1.3. Le concept de dimérisation 1. Généralités
1.3.5. Phénomènes de coopérativités positives et négatives
Une des conséquences du nouveau concept d’oligomérisation des récepteurs couplés aux protéines G pourrait être un cross-talk entre les différents protomères de l’oligomères. Ce cross-talk pourrait conduire à une éventuelle coopérativité positive ou négative de liaisons de ligands, c'est-à-dire que les changements de conformation secondaires suite à l’interaction du ligand avec son récepteur peuvent provoquer des changements de conformation des récepteurs voisins et des modifications des caractères de leur interaction avec leur ligand.
On parlera de coopérativité positive lorsqu’un ligand, en se fixant sur un récepteur faisant partie d’un dimère, entraîne des variations conformationnelles de l’autre récepteur faisant partie du dimère, engendrant une augmentation de son affinité pour le ligand. A contrario, on parle de coopérativité négative de liaison lorsque la fixation du ligand à son récepteur faisant partie d’un dimère, entraîne des variations conformationnelles de l’autre récepteur faisant partie du dimère, engendrant une diminution de son affinité pour le ligand.
La coopérativité de liaison est caractérisée, de manière quantitative, via le coefficient de Hill n. où n est le coefficient de coopérativité, P la protéine et L le ligand.
où n est le coefficient de coopérativité, P la protéine, L le ligand, et C le complexe formé. Dès lors, la constante de dissociation équivaut à :
La variable θ represente la fraction des sites de liaison qui sont occupés par le ligand. Dès lors, 1 − θ represente la fraction des sites de liaisons qui ne sont pas occupé, donnant le ratio suivant:
Le produit logarithmique de cette équation devient alors:
Dès lors, on obtient une courbe dont la pente correspond au coefficient de Hill, ou coefficient de coopération n. Une valeur de n>1 indique une coopération positive alors qu’une valeur de n<1 signifie une coopérativité négative.
Peu de modèles mathématiques ont analysé l’impact du cross-talk au sein de dimères en ce qui concerne la liaison de ligands (mattera 1985, Wreggett and wells 1995,
Christopoulos and Kenakin 2002, Durroux 2005, Franco 2005). Des prédictions montrent que
la coopérativité négative ou positive induite par les ligands sur des dimères résulte en des modifications à la fois de la forme et des courbes des courbes de saturation et de compétition
(Durroux 2005). Un modèle mathématique a été proposé par Albizu dans lequel il envisage
que la liaison d’un ligand sur des dimères de récepteurs peut être considéré de trois manières
différentes (Figure XXXXXXXXXXXXX). Imaginons deux ligands hypothétiques, à savoir
L1 et L2, les trois cas de figure que la liaison de L1 et L2 sur leurs sites de liaison n’entrainerait soit aucun effet coopératif, soit un effet coopératif positif, soit un effet coopératif négatif. Les profils des courbes de saturation et de compétition dépendent de la nature de la coopérativité entre les deux sites de liaision des dimères. Les courbes de saturation attendues avec un radioligand L1* ont un coefficient de Hill équivalent à 1 et une courbe de Scatchard, où L'axe des x représente la liaison spécifique de ligands B (" Bound ") et l’axe des Y la liaison spécifique divisée par la concentration en ligand libre B/F (F, " Free "), linéaire (Figure XXXXXXXXXa). De manière contrastée, la coopérativité négative (fig
XXXXXXXXXXXXXXXXXXb) et positive (fig XXXXXXXXXXxc) résulte en un
coefficient de Hill respectivement plus petit et plus grand, ainsi qu une courbe de Scatchard respectivement concave et convexe.
De plus, ce modèle mathématique prédit que des courbes de compétition d’un radioligand L1* avec un compétiteur L2 (différent de L1) ont une inclinaison d’un facteur 1 en absence de toute coopérativité (fig Xa, en bas à gauche). De manière contrastée, des coopérativités positives et négatives résultent des courbes avec un facteur de pente respectivement plus petit ou plus grand que 1. De plus, les formes des courbes de compétitions peuvent être plus complexes : les courbes peuvent avoir deux plateaux en cas de coopérativité négative (fig
XXXXXb) ou une augmentation de la liaison du traçeur pour de faibles concentrations en compétiteur en cas de coopérativité positive (fig XXXXXXc).
Ce modèle a été validé pour les récepteurs à l’oxytocine et à la vasopressine, où les ligands respectifs de ces récepteurs entraînent des effets coopératifs différents. Par exemple, l’antagoniste OT du récepteur a l’oxytocine entraîne une coopérativité négative sur la liaison de l’oxytocine radiomarquée, alors que l’antagoniste OTA, du même récepteur, entraîne quant à lui une coopérativité positive dans la liaison de l’oxytocine radiomarquée. Plusieurs phénomènes de coopérativité ont également été observés pour les récepteurs de la classe A des GPCRs. Ainsi, une coopérativité négative des deux sites de liaisons à été décrite pour les dimères de récepteurs muscariniques (christopoulos 2002, Koppen 2003), des récepteurs dopaminergiques D2 (Armstrong 2001), des récepteurs aux hormones glycoprotéiques
(Urizar 2005) et des récepteurs CCR2 et CCR5 aux chimiokines (El asmar 2005). De plus,
d’autres études ont montré des effets coopératifs positifs au sein de dimères. Ainsi, il a été également montré une coopérativité positive pour certains récepteurs muscariniques (mattera
85 wregget 95) et les récepteurs KOP et DOP aux opioïdes (Jordan devi XXX). Une question
supplémentaire dans l’étude de ces phénomènes est de connaître leur nature.
1.3.6. Interaction allostériques entre protomères
Le traffic, les propriétés de liaison et de signalisation d’un GPCR ne sont pas uniquement dépendants du récepteur lui-même, mais aussi de ses interactions avec d’autres protéines. L'allostérie est un mode de régulation de l'activité d'une protéine par lequel la fixation d'une molécule effectrice en un site modifie les conditions de fixation d'une autre molécule, en un autre site distant de la protéine. Par définition, chaque protéine qui interagit avec un récepteur et module ses propriétés peut être considéré comme un modulateur allostérique. Les protéines G hétérotrimériques constituent un exemple bien établi de partenaires qui affectent de manière allostérique la liaison du ligand au GPCR. En effet, l’interaction du récepteur avec la GDP- protéine G est requise pour observer un état de haute affinité de liaison des agonistes pour les récepteurs aux chimiokines, opioïdes et adrénergiques (De Lean et al., 1980;Kenakin, 1996;Springael et al., 2006;Staudinger et al., 2001). L’hétérodimérisation de CRLR (Calcitonin Receptor-Like Receptor) avec une RAMP (Receptor Activity-Modifying Protein) constitue également un exemple de modulation
allostérique, où des protéines à un segment transmembranaire interagissent avec un GPCR et en modifient la fonction. En effet, l’hétérodimérisation de CRLR et de RAMP est nécessaire pour atteindre la surface en tant que récepteur fonctionnel et détermine leurs propriétés fonctionnelles (Hay et al., 2003;Hay et al., 2006;Mallee et al., 2002).
Par définition, le site « orthostérique » d’un récepteur est celui qui est reconnu par le ligand agoniste endogène de ce récepteur. Des agonistes de substitution et des antagonistes compétitifs se lient également au site orthostérique. Cependant, les GPCRs possèdent également des sites de liaison allostérique, distincts du site orthostérique, et qui reconnaissent un certain nombre de molécules modulant les propriétés des récepteurs (Christopoulos and Kenakin, 2002;Langmead and Christopoulos, 2006;May et al., 2006). Ces modulateurs allostériques exercent leurs effets, positifs ou négatifs, sur les propriétés de liaison et/ou fonctionnelles de ligands se liant au site orthostérique.
Les modulations allostériques ont été particulièrement étudiées pour les récepteurs muscariniques à l’acétylcholine. Il a été démontré que des modulateurs allostériques tels la gallamine ou l’alcuronium augmentaient ou diminuaient l’affinité de liaison de l’acétylcholine de manière récepteur-sélective (Tucek and Proska, 1995). Les ions Na+ modulent de manière négative la liaison de ligands à de nombreux GPCRs, tels les récepteurs à la dopamine, les récepteurs opioïdes et le récepteur α2-adrénergique (Guyer et al., 1990;Neve, 1991;Ott et al., 1988). En plus de moduler l’affinité et/ou l’efficacité de ligands orthostériques, certains modulateurs allostériques peuvent aussi présenter une activité agoniste intrinsèque sur le GPCR et ont dès lors été appelés « modulateurs ago-allostériques » (Langmead and Christopoulos, 2006;Schwartz and Holst, 2006). Par exemple, les ions Zn++ modulent de manière positive la réponse fonctionnelle des récepteurs MC1 et MC4 à la MSH (Melanocortin Stimulating Hormone) et possèdent une activité agoniste propre (Holst et al., 2002). De manière similaire, le CGP7930 est décrit comme un agoniste partiel du récepteur GABAb et comme un modulateur allostérique positif de la réponse au GABA (Binet et al., 2004;Urwyler et al., 2001).
Les modulateurs allostériques sont beaucoup étudiés par les firmes pharmaceutiques du fait qu’ils offrent, en tant qu’agents thérapeutiques, de nombreux avantages théoriques par rapport aux ligands orthostériques. En effet, étant donné qu’ils agissent sur un site qui n’est
pas soumis à la même pression évolutive que le site orthostérique, les modulateurs allostériques pourraient offrir une dimension de sélectivité supplémentaire pour certains sous types de récepteurs, par rapport aux agonistes et antagonistes traditionnels (Kenakin et al., 2006;Soudijn et al., 2004). De plus, en modulant les effets des ligands endogènes, ils n’éliminent pas la régulation physiologique du système sur lequel ils agissent (Christopoulos and Kenakin, 2002;Langmead and Christopoulos, 2006;May et al., 2006;Schwartz and Holst, 2006;Soudijn et al., 2004).
Etant donné qu’il est à présent admis que les GPCRs dimérisent, il est tentant de penser que certains modulateurs allostériques pourraient influencer la fonction d’un récepteur en ciblant un autre récepteur présent dans le même complexe multimérique. Cette hypothèse est supportée par l’observation selon laquelle les poches de liaison de modulateurs allostériques recouvrent souvent les sites de liaisons des ligands endogènes. Par exemple, le mapping par mutagenèse du site de liaison du Zn++, modulateur allostérique de MC1, a permis de mettre en évidence des résidus du troisième segment transmembranaire qui contribuent également à la liaison de l’agoniste orthostérique α-MSH (Holst et al., 2002). Cette observation est compatible avec la notion récente selon laquelle le site orthostérique d’un partenaire d’oligomère pourrait exercer des effets allostériques sur le même site orthostérique sur un autre protomère du complexe (Schwartz and Holst, 2006).
Jusqu’à récemment, peu de travaux avaient étudié de manière expérimentale l’éventuelle coopérativité de liaison au sein de dimères (Albizu et al., 2006;El Asmar et al., 2005;Galvez et al., 2001;Mesnier and Baneres, 2004;Sohy et al., 2007;Springael et al., 2006;Suzuki et al., 2004;Urizar et al., 2005). Mesnier et Baneres, en utilisant une approche par spectroscopie, ont démontré un changement conformationnel d’une unité d’un dimère de récepteurs BLT1 alors que l’autre partenaire du dimère était occupé par un agoniste, le leukotriène B4. Cette observation montre donc une interaction de type allostérique entre les deux protomères du dimère (Mesnier and Baneres, 2004). Deux autres études récentes ont investigué de manière plus détaillée la coopérativité de liaison allostérique au sein de dimères de GPCRs en utilisant le récepteur de la thyrotropine (TSHr) et une chimère (LTr) constituée du domaine extracellulaire de liaison à l’hormone du récepteur de la lutotropine (LH/CGr) et les segments transmembranaires du récepteur TSH. Une coopérativité négative de liaison entre ces deux récepteurs a été observée (Urizar et al., 2005). Lorsqu’ils sont exprimés
séparément, ces deux récepteurs ont une pharmacologie spécifique, le récepteur à la TSH liant la TSH mais pas l’hCG , alors que la chimère LG lie spécifiquement l’hCG mais pas la TSH. Cependant, une fois que les deux récepteurs sont co-exprimés, l’hCG est capable d’inhiber la liaison de [I125]
TSH avec haute affinité. La nature allostérique de cette compétition hétérologue a été confirmée par des expériences de dissociation utilisées notamment pour démontrer l’allostérie au sein de dimères de récepteurs à l’insuline (de Meyts, 1976). La cinétique de dissociation de ligands permet en effet d’investiguer les relations allostériques entre les différents sites de liaisons de dimères (Christopoulos and Kenakin, 2002;de Meyts et al., 1973;Kostenis and Mohr, 1996;Pizard et al., 1998;Urizar et al., 2005). Dans des conditions de dilution « infinie », ce qui empêche la réassociation du traceur, la vitesse de dissociation de la [I125]TSH préliée est fortement accélérée par la présence d’un excès d’hCG (Urizar et al., 2005). Ces données suggèrent que la liaison d’hCG à la chimère LT induit des changements de conformation au sein des deux partenaires de l’hétérodimère, ce qui favorise la dissociation de la [I125]
TSH du récepteur à la TSH. Une autre étude, concernant les récepteurs métabotropiques au glutamate, suggère qu’un rôle dynamique inter sous-unité pourrait contribuer à leur activation.
En ce qui concerne les récepteurs aux chimiokines, des études de dimérisation des récepteurs CCR2 et CCR5 suggèrent une interaction allostérique négative entre les sites de liaison des deux récepteurs d’un dimère (El Asmar et al., 2005;Springael et al., 2006) (Figure 6). En utilisant la dissociation de ligands radiomarqués, Springael et al. ont montré que la dissociation de chimiokines radiomarquées spécifiques de chacun des partenaires d’un hétérodimère CCR2/CCR5 est plus élevée en présence de ligands froids. En effet, la dissociation de [I125]MIP-1β et de [I125]MCP-1 est plus rapide en présence de ligands spécifiques de l’autre partenaire de l’hétérodimère, à savoir MCP-1 et MIP-1 respectivement (Springael et al., 2006). Ces résultats démontrent qu’il existe une relation allostérique négative entre les deux sites de liaison des hétérodimères CCR2/CCR5. De plus, la capacité des ligands froids à promouvoir la dissociation complète du traceur radioactif dans les lignées cellulaires co-exprimant CCR2 et CCR5 suggère que les homodimères et les hétérodimères interagissent entre eux. Ceci supporte l’idée que les changements de conformations associés à la coopérativité négative de liaison peuvent être transmises en cascade de récepteur à récepteur au sein de complexes oligomériques plutôt qu’uniquement entre deux récepteurs formant un dimère (Fotiadis et al., 2003;Levitzki, 1974). De manière
alternative, un échange de sous-unité entre les homodimères et les hétérodimères pourrait expliquer certaines observations mais la stabilité du signal BRET suggère que les dimères ne sont pas échangeables.
La cross-compétition entre ligands spécifiques de CCR2 et CCR5 démontre une coopérativité négative de liaison entre les poches de liaison des deux partenaires du dimère. Un hétérodimère de récepteurs, et par analogie un homodimère, ne peut donc lier qu’une seule chimiokine avec haute affinité (El Asmar et al., 2005). L’état actif des GPCRs est stabilisé par leur couplage à la sous-unité de la protéine G et c’est cette forme active qui a une haute activité pour les agonistes (De Lean et al., 1980;Kenakin, 1996). On peut dès lors se poser la question du rôle de ce couplage à la G protéine sur la coopérativité négative de liaison.
L’accélération de la dissociation de traceurs suite à l’exposition à un excès de ligands froids avait déjà été montré précédemment pour différents GPCRs suggérant une composante allostérique dans les propriétés de liaisons de ligands, notamment pour les récepteurs opiacés, à la TSH, et β-adrénergiques (Davis et al., 1977;Limbird et al., 1975;Powell-Jones et al., 1979). Ce phénomène n’avait cependant pas retenu une très grande attention de la communauté scientifique étant donné qu’il était difficile d’interpréter de telles observations dans le cadre du modèle monomérique des GPCRs accepté à l’époque.