de cette famille est réduite à un certain nombre de résidus conservés, notamment des prolines situées au niveau des segments transmembranaires. La conservation de tels résidus suggère qu’ils jouent un rôle clé soit dans l’organisation, soit dans la fonctionnalité du récepteur. Le seul résidu conservé au sein de toute la famille est l’arginine du motif DRY, situé au niveau à l’extrémité cytosolique du TM3 (Kolakowski, Jr., 1994;Probst et al., 1992).
1.1.4.2. Famille 2 ou B
La famille 2 (ou B), composée de plus ou moins 20 membres, est activée par des neuropeptides tels la calcitonine, le peptide vasoactif intestinal, la parathormone et le glucagon. Outre le pont disulfure reliant la seconde et la troisième boucles extracellulaires, la famille 2 ne partage pas de caractéristiques structurelles intrinsèques avec la famille 1 (Kolakowski, Jr., 1994). La famille 2 ne possède pas de motif DRY et les prolines conservées de la famille 2 ne sont pas les mêmes que celles de la famille 1.
La caractéristique la plus marquée de la famille B est un domaine N-terminal particulièrement long, d’environ 100 résidus, et la présence d’au moins 6 cystéines conservées formant un réseau permettant la formation de pont disulfures importants dans le maintien de la structure de ces récepteurs (Ulrich et al., 1998). Le domaine amino-terminal des récepteurs de la famille B joue un grand rôle dans la liaison de ces peptides (Pantaloni et al., 1996).
1.1.4.3. Famille 3 ou C
La famille 3 (ou C) comprend les récepteurs liant le glutamate, neurotransmetteur excitatoire majeur du système nerveux central. Elle comprend également les récepteurs aux phéromones (Bargmann, 1997) ainsi que les récepteurs à l’acide -amino butyrique (GABA).
Tous ces récepteurs sont caractérisés par un très grand domaine extracellulaire, d’une taille allant de 500 à 800 acides aminés et une extrémité COOH de longueur variable. La famille C a, comme les familles A et B, deux cystéines formant un pont disulfure entre les boucles extracellulaires 2 et 3. Outre cette similarité, la famille C ne possède aucun résidu conservé avec les autres familles de GPCRs. La structure tridimensionnelle de l’extrémité aminoterminale du récepteur métabotropique au glutamate a été résolue et a permis de montrer une structure en dimère (Kunishima et al., 2000). Ce domaine peut s’organiser en trois conformations différentes, deux conformations libres I et II et une forme complexée avec le ligand. Outre la présence du ligand, la conformation de la forme libre II est équivalente à celle de la forme complexée, alors qu’elle est totalement différente de la forme libre I. Chaque monomère est formé de deux domaines reliés par trois boucles courtes. Les monomères sont reliés entre eux par un pont disulfure et leur interface est constituée par une hélice. La conformation des domaines des monomères contrôle l’activité du récepteur (Jingami et al., 2003;Kunishima et al., 2000;Parmentier et al., 2002).
Cette famille est représentée par au moins 8 récepteurs mGLU et 2 récepteurs GABA.
Bien que les récepteurs au calcium aient une faible similarité de séquence avec les récepteurs au glutamate (18-24%), ils partagent avec ces derniers certaines similarités et sont donc inclus dans cette famille (Brown et al., 1993).
1.1.4.4. Autres familles
D’autres familles, qui comprennent des récepteurs non mammaliens tels les récepteurs aux phéromones STE2 et STE3, ainsi que les récepteurs à l’AMPc pourraient aussi être inclus dans la famille des GPCRs (Kolakowski, Jr., 1994), mais aussi les récepteurs de type « frizzled » et « smoothened », impliqués dans le développement embryonaire des invertébrés et des vertébrés.
1.1.5. mécanismes de régulation des GPCRs
La signalisation d’un GPCR peut être atténuée rapidement par deux mécanismes de désensibilisation, la désensibilisation homologue, impliquant des kinases spécifiques du récepteur (GRKs), et la désensibilisation hétérologue, qui réfère à un processus où l’activation induite par le ligand d’un récepteur résulte en la désensibilisation d’un ou de plusieurs autres récepteurs par des kinases comme les PKA ou PKC. La désensibilisation d’un récepteur se déroule dans les secondes à minutes suivant son exposition à un ligand. La diminution d’efficacité de signalisation est la conséquence du découplage du récepteur et de la protéine G suite à sa phosphorylation et la liaison de protéines comme les arrestines (Honczarenko et al., 2002).
L’internalisation du récepteur peut résulter en une down-régulation du récepteur qui intervient après une stimulation prolongée et répétée, afin de protéger les cellules des effets délétaires liés à l’activité chronique du récepteur. Cette régulation négative fait appel à différents mécanismes dont la diminution de synthèse du récepteur impliqué, sa séquestration ou encore sa dégradation par les lysosomes.
1.2. Les chimiokines et leurs récepteurs
1.2.1. Généralités
Les chimiokines constituent une famille structurale de cytokines chimiotactiques et souvent pro-inflammatoires. Elles forment la plus grande famille de protéines qui orchestrent les processus immunologiques et inflammatoires. Cette famille de protéines est constituée de plus de 50 membres (Horuk, 2001), dont la taille varie entre 8 et 10 kDa. Elles sont produites de manière abondante au niveau des sites d’inflammation, et contrôlent l’activation et le chimiotactisme des monocytes, lymphocytes, NK, basophiles, éosinophiles et neutrophile (Mackay, 2001). Les chimiokines dirigent donc la migration cellulaire, vers les sites inflammatoires, entre les compartiments intra- et extra-vasculaires, et vers les organes lymphoïdes. En plus des rôles d’activation, de chimiotaxie, et de homing cellulaire, certaines
chimiokines jouent un rôle dans l’angiogenèse, l’embryogenèse, le développement des lymphocytes et l’hématopoïèse (Honczarenko et al., 2002).
1.2.2. Classifications structurale et fonctionnelle
1.2.2.1. Classification structuraleLa famille des chimiokines est caractérisée par la conservation de 4 cystéines. Leurs membres sont répertoriés, structurellement, en deux sous-familles majeures, les CXC- chimiokines (Table 3) et les CC-chimiokines (Table 4), selon qu’un acide aminé sépare ou non les deux premières cystéines amino-terminales (Rollins, 1997), et deux familles mineures, les C-chimiokines et les CX3C-chimiokines (Baggiolini, 1998).
Des études de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et de cristallographie par rayons X ont donné lieu à des structures de haute résolution pour un certain nombre de chimiokines, révélant une structure conservée au sein des différentes sous-familles (Baldwin et al., 1991;Chung et al., 1995;Clore et al., 1990;Crump et al., 1997;Handel and Domaille, 1996;Lodi et al., 1994;Mizoue et al., 1999;Shao et al., 1998). Cette structure conservée est composée de trois feuillets antiparallèles recouverts sur une face par une hélice C- terminale et précédés par une extrémité N-terminale non ordonnée.
Les CXC-chimiokines peuvent être divisées en CXC-chimiokines ELR+ et ELR- selon qu’elles possèdent ou non une séquence glu-leu-arg en amont de la première cystéine. Les CXC-chimiokines ELR+ ont pour rôle principal de promouvoir l’adhérence des neutrophiles aux cellules endothéliales et donc leur migration vers des sites inflammatoires. Cette famille de chimiokines possède aussi un rôle préangiogénique tandis que les CXC-chimiokines ELR- jouent un rôle angiostatique et ont une tendance à attirer les lymphocytes T et les monocytes.
Les CC-chimiokines possèdent une activité chimio-attractante sur les lymphocytes, monocytes, éosinophiles et basophiles. Les CC-chimiokines sont subdivisées en 5 sous- groupes, qui sont fonction des réponses induites et/ou des similarités de séquences entre leurs différents membres. Il est bien connu que les CC-chimiokines sont capables de former des
homo et hétérodimères (Clore et al., 1990). Cependant, il est généralement accepté que seuls les monomères de chimiokines sont capables de lier et d’activer leur(s) récepteur(s) (Gong and Clark-Lewis, 1995;Gong et al., 1996;Paavola et al., 1998).
De manière intéressante, l’interface de contact au sein de telles structures dimériques est différente pour les CC-chimiokines et les CXC-chimiokines. Alors que la dimérisation des CC-chimiokines implique le domaine N-terminal, de telle manière que ce dernier est enfoui dans le feuillet de l’autre protomère, les CXC-chimiokines interagissent au niveau du feuillet 1, laissant le domaine N-terminal accessible (Clore and Gronenborn, 1995).
Il existe deux chimiokines n’appartenant ni à la sous-famille CC, ni à la CXC. Il s’agit d’une part, de la lymphotactine, seul membre de la famille des C-chimiokines et qui ne possède pas les cystéines 1 et 3. Elle joue un rôle d’agent chimioattractant pour les lymphocytes T et les cellules NK. D’autre part, la fractalkine, seul membre de la famille des CX3C-chimiokines, possède trois résidus entre les deux premières cystéines conservées. Elle joue un rôle chimioattractant pour les lymphocytes T et les monocytes.
1.2.2.2. Classification fonctionnelle
Les chimiokines peuvent également être classifiées selon leur profil d’expression et leur fonction. La classification fonctionnelle subdivise les chimiokines en deux groupes : les chimiokines inflammatoires et les chimiokines constitutives (ou homéostatiques). La sécrétion des chimiokines inflammatoires est inductible. Elles jouent normalement un rôle dans l’immunité innée, c'est-à-dire la défense de l’organisme face à un agent pathogène rencontré pour la première fois, ainsi que dans l’inflammation. Les chimiokines inflammatoires sont exprimées dans les tissus enflammés par les cellules épithéliales ou stromales, ainsi que par les leucocytes résidents ou recrutés. Les chimiokines constitutives, quant à elles, sont exprimées de manières constitutives dans des microenvironnements tels les tissus lymphoïdes ou certaines muqueuses. Le rôle de ces chimiokines est de réguler le trafic physiologique des cellules immunitaires durant l’hématopoïèse, la présentation d’antigènes au niveau des organes lymphoïdes secondaires et au cours de l’immuno- surveillance.
1.2.3. Interactions entre les chimiokines et leurs récepteurs
Les effets biologiques des chimiokines passent par leurs interactions avec les récepteurs couplés aux protéines G (Table 2). Les récepteurs aux chimiokines constituent une sous-famille de la classe A des GPCRs, et ont été caractérisés, à l’heure actuelle, 19 récepteurs humains aux chimiokines : sept membres de la famille CXCR, dix de la famille CCR et un seul pour les familles XCR et CX3CR (Murphy et al., 2000). A ce jour, on a mis en évidence des séquences « chemoreceptor-like » chez les mammifères, les oiseaux (Gupta et al., 1998b) et les poissons (Daniels et al., 1999) mais pas chez les invertébrés, les levures ou les plantes. Ceci suggère donc une origine relativement récente de cette famille de protéines dans l’évolution. Les récepteurs aux chimiokines sont classés en fonction des chimiokines qu’ils lient (CCR, CXCR, CX3CR et CR) et jouent un rôle essentiel dans le trafic des leucocytes et leur recrutement vers les sites inflammatoires. Ils sont dès lors impliqués dans la physiopathologie de virtuellement toutes les maladies inflammatoires. Ils jouent également un rôle central dans l’infection par le VIH (Garzino-Demo et al., 2000;Littman, 1998), ce, plus particulièrement via les récepteurs CXCR4 et CCR5 (Alkhatib et al., 1996;Berger et al., 1999;Deng et al., 1996;Doranz et al., 1996). Les récepteurs aux chimiokines sont généralement couplés aux protéines Gi. Ils inhibent l’adénylate cyclase, stimulent la mobilisation de calcium, les voies des MAP kinases, le chimiotactisme et le remodelage du cytosquelette d’actine.
Comme tous les autres GPCRs, ils possèdent sept segments transmembranaires, trois boucles intracellulaires, trois boucles extracellulaires, un domaine N-terminal et un domaine C-terminal (Gether, 2000). La plupart des récepteurs de la classe A possède deux cystéines conservées formant un pont disulfure entre les première et deuxième boucles extracellulaires.
Les récepteurs aux chimiokines possèdent deux cystéines supplémentaires formant un second pont disulfure entre le domaine N-terminal et la troisième boucle extracellulaire. Ces deux ponts disulfure apparaissent nécessaires pour leur repliement du récepteur, la liaison de leur ligand et/ou leur capacité à activer les cascades intracellulaires (Ai and Liao, 2002;Blanpain et al., 1999b;Tournamille et al., 1997). De plus, les récepteurs aux chimiokines possèdent un segment amino-terminal riche en résidus acides et tyrosines sulfatées, une troisième boucle
intracellulaire courte et basique et un motif DRYLAIVHA relativement conservé au niveau de la deuxième boucle intracellulaire.
Des études de mutagenèse ont montré que la liaison des chimiokines à leur(s) récepteur(s) implique la boucle N, qui se situe après la première cystéine conservée. Pour certaines chimiokines, le segment N-terminal est aussi important pour la liaison, mais il est toujours essentiel à l’activation du récepteur (Blanpain et al., 2001;Blanpain et al., 2003;Bondue et al., 2002;Laurence et al., 2001;Mayer and Stone, 2001;Pakianathan et al., 1997;Wells et al., 1995). La troncation du domaine N-terminal non structuré des chimiokines génère souvent des antagonistes ou des agonistes partiels, illustrant le rôle de ce domaine dans l’activation des récepteurs (Arenzana-Seisdedos et al., 1996;Clark-Lewis et al., 2003;Gong and Clark-Lewis, 1995;Wells et al., 1995). Diverses expériences de mutagénèse sur les récepteurs aux chimiokines ont ainsi montré que la seconde boucle extracellulaire de CCR2, de CCR5 et d’autres CC-récepteurs joue un rôle essentiel dans la spécificité d’interaction avec les CC-chimiokines (Blanpain et al., 1999b;Han et al., 1999;Samson et al., 1997). D’autres études, utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre cette même boucle extracellulaire, montrent une inhibition de la liaison des ligands par ces anticorps (Blanpain et al., 2003;Lee et al., 1999). Un certain nombre d’acides aminés et de tyrosines sulfatées localisées au niveau du domaine N-terminal des récepteurs contribuent également à la haute affinité de liaison des chimiokines (Blanpain et al., 1999a;Farzan et al., 1999;Fong et al., 2002).
De manière générale, les études disponibles convergent vers un modèle selon lequel le domaine structuré des chimiokines lie l’extrémité N-terminale et les boucles extracellulaires des récepteurs, alors que le peptide N-terminal de la chimiokine interagit avec le faisceau d’hélices et est impliqué dans l’activation du récepteur.
Outre leurs interactions avec les récepteurs aux chimiokines, les chimiokines ont une propension à interagir avec haute affinité avec des glycosaminoglycanes de la matrice extracellulaire. Il a été proposé que ces liaisons, soit à la surface des cellules endothéliales, soit au niveau de la matrice extracellulaire, pourraient servir à établir un gradient immobilisé de chimiokines et à présenter les chimiokines aux leucocytes in vivo, facilitant ainsi leurs
interactions fonctionnelles avec leurs récepteurs, ce qui permettrait d’augmenter leur bioactivité (Ali et al., 2000).
Lors de cette thèse de doctorat, nous allons plus particulièrement étudier trois récepteurs aux chimiokines, à savoir CCR2, CCR5 et CXCR4.
1.2.4. Le récepteur CCR2
Le récepteur aux chimiokines CCR2 est un membre de la famille des récepteurs aux CC-chimiokines qui lie les chimiokines MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), MCP-3 (CCL8) et MCP-4 (CCL13) (Jiang et al., 1992). MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) est une chimiokine de 76 acides aminés qui régule l’expression de molécules d’adhésion et la production de cytokines par les monocytes (Jiang et al., 1992).
CCR2 est exprimé par les lymphocytes T mémoires ainsi que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (Frade et al., 1997;Murphy et al., 2000;Nilsson et al., 1999;Rabin et al., 1999). Ce récepteur joue un rôle important dans le recrutement de monocytes dans les lésions athérosclérotiques et dans l’hyperplasie intimale secondaire à une lésion artérielle (Boring et al., 1998;Charo and Taubman, 2004).
Il existe deux isoformes du récepteur CCR2, générées par splicing alternatif, et qui diffèrent l’une de l’autre par leur extrémité C-terminale. CCR2b, le variant le plus long, est le seul fortement exprimé par les leucocytes.
La spécificité de liaison de ligands à CCR2 est portée par les domaines extracellulaires et, plus particulièrement la deuxième boucle extracellulaire (Samson et al., 1997).
Un mutant de CCR2, CCR2V64I, a été associé à une progression retardée du VIH (Smith et al., 1997). Le rôle protecteur de ce mutant est probablement la conséquence de liaisons génétiques entre CCR2 et CCR5, localisés à 17 kb l’un de l’autre sur le chromosome
3p21, et sa contribution aux haplotypes comprenant des polymorphismes de séquence au niveau du promoteur de CCR5, résultant en une expression plus faible de CCR5 (Gonzalez et al., 1999;Martin et al., 1998;Martinson et al., 2000;Winkler et al., 2004).
1.2.5. Le récepteur CCR5
C’est en 1996 qu’un second récepteur pour la chimiokine MIP-1 a été cloné. Ce récepteur, de 352 acides aminés et d’un poids moléculaire prédit de 40,6 kDa, était le cinquième récepteur de CC-chimiokines cloné et a donc été appelé CCR5. Le récepteur CCR5 partage avec CCR2 environ 75% d’identité sur la totalité de la séquence. Si l’on considère uniquement les segments transmembranaires, on atteint 91% d’identité (Springael et al., 2006).
Le récepteur CCR5 lie les chimiokines MIP-1 (CCL3), MIP-1 (CCL4), RANTES (CCL5), HCC1 (CCL14) et MCP-2 (CCL8). MCP-2 se lie également au récepteur CCR2, étudié également dans ce travail. MCP-3 se lie à CCR5 avec une bonne affinité mais ne l'active pas, et peut dès lors être considéré comme un antagoniste naturel de ce récepteur (Blanpain et al., 1999c;Detheux et al., 2000;Gong et al., 1996).
CCR5 est exprimé par les monocytes, macrophages, lymphocytes T CD4+, CD8+, mémoire, les lymphocytes B, les cellules NK, les cellules dendritiques. Son expression a aussi été décrite dans les neurones, les astrocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales des capillaires et les cellules musculaires lisses (Murphy et al., 2000;Rabin et al., 1999;Rottman et al., 1997;Ruiz et al., 1998;Zaitseva et al., 1997;Zaitseva et al., 1998).
Tout comme pour CCR2, la spécificité de liaison de ses ligands est située au niveau des domaines extracellulaires et, plus particulièrement, au niveau de la deuxième boucle extracellulaire. (Samson et al., 1997). En plus de la deuxième boucle extracellulaire, certains résidus du domaine N-terminal semblent avoir une importance capitale dans cette liaison (Farzan et al., 1999;Zhou et al., 2000).
CCR5 joue un rôle dans le recrutement des leucocytes dans des pathologies telles l’arthrite rhumatoïde, certaines maladies neurodégénératives et le rejet de greffes. Il constitue également le co-récepteur majeur pour la souches macrophage-tropiques du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). En effet, CCR5, en coopération avec le récepteur CD4, permet l’entrée du VIH dans la cellule. Le VIH y entre par fusion directe entre la membrane du virus et la membrane plasmique de la cellule cible. Le mécanisme d’entrée requiert tout d’abord la liaison de la protéine d’enveloppe virale (Env) avec le CD4, La fusion entre le virus et la cellule cible est un processus séquentiel faisant intervenir des changements conformationnels multiples au sein de la protéine d’enveloppe du VIH. L'interaction entre la gp120 et CD4 induit un changement conformationnel de la gp120, qui expose, crée ou stabilise le déterminant qui permettra l'interaction avec le co-récepteur. L'interaction avec le co-récepteur induit un nouveau changement conformationnel dans la gp120 qui se dissocie de la gp41 et lui permet d’exposer et d’insérer son peptide de fusion au sein de la membrane plasmique de la cellule cible, entraînant la fusion des membranes (Berger et al., 1999;Gerard and Rollins, 2001).
La présence au niveau de la population humaine de gènes de CCR5 non fonctionnels et, plus particulièrement de l’allèle 32, qui code pour un variant tronqué du récepteur retenu dans les voies de sécrétion et procurant une résistance quasi complète au VIH, souligne l’importance de ce récepteur dans le mécanisme d’entrée du VIH (Dean et al., 1996;Liu et al., 1996;Michael et al., 1997;Samson et al., 1996;Smith et al., 1997).
Afin de réaliser notre étude, nous allons utiliser la chimiokine MIP-1β, purifiée initialement à partir de surnageants de macrophages murins stimulés à l’endotoxine (Wolpe et al., 1988). Le gène codant pour le MIP-1 humain, chimiokine étudiée lors de ce travail, est situé sur le chromosome 17 et est constitué de trois exons et deux introns (Menten et al., 2002). MIP-1 forme un homodimère symétrique dont chaque monomère est constitué de trois feuillets et une hélice (Lodi et al., 1994). MIP-1 joue un rôle d’agent chimioattractant pour les cellules NK (Loetscher et al., 1996;Taub et al., 1995), les cellules dendritiques immatures (Lin et al., 1998), et entraîne la mobilisation de calcium au niveau des plaquettes (Clemetson et al., 2000) et des cellules musculaires lisses (Schecter et al., 2000). De manière parallèle, nous avons utilisé le TAK-779, une molécule antagoniste de CCR2, CCR5 et CXCR3, qui a été initialement développée pour le traitement de l’infection
par le VIH en inhibant son interaction avec CCR5 (Shiraishi et al., 2000;Gao et al., 2003;Baba et al., 1999).
1.2.6. Le récepteur CXCR4
De manière générale, les chimiokines se lient souvent à plusieurs récepteurs et un récepteur lie plusieurs chimiokines. SDF-1 et CXCR4 étaient jusque récemment considérés comme une exception à la règle (Bagri et al., 2002;Broxmeyer et al., 2003;Horuk, 2001;Lu et al., 2005;Nagasawa et al., 1996;Schier, 2003;Strieter et al., 2006), car spécifiques l’un de l’autre. Toutefois, un nouveau récepteur, appelé RDC1 ou CXCR7, a été décrit comme liant SDF-1 (Balabanian et al., 2005;Sierro et al., 2007). De plus un nouveau ligand, le MIF (Migration Inhibitory Factor), qui lie à la fois CXCR2 et CXCR4, vient d’être mis en évidence, et semble jouer un rôle critique dans l’athérogenèse et certaines maladies inflammatoires (Bernhagen et al., 2007).
CXCR4 a été le premier co-récepteur identifié pour les souches T-tropiques du VIH-1 (Feng et al., 1996). Les souches capables d’utiliser CXCR4 pour leur entrée dans la cellule in vitro sont dénommées souches X4 (Berger et al., 1999). L’axe CXCR4-SDF-1 (CXCL12) joue un rôle critique dans la détermination de la destination métastatique des cellules tumorales dans le cancer du sein (Liotta, 2001;Thelen, 2001). Il apparaît également essentiel pendant les stades initiaux du développement des lymphocytes B. En effet, lorsque l’on transfère des cellules souches déficientes pour CXCR4 dans des souris WT, on observe une augmentation de cellules B progénitrices. Ceci suggère que l’axe CXCR4-SDF-1 est important pour le positionnement et la retention des cellules B progénitrices au niveau de la moëlle. De plus, la réponse à SDF-1 diminue au niveau des lymphocytes B matures, même si les niveaux d’expressions sont comparables à tous les stades de développement de ces cellules (Honczarenko et al., 2002).
SDF-1 est une CXC-chimiokine et constitue un agent chimioattractant des lymphocytes, des monocytes, des progéniteurs CD34+ et des cellules endothéliales (Aiuti et al., 1997;Bleul et al., 1996;Gupta et al., 1998a;Gupta et al., 1999). Elle est impliquée dans l’angiogenèse en induisant la formation de capillaires (Salcedo et al., 1999). Elle induit
l’arrêt du rolling des monocytes et stimule le flux calcique au sein des cellules (Campbell et al., 1998). Une des particularités de cette chimiokine est de se lier aux glycosaminoglycanes avec très haute affinité (Mbemba et al., 2000). Des études ont démontré que SDF-1 se lie sous forme monomérique à CXCR4 et que les huit premiers résidus sont importants dans cette liaison (Crump et al., 1997;Elisseeva et al., 2000).
Il a été suggéré que SDF-1 , outre le fait de réguler le traffic cellulaire, affecterait aussi la survie et la prolifération cellulaire (Kijowski et al., 2001;Strieter et al., 2006).
Certaines études montrent que SDF-1 pourrait augmenter la prolifération de cellules progénitrices myéloïdes (Broxmeyer et al., 2003). SDF-1 serait secrété par des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques et pourrait être impliqué dans la régulation autocrine/paracrine de leur développement et leur survie (Lataillade et al., 2002).
Contrairement aux autres chimiokines et récepteurs aux chimiokines, SDF-1 et CXCR4 sont très bien conservés entre les espèces (Moepps et al., 1997). Ceci a été mis en rapport avec le rôle fondamental de cet axe au cours du développement. En effet, un knock- out de l’axe SDF-1 /CXCR4 dans des souris entraine un phénotype léthal avec une lymphopoïèse B et une myélopoïèse déficientes, un développement cardiaque et neuronal anormal, ainsi qu’une vasculogenèse défectueuse (Nagasawa et al., 1996;Tachibana et al., 1998;Zou et al., 1998).
L’AMD-3100 est un bicyclame antagoniste du récepteur CXCR4 (Donzella et al., 1998;Schols et al., 1997). Il inhibite l’entrée des souches T-tropiques du VIH-1 (De Clercq et al., 1994). Il n’a pas d’effet sur le chimiotactisme et la réponse induite par MCP-3, MIP-1 et RANTES mais inhibe la réponse calcique induite par SDF-1α dans des cellules HL-60 et Jurkat(Gupta et al., 2001).
1.3. Le concept de dimérisation
1.3.1. Généralités
Depuis de nombreuses années, on considérait que les GPCRs existaient et agissaient sous forme monomérique. Le modèle généralement accepté était qu’une molécule de ligand se lie un seul GPCR monomérique, qui se couple ensuite à une protéine G hétérotrimérique à la fois. Cette hypothèse était compatible avec la majorité des données disponibles. Aussi, des études fonctionnelles utilisant des liposomes et des protéines purifiées montraient qu’une seule chaîne polypeptidique était capable de générer à la fois la fonction et la pharmacologie de récepteurs (Milligan, 2004). Il semble cependant difficile d’expliquer et de comprendre toutes les données pharmacologiques actuelles en utilisant ce paradigme.
La première fois que l’idée qu’un GPCR pouvait dimériser à été proposée dès 1982 par Agnati (Agnati et al., 1982). A l’initiation du présent travail, la dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G était encore un concept relativement nouveau et ses conséquences étaient peu comprises. A l’heure actuelle, de plus en plus de publications, utilisant des techniques de co-immunoprécipitation et de transfert d’énergie par résonance soutiennent le fait que la plupart, sinon tous les récepteurs couplés aux protéines G, sont capables d’homodimériser, voire même d’oligomériser (Hernanz-Falcon et al., 2004;Mellado et al., 2001;Milligan et al., 2003;Milligan, 2004;Percherancier et al., 2005;Pin et al., 2003;Rodriguez-Frade et al., 1999;Schulz et al., 2000;Springael et al., 2006;Springael et al., 2005;Urizar et al., 2005) (table 5). Des dimères et des oligomères ont également été observés dans des cellules intactes (Bouvier, 2001), et certaines études, ont montré le rôle essentiel de la dimérisation pour le traffic et la réponse fonctionnelle du récepteur (Kaupmann et al., 1998;White et al., 1998).
Il existe de plus en plus d’éléments supportant la dimérisation de GPCRs dès leur biosynthèse. La plupart des récepteurs de la famille A sont N-glycosylées et cette glycosylation intervient dans le « contrôle qualité » préalable à leur adressage vers l’appareil de Golgi. Il semblerait que pour les récepteurs GABAb de la famille C, cette N-glycosylation nécessite des interactions protéine-protéine qui impliquent la dimérisation de récepteurs
(White et al., 1998). Terrillon et al. a également montré que les formes immatures des récepteurs à l’oxytocine et à la vasopressine sont présents sous forme de dimères au niveau du réticulum endoplasmique (Terrillon et al., 2003). De plus, en ce qui concerne la dimérisaton du récepteur aux chimiokines CCR5, Issafras et al. ont été étudié par la technique de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) dans des cellules exprimant ce récepteur à des niveaux physiologiques. Un transfert d'énergie a été observé, en absence de ligands, dans les cellules entières, que ce soit au niveau de la membrane plasmique ou du reticulum endoplasmique. Aucun changement de signal BRET n'a été observé suite à la stimulation par un agoniste, ce qui sous-entend que l’oligomerization n’est pas dépendante de l’état d'activation du récepteur.
Deux modèles différents ont été décrits pour expliquer le concept de dimérisation de GPCRs : la dimérisation de contact et l’échange de domaines (Dean et al., 2001;Gouldson et al., 1998). Dans le modèle de dimérisation de contact, chaque polypeptide se replie de manière indépendante et contacte une autre unité grâce à des interactions impliquant certains segments transmembranaires (Liang et al., 2003). Dans le modèle dit d’échange de domaines, chaque unité fonctionnelle est composée des 5 premiers segments transmembranaires d’un des polypeptides et des deux derniers de l’autre. Dans ce modèle, la troisième boucle intracellulaire forme des liens covalents entre les deux protomères. Ce modèle a été mis sur pied pour expliquer les complémentations fonctionnelles observées quand deux mutants ou chimères étaient co-exprimés (Dean et al., 2001;Maggio et al., 1993;Monnot et al., 1996).
Par exemple quand deux chimères complémentaires des récepteurs muscarinique M3 et 2- adrénergique étaient exprimés de manière indépendante, aucune réponse fonctionnelle aux agonistes de chaque récepteur n’était observée, alors que la co-expression de ces mêmes chimères engendraient des réponses aux agonistes des deux récepteurs (Maggio et al., 1993).
Il est cependant difficile de généraliser ce modèle. Effectivement, des études similaires sur d’autres GPCRs n’ont pas permis de montrer que ce concept était généralement applicable (Breitwieser, 2004;Schulz et al., 2000). La plupart des études et observations faites dans le domaine de la dimérisation de récepteurs semble plutôt aller dans le sens du modèle de dimères de contact plutôt que dans celui qui implique l’échange de domaines.
1.3.2. Dimérisation des GPCRs
Le concept de dimérisation des GPCRs a mis du temps à faire son chemin, et les premiers arguments décisifs en faveur de ce concept découlent d’études sur les récepteurs GABAb. Le récepteur GABAb est composé de deux isoformes, GABAbR1 et GABAbR2, qui ne sont pas fonctionnelles lorsqu’elles sont exprimées seules (Jones et al., 1998;Kaupmann et al., 1998;Kuner et al., 1999). L’hétérodimérisation de ces deux isoformes masque un signal de rétention situé au niveau de l’extrémité C-terminale de GABAbR1, et permet au complexe d’atteindre la surface cellulaire en tant que récepteur fonctionnel (Pin et al., 2003). L’interaction entre les récepteurs GABAbr1, qui porte le site de liaison du GABA, et GABAbR2, qui est responsable de l’activation de la protéine G, est donc nécessaire pour générer un récepteur GABAb fonctionnel (Marshall et al., 1999;Mohler and Fritschy, 1999).
Il s’agit la, à ce jour, d’un des plus clairs exemples de dimère « obligatoire » en terme de fonctionnalité. D’autres exemples bien établis concernent les récepteurs au goût TIR2 et TIR3, et TIR1 et TIR3.
Outre les récepteurs GABA, la dimérisation des récepteurs adrénergiques a particulièrement été étudiée. Les études initiales de dimérisation du récepteur α1- adrénergique ont employé la co-immunoprécipitation des récepteurs taggés par différents épitopes (Milligan, 2004). Lorsque deux récepteurs α1-adrénergiques, taggés avec des epitopes différents, sont co-exprimés, l’immunoprécipitation avec un anticorps dirigé contre un des deux épitopes co-immunoprécipite le second récepteur (Carrillo et al., 2003;Stanasila et al., 2003;Uberti et al., 2003). Outre la technique d’immunoprécipitation, Stanasila et al.
ont utilisé des tags CFP ou YFP, fusionnés à l’extrémité C-terminale du récepteur α1- adrénergique et ont montré une dimérisation par la technique de FRET. Cette équipe a également montré que l’expression du récepteur α1-adrénergique non taggé dans les cellules, en plus des récepteurs taggés, induisait une diminution du signal FRET. Cette diminution n’était pas observée lorsque le récepteur CCR5 était co-exprimé avec les deux récepteurs taggés (Stanasila et al., 2003). Carrillo et al. ont utilisé une technique FRET basée sur l’utilisation d’anticorps anti-tags couplés aux bons fluorophores donneurs et accepteurs pour démontrer l’homodimérisation de récepteurs. Carrillo et al. a également développé une stratégie fonctionnelle. Cette équipe avait précédemment montré qu’une protéine de fusion entre le récepteur α1-adrénergique et la protéine G11 était fonctionnelle et pouvait être
utilisée pour mesurer la liaison, stimulée par un agoniste, de [S35]GTP S (Carrillo et al., 2002). Ils ont dès lors étendu cette étude et ont montré que la capacité de cette protéine fusionnée de lier le [S35]GTP S de manière ligand-dépendante pouvait être éliminée en introduisant une mutation ponctuelle dans la seconde boucle intracellulaire du récepteur ou en introduisant une mutation ponctuelle au sein de la protéine G. Lorsque ces deux protéines inactives sont co-exprimées, la réponse GTP S est restaurée, suggérant une complémentarité des deux protéines de fusion au sein du dimère (Carrillo et al., 2003).
Initialement, on pensait que les domaines C-terminaux (Cvejic and Devi, 1997) et N- terminaux (AbdAlla et al., 1999) jouaient un rôle clé dans l’homodimérisation de récepteurs de la famille A des GPCRs. Cependant, la majeure partie des travaux plus récents s’est concentrée sur la contribution des hélices transmembranaires dans ce phénomène. Il a été démontré que l’hélice TM1 jouait un rôle très important dans l’homodimérisation du récepteur 1-adrénergique (Carrillo et al., 2003;Stanasila et al., 2003), que l’hélice TM6 était impliquée dans l’homodimérisation des récepteurs 2-adrénergique (Hebert et al., 1996) et dopaminergiques D2, alors que TM7 jouait un rôle pour le récepteur D2 mais pas pour les récepteurs D1 et 5HT1B (Ng et al., 1996). De telles différences pourraient simplement refléter le fait qu’il existe de multiples points de contact requis pour l’organisation oligomérique. En effet, la démonstration de la nécessité de plusieurs points de contact dans les interactions entre GPCRs a été fournie par l’étude en microscopie de force atomique de la rhodopsine in situ (Liang et al., 2003). Dans ce cas précis, les contacts intrahomodimériques semblent impliquer les quatrième et cinquième hélices transmembranaires.
Etant donné que la plupart des études ne peuvent discriminer l’existence de complexes dimériques ou oligomériques, les données suggérant l’implication de différents segments transmembranaires ne sont pas nécessairement incompatibles. Par exemple, bien que des expériences de compétition par peptides suggèrent un rôle des TM6 et TM7 dans l’homodimérisation du récepteur D2, des données plus récentes de cross-linking de cystéines montrent une importance de TM4 dans ce phénomène (Guo et al., 2003). Aussi, il a été montré par des expériences de docking de protéines et de modélisation moléculaire, que les cystéines 112 et 145, localisées respectivement au niveau des TM3 et TM4 de l’homodimère constitutif du récepteur 5HT4 jouent un rôle dans la formation d’un pont disulfure crucial dans la formation du dimère (Berthouze et al., 2007). La diversité de données actuellement
disponibles pourrait suggérer qu’il n’existe pas de mécanisme commun capable d’expliquer l’homodimérisation des GPCRs. Une étude récente montre, en utilisant une technique d’imaging FRET séquentiel à trois composantes (YFP,CFP, DsRED2), que le récepteur α1b- adrénergique forme des oligomères plutôt que des dimères. La perturbation de la formation d’oligomères, en introduisant des mutations au niveau du TM4, entraîne des conséquences négatives pour l’adressage en surface et la fonction de ce récepteur (Lopez-Gimenez et al., 2007).
En ce qui concerne l’hétérodimérisation (Table 6, Table 7), les bases moléculaires de la sélectivité des interactions entre GPCRs différents est mal comprise. L’hypothèse la plus simple serait que plus les récepteurs sont homologues, plus il y a de chances qu’ils forment des hétérodimères. Par exemple, les récepteurs 1 et 2 adrénergiques forment des hétérodimères avec la même efficacité que des homodimères (Mercier et al., 2002). Il en est de même pour les récepteurs opioïdes KOP et DOP, qui hétérodimérisent avec la même
« affinité » que l’homodimérisation de KOP (Ramsay et al., 2002). Par ailleurs, les récepteurs adrénergiques 1a et 1d, très apparentés, sont incapables de dimériser (Uberti et al., 2003). De plus, des études de co-immunoprécipitation montrent que certains récepteurs ont une grande capacité à hétérodimériser. Par exemple, il a été montré que le récepteur 5HT1A forme des complexes avec tous les récepteurs avec lesquels il a été co-exprimé (Salim et al., 2002). Des récepteurs très différents peuvent aussi dimériser. Ainsi, des récepteurs des familles A et C, ne partageant pas d’homologie de séquence, tels les récepteurs A2A et mglur5, sont capables de former des complexes hétérodimériques (Ferre et al., 2002).
1.3.4. Dimérisation des récepteurs aux chimiokines
1.3.4.1. GénéralitésJusqu’à ce jour, la dimérisation de récepteurs aux chimiokines a été démontrée pour seulement 4 récepteurs, à savoir CCR2, CCR5, CXCR2 et CXCR4, grâce aux techniques de co-immunoprécipitation, FRET et BRET. Il a été effectivement démontré, par cette technique, que CCR2 et CXCR4 (Babcock et al., 2003;Issafras et al., 2002;Mellado et al., 2001;Percherancier et al., 2005;Rodriguez-Frade et al., 1999;Vila-Coro et al., 1999)
formaient des homodimères et que CXCR4 formait des hétérodimères avec CCR5 (Sohy et al., 2007) et CCR2 (Babcock et al., 2003;Breitwieser, 2004;Percherancier et al., 2005). Les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 sont également capables de former des homo- oligomères (Issafras et al., 2002;Rodriguez-Frade et al., 1999;Vila-Coro et al., 2000), et des hétérodimères (Benkirane et al., 1997;El Asmar et al., 2005;Hernanz-Falcon et al., 2004;Issafras et al., 2002;Mellado et al., 2001;Percherancier et al., 2005).
Les récepteurs aux chimiokines peuvent également former des hétérodimères voire des hétéro-oligomères avec d’autres récepteurs, n’appartenant pas à la sous-famille des récepteurs aux chimiokines. Ainsi, il a été montré que le récepteur CXCR2 pouvait former des complexes avec le récepteur AMPA et que les récepteurs CXCR4 et CCR5, quant à eux, dimérisaient/oligomérisaient avec certains membres de la famille des récepteurs opioïdes {Chen, 2004 60 /id;Limatola, 2003 235 /id;Suzuki, 2002 236 /id;Toth, 2004 276 /id;Trettel, 2003 234 /id}.
1.3.4.2. Rôle du ligand
Des expériences par BRET montrent, pour CCR5, que l’association sous forme de dimères se déroule peu après la synthèse, au niveau du reticulum endoplasmique (Issafras et al., 2002). Cette observation est en accord avec d’autres études concernant d’autres classes de récepteurs, tels les récepteurs GABAbR1 et GABAbR2 dont la dimérisation est requise pour former le récepteur GABAb fonctionnel et son adressage en surface. Il faut également soulever le fait que, si la dimérisation se déroule peu après la synthèse et surtout avant le trafic des récepteurs vers la membrane plasmique, la contribution des ligands dans la formation de dimères semble peu probable.
En effet, une des questions récurrentes dans l’étude de la dimérisation de récepteurs est de savoir si ce phénomène est induit par le ligand. Différentes études se contredisent à ce sujet, certains montrant un effet des ligands sur la dimérisation (Mellado et al., 2001;Rodriguez-Frade et al., 1999;Vila-Coro et al., 1999) alors que d’autres études montrent que ceux-ci n’influencent pas l’état des dimères (Benkirane et al., 1997;El Asmar et al., 2005;Issafras et al., 2002). Ces discordances résultent de la difficulté d’interprétation de certains résultats et des techniques d’analyse utilisées.
