UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

FACULTE DE MEDECINE

Image­based biomarkers for the in­vivo evaluation  of human brain gliomas 

Niloufar Sadeghi­Meibodi

Service de Radiologie­ Unité d’IRM

Service de Médecine Nucléaire­ Unité PET/cyclotron biomédical  Service d’Anatomie Pathologique

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en  Sciences Médicales

Promoteur : Professeur Serge Goldman

Co­promoteur : Professeur Isabelle Salmon

Je dédie ce travail de thèse à la mémoire de mon cher papa, le Professeur 

Djamal Sadeghi­Meibodi

Professeur à la faculté de Médecine de l’Université de Téhéran

Remerciements

Mes remerciements s’adressent d’abord au Professeur Serge Goldman qui m’a guidée  pendant  toutes  ces  années  avec  tant  de  gentillesse  et  d’humanité.  Cher  Serge,  les  moments  qu’on a passés à discuter sur les différentes étapes  de ce projet sont  parmi les moments les  plus riches de ma vie professionnelle et rien que pour ça je ne te remercierai jamais assez. 

Je  remercie le  Professeur  Isabelle Salmon  qui  m’a  accueillie  dans  son  laboratoire  et  m’a aidée à développer ce projet. Merci Isabelle pour ta disponibilité, ton enthousiasme et tes  conseils.

Je  remercie  le  Professeur  Julien  Struyven  de  m’avoir  donné  la  chance  de  devenir  radiologue.

Je remercie le Professeur Danielle Balériaux qui m’a accueillie dans son département  et m’a donné l’opportunité de développer mes projets et qui m’a soutenue dans les moments  les plus difficiles.

Je remercie le Professeur Freddy Avni qui m’a encouragée durant ces années.

Je remercie le docteur Thierry Metens pour tous ses précieux conseils.

Je remercie les docteurs Philippe David, Carine Neugroschl et Isabelle Delpierre pour  avoir supporté la surcharge de travail pendant mes années de recherche. 

Je remercie tous les membres du Service d’Anatomie Pathologie et en particulier les  docteurs  Sandrine  Rorive,  Nicky  D’Haene  et  Calliope  Maris  et  enfin  Madame  Nathalie  Watteau. Je remercie tout particulièrement le Professeur Christine Decaestecker.

Je  remercie  les  Professeurs  Jacques  Brotchi,  Marc  Levivier,  Florence  Lefranc  et  Nicolas Massager.

Je remercie le docteur Patrice Jissendi pour m’avoir aidée à comprendre les bases de la  spectroscopie.

Je  remercie  le  personnel  de  l’Unité  de  Résonance  Magnétique  de  même  que  le  personnel du service des Isotopes et en particulier de l’unité PET/Cyclotron biomédical.

Je remercie nos secrétaires Laurence et Diane.

Je remercie le FNRS et le Fonds Erasme pour la recherche médicale.

Merci à ma grande famille en Iran et aux USA, mes sœurs, mon frère, mes neveux et  nièces qui m’ont toujours donné de la force malgré la distance. Merci à ma chère maman qui a  su seule, soutenir et protéger ses quatre enfants dispersés dans le monde.

Je  remercie  aussi  tous  mes  amis  en  particulier,  Azadeh,  Sima,  Najima,  Théo.  Merci  aussi  à  vous  Anne,  Maxou,  Doris,  Michelle,  Nathalie,  Boris,  Frédérique  que  je  considère  comme ma petite famille en Belgique. 

Merci à toi Marco pour ton soutien et tes encouragements durant toutes ces années.

Et merci à toi Nima, d’être là et de rire à la vie et de toujours me montrer où se trouve  l’essentiel.

Et enfin ma gratitude éternelle va à feu Monsieur le Professeur Pierre Lasjaunias. 

TABLE

ABBREVIATIONS..………...7

SUMMARY……….8

1.  INTRODUCTION………10

1.1. Epidemiology of gliomas………...10

1.2. Histopathologic classification and grading……….11

1.2.1. Astrocytic Tumors………13

1.2.1.1. Pilocytic astrocytoma (WHO Grade I)………13

1.2.1.2. Diffuse astrocytoma (WHO Grade II)……….14

1.2.1.3. Anaplastic astrocytoma (WHO Grade III)………...14

1.2.1.4. Glioblastoma (WHO Grade IV)………...15

1.2.2. Oligodendroglial Tumors……….17

1.2.2.1. Oligodendroglioma (WHO Grade II)………..17

1.2.2.2. Anaplastic oligodendroglioma (WHO Grade III)………..18

1.2.2.3. Oligoastrocytoma (WHO Grade II)………...18

1.2.2.4. Anaplastic oligoastrocytoma (WHO Grade III)………...19

1.2.3. Ependymal Tumors………...19

1.2.3.1. Ependymoma (WHO Grade II)………...20

1.2.3.2. Anaplastic ependymoma (WHO Grade III)………...20

1.2.4. Other tumors of glial origin……….20

1.3. Biology of gliomas………...21

1.3.1. Glioma protein expression………...21

1.3.2. Genetic alterations………21

1.3.3. Cell proliferation………..22

1.3.4. Cell migration………...23

1.3.5. Angiogenesis………..24

1.3.6. Tumour metabolism……….25

1.3.6.1. ¹⁸F­Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography (FDG­PET)………26

1.3.6.2. ¹¹C­Methionine Positron Emission Tomography (MET­PET)……….26

1.3.6.3. Other PET tracers……….26

1.4. Neuroimaging of gliomas ………...27

1.4.1. Morphologic MR brain imaging ………27

1.4.1.1. Tumor characterization and grading………..27

1.4.1.2. Stereotactic biopsy guidance and neuronavigation………28

1.4.2. Physiology­based MR brain imaging………..29

1.4.2.1. Proton MR­spectroscopy………..29

1.4.2.1.1. Technique………29

1.4.2.1.2. Clinical applications in gliomas……….30

1.4.2.1.2.1. Grading gliomas………...30

1.4.2.1.2.3. Biopsy and radiotherapy guidance……….31

1.4.2.2. Diffusion­weighted imaging ……….32

1.4.2.2.1. Technique………32

1.4.2.2.2. Clinical applications in gliomas………...34

1.4.2.2.2.1. Glioma characterization………..34

1.4.2.2.2.2. Grading gliomas………...34

1.4.2.2.2.3. Radiation necrosis versus tumour recurrence………..35

1.4.2.2.2.4. Prediction of patient outcome……….35

1.4.2.3. Perfusion­weighted imaging ………35

1.4.2.3.1. Technique………35

1.4.2.3.2. Clinical applications in gliomas……….37

1.4.2.3.2.1. Grading gliomas………...37

1.4.2.3.2.2. Radiation necrosis versus tumor recurrence………37

1.4.2.3.2.3. Biopsy guidance………..37

1.4.2.3.2.4. Prediction of patient outcome……….38

1.4.3. MR imaging diagnostic strategy for intra­axial brain masses………...38

1.5. Relation between tumor biology and physiology­based MR imaging………..38

1.5.1. Relation between tumor biology and MR Spectroscopy………...39

1.5.2. Relation between tumor biology and ADC………39

1.5.3. Relation between tumor biology and CBV.………40

1.6. Physiologic­based MR imaging of the brain in patients with glioma………...40

1.6.1. Functional MRI………40

1.6.2. Diffusion tensor imaging………..41

2. OBJECTIVE ………..42

3. INVESTIGATIONS………...42

3.1. Assessing the relation between ADC and extracellular matrix hydrophilic components in gliomas  represented by hyaluronan………...42

3.1.1. Introduction………..42

3.1.2. Materials and methods……….…42

3.1.3. Results………42

3.1.4. Discussion ……….45

3.2. Assessing the relation between CBV and tumor aminoacid metabolism……….……47

3.2.1. Introduction………..…47

3.2.2. Materials and methods……….…47

3.2.3. Results………47

3.2.4. Discussion………...…...48

3.3. Assessing the regional relation between CBV and both tumor metabolism and histopathological  grading features (stereotactic approach)………50

3.3.1. Introduction………..…50

3.3.2. Materials and methods ………50

3.3.3. Results………52

3.3.4. Discussion………..……54

3.4. Assessing  the  regional  relation  between  ADC  and  CBV  and  quantitative  histopathology  (stereotactic approach)………..……57

3.4.1. Introduction………..………57

3.4.2. Materials and methods……….…57

3.4.3. Results………58

3.4.4. Discussion………..…62

4. CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES………...…66

5. REFERENCES………...…68

6. THESE ANNEXE………..…86

ABBREVIATIONS

ADCr:  ADC ratio 

ADCtum:  ADC of the tumor 

ADCwm: ADC value of normal­appearing white matter  Ang: Angiopoietin

BBB: Blood­Brain Barrier 

BOLD: Blood Oxygenation Level Dependent  CBF: Cerebral Blood Flow 

CBTRUS: Central Brain Tumor Registry of the United States CBV: Cerebral Blood Volume

Cho: Choline  Cr:  Creatine

CSF: Cerebrospinal fluid CT: Computed Tomography

DSC: Dynamic Susceptibility­Contrast  DTI: Diffusion Tensor Imaging  DWI: Diffusion Weighted Imaging ECM: Extracellular Matrix 

EGFR: epidermal growth factor receptor EPI: Echo­Planar Imaging 

FDG: 18F­Fluorodeoxyglucose 

FDG­PET:  18F­Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography  FDOPA: 3,4­dihydroxy­6­18F­fluoro­L­phenylalanine 

FET: O­(2­18F­fluoroethyl)­tyrosine

FLAIR: Fluid­Attenuated Inversion Recovery FLT: 3’­deoxy­3’­18F­fluorothymidine  fMRI: Functional MR imaging 

GFAP: Glial Fibrillary Acid Protein  H&E: Hematoxylin and Eosin  HA: Hyaluronan

HIF: Hypoxia­Inducible Factor  IDH1: Isocitrate dehydrogenase 1 LI: Labelling Index 

LI­HA: Labelling Index for Hyaluronan  LOH:  Loss of heterozygosity 

MD: Mean Diffusivity MET:  11C­Methionine 

MET­PET: 11C­Methionine Positron Emission Tomography MGMT: O⁶­methylguanine methyltransferase 

mI: Myoinositol 

MR: Magnetic Resonance

MRI: Magnetic Resonance Imaging MRS: MR Spectroscopy 

NAA: N­Acetyl Aspartate  NFP: Neuro­Filament Protein 

PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen  PET: Positron Emission Tomography  PWI: Perfusion Weighted Imaging rCBV: relative CBV 

ROI: Region of Interest

SPARC: Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine  TE: Echo Time

TP53:  Tumor Protein 53

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor  WHO: World Health Organization 

WI: Weighted Imaging

SUMMARY

Gliomas constitute 36% of all primary brain tumors and 81% of all primary malignant  brain tumors. The overall prognosis in patients with gliomas depends mainly on the location  and histologic grade of the tumor.

The  World  Health  Organization  classification  of  gliomas  is  the  primary  basis  for  guiding therapy and assessing overall prognosis in gliomas. This classification system, based  on histologic features, often falls short of predicting therapeutic response of individual tumors within  the same histologic  grade. Yet,  it  still  remains the  grading method  for both  research  and clinical prospects.

Unlike any other organ the brain has multiple protective layers such as the skull that  ensure a homeostatic environment. The resulting reduced access to the brain and the absence  of plasmatic brain tumor markers bring neuroimaging  in  a central position  in  diagnosis and  management  of  brain  tumors. Moreover,  neuroimaging  has  evolved  from  a  purely  morphologic  investigation  into  a  diagnostic  tool  that  allows  characterization  of  particular  physical alterations within brain tissue. Understanding the relationship between the physical  characteristics of tumor tissue, studied by MR imaging, and biological characteristics of the  tumor  is  therefore important  for the  appropriate integration  of neuroimaging  in  brain  tumor  management.  The  general  objective  of  this  work  is  to  define  the  relationship  between  physiology­based  MR  imaging  and  biological  features  of  glial  tumors.  Diffusion  and  perfusion­weighted  imaging,  physiology­based  MR  techniques provide  the  data  based  on  physical  characteristics  of  the  tissues.  Diffusion­weighted  imaging  (DWI)  allows  the  measurement  of  water  molecules  diffusivity  within  the  brain  tissue  by  means  of  apparent  diffusion  coefficient  (ADC)  measurements.  Perfusion­weighted  imaging  (PWI)  is  based  on  changes of MR signal during the passage of contrast material through the intravascular space  and  allows  hemodynamic  measurements  such  as  those  of  cerebral  blood  volume  (CBV)  within the brain tissue.

High­grade  diffuse  gliomas  are  currently  differentiated  from  low­grade  diffuse  gliomas by increased cellularity with nuclear atypia, mitotic activity, endothelial proliferation  and necrosis. Components of the extracellular matrix and angiogenesis constitute some other  features of gliomas, which have established links with oncogenic processes that influence the  proliferative  and  infiltrative  potentials  of  these  tumors.  We  have  specifically  targeted  these  features  in  our  comparative  studies  with  the  working  hypothesis  that  physiology­based  MR  measurements, obtained in vivo, might provide information that is pertinent in terms of tumor  malignancy.

We chose to approach the biology of brain tumors in two ways: in vivo, by means of  metabolic imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and ex vivo, by  means of histological and immunohistochemical analyses of tumor specimens.

Many  studies  have  investigated  the  relation  between  ADC  values  and  cellularity  in  gliomas. The underlining theory is based on the premise that water diffusivity within the 

extracellular  compartment  is  inversely  related  to  the  content  and  attenuation  of  the  constituents of the intracellular space. Therefore when cellularity increases, intracellular space  volume  increases  with  a  relative  reduction  of  the  extracellular  space,  leading  to  restricted  diffusion of water molecules. However other factors may affect the value of ADC in gliomas  such  as  the  extracellular  matrix  which  contains  various  amounts  of  hydrophilic  macromolecules  susceptible  to  change  water  molecules  diffusivity.  Hyaluronic  acid  is  one  highly  hydrophilic  component  of  the  extracellular  matrix  of  gliomas  and  its  level  of  expression  changes  significantly  during  the  progression  to  anaplasia  in  gliomas.  Our  hypothesis was  that hyaluronan  may influence  ADC  values in  high  and low  grade gliomas. 

We demonstrated a positive correlation between ADC values and the immunohistochemical  level of hyaluronan in glial tumors.

Previous studies have confirmed the utility of positron emission tomography using C­

11 Methionine (PET­MET) as a prognostic tool in patients with gliomas. Higher MET uptake  is associated with greater proliferative potential and a higher level of malignancy in gliomas. 

The increased amino­acid uptake in gliomas seems to reflect increased transport mediated by  amino­acid carriers located in the endothelial cell membrane. Our hypothesis was that CBV  measurements, index of tumor vascularity, may be related to tumor amino­acid metabolism. 

We found a positive correlation between maximum CBV values and maximum MET uptake  values in gliomas.

A limitation to these preliminary studies was lack of direct correlation between MR­

based  measurements  and  histologic  and  metabolic  data.  Indeed,  glial  tumors  are  known  for  their remarkable tissue heterogeneity across different grades, within the same grade, and even  within a single given tumor. Therefore we used image co­registration and stereotactic biopsies  to  further  assess  the  relationship  between  MR­based  imaging  data  and  both  metabolic  and  histologic analysis.

The  second  part  of  our  studies  was  based  on  measurements  at  the  exact  same  localization on both MR and PET images where biopsy specimens were performed. We found  a  local  relationship  between  CBV  and  MET  uptake  values.    Both  measurements  correlated  with mitotic activity and endothelial proliferation; two features of tumor aggressiveness.

In  order  to  quantify  tumor  cellularity  and  tumor  angiogenesis,  we  respectively  measured  cell  density  and  vessel  density  using  immunohistochemical  markers  to  identify  vessels.  We  found  a  regional  relationship  between  CBV  and  cell  density, as  well  as  vessel  density  in  gliomas  whereas  no  correlation  was  found  regionally  between  ADC  and  cell  density.

We concluded that CBV measurements may be used locally as indices of angiogenesis  and cellularity in gliomas; whereas local ADC measurements are more variable and may not  be used as a marker of cellularity in heterogeneous tumors such as gliomas.

1. INTRODUCTION

1.1. Epidemiology of gliomas

The annual incidence of primary malignant brain  tumors is 3.7 per 100.000 for men  and  2.6  per  100.000  for  women.  Rates  are  higher  in  more  developed  countries  than  in  less  developed  countries  (Bondy  ML  et  al.,  2008).  Gliomas  of  astrocytic,  oligodendroglial  and  ependymal  origin  account  for  36%  of  all  primary  brain  tumors  and  81%  of  all  primary  malignant  brain  tumors  based  on  CBTRUS  (Central  Brain  Tumor  Registry  of  the  United  States, 2008; Figure1). (Website: http://www.cbtrus.org/reports//20072008/2007 report.pdf). 

Figure  1:  Distribution  of  all  primary  brain  and  CNS  gliomas  by  histology  subtypes  in  the  Unite  States,  study based on 26,630 subjects (CBTRUS 2000­2004).

Both  astrocytoma  and  glioblastoma  peak  in  incidence  at  age  65  to  74  years,  and  oligodendroglioma at  age  35  to  44  years  (Wrensch  M  et  al.,  2002).  It  seems  likely that  the  duration  of  exposure  to  unknown  oncogenic  factors  and  poorer  immune  surveillance  with  advancing  age  may  account  for  those  tumor  types  that  increase  in  incidence  with  age  (Wrensch  M  et  al.,  2002).  The  main  prognostic  factors  are  patient  age,  Karnofsky  performance status at diagnosis, tumor location, extent of surgical resection, histological type  and malignancy grade (Bondy ML et al., 2008). With the exception of pilocytic astrocytoma,  the survival of glioma patients is still poor. The poor prognosis of diffuse gliomas is largely  related to  their  high  capacity  of  invasion  (Giese  A  et  al.,  2003).  Patients  with  glioblastoma  (Grade  IV) have  the  poorest  survival  in  all  age  groups  (5­year  survival  rate  of  3.3  %),  and  within any histologic type.  Older patients have poorer survival than younger patients (Bondy 

ML  et al.,  2008; CBTRUS,  2008). High­dose  ionizing radiation and  rare  genetic syndromes  are the only well established risk factors (Melean G et al., 2004; Sadetzki S et al., 2005). 

1.2. Histopathologic classification and grading

The World Health Organization (WHO) classifies gliomas based on main histologic cell  differentiation.  Classification include: astrocytomas (60­70%), oligodendrogliomas (5­30%)  and ependymomas (less than 10%) (Louis DN et al., 2007). For each histological type, a grade  of malignancy is also attributed. Table 1 summarizes the main histological types of gliomas  and the corresponding grade.

Table  1:  WHO  classification  of  tumors  of  neuroepithelial  tissue  of  the  nervous  system  (Louis  DN  et  al.,  2007)

Gliomas Grade I Grade II Grade III Grade IV Astrocytic Tumours

­ Subependymal giant cell  astrocytoma

*

­ Pilocytic Astrocytoma *

­ Pilomyxoid Astrocytoma *

­ Diffuse Astrocytoma *

­ Pleomorphic 

xanthoastrocytoma *

­ Anaplastic Astrocytoma *

­ Glioblastoma *

­ Giant cell Glioblastoma *

­ Gliosarcoma *

Oligodendroglial Tumours

­ Oligodendroglioma *

­ Anaplastic Oligodendroglioma *

Oligoastrocytic Tumours

­ Oligoastrocytoma *

­ Anaplastic Oligoastrocytoma *

Ependymal Tumours

­ Subependymoma *

­ Myxopapillary Ependymoma *

­ Ependymoma *

­ Anaplastic Ependymoma *

Histologic grading of gliomas is a means of predicting the biological behavior of a tumor. 

Tumor  histological  type  and  malignancy  grade  influence  the  choice  of  therapy  (adjuvant  radiation,  chemotherapy).    It  is  also  one  criteria  used  to  predict  a  response  to  therapy  and 

outcome.  The  principal  morphological  features  of  malignancy  grading  are  presence  of  high  cellularity, cytological atypia, mitotic activity, endothelial proliferation and necrosis.  These  features allow grading gliomas from grade II to grade IV. Table 2 summarizes the application  of  these  morphological  malignant  features  in  grading  diffuse  astrocytic  tumors.  Grade  I  tumors or pilocytic astrocytomas correspond to lesions with low proliferative potential and the  possibility of cure following total surgical  resection. The above malignancy grading criteria  are not applicable to Grade I astrocytomas (Giannini C and Scheithauer BW, 1997; Louis DN  et al., 2007). Grade II astrocytomas are infiltrative and despite low proliferative activity often  recur. Infiltrative astrocytomas with only cellular atypia are considered grade II (fibrillary or  diffuse  astrocytoma).    Cellular  atypia  is  defined  as  variation  in  nuclear  shape  or  size  with  accompanying  hyperchromasia.  Tumors  which  also  show  mitotic  activity  and  sometimes  endothelial  proliferation  are  considered  grade  III  (anaplastic  astrocytoma).  Endothelial  proliferation is defined as multilayering of endothelium. Mitoses should be unequivocal with  no special recognition given to their morphology. The separation between grade II from grade  III tumors is however more reliable by determination of MIB­1 antibody to the Ki­67 antigen  (Prayson RA, 2005). Tumors additionally showing endothelial proliferation and necrosis are  grade IV (glioblastoma). Necrosis may be of any type, and perinecrotic palissading need not  be present (Louis DN et al., 2007).

Table  2:  Morphological  features  of  malignancy  grading  in  diffuse  astrocytic  tumors  (Louis  DN  et  al.,  2007) 

Astrocytomas Grade Cell  Density

Cellular  Atypia

Mitoses Endothelial  Proliferation

Necrosis

Pilocytic  Astrocytomas

I Not Applicable

Diffuse  Astrocytomas

II + + rare ­ ­

Anaplasitic 

Astrocytomas III ++ ++ + ­ / + ­

Glioblastomas IV +++ +++ ++ + +

1.2.1. Astrocytic Tumors

There  are  two  main  groups  of  astrocytic  tumors.  The  first  group  consists  of  non  infiltrating  tumors  including  mainly  pilocytic  astrocytoma  and  subependymal  giant  cell  astrocytomas  (WHO  Grade  I).  The  second  group  consists  of  diffusely  infiltrating  tumors  including diffuse astrocytoma (WHO Grade II), anaplastic astrocytoma (WHO Grade III) and  glioblastoma  (WHO  Grade  IV).  WHO  grade  I  astrocytomas  develop  more  frequently  in  pediatric  population  and  are  usually  resected  completely. These  tumors  have  a  good  prognosis. As the surgical resection is rarely total in the second group, the prognosis is poor  with eventually a fatal outcome (Louis DN et al., 2007).

1.2.1.1. Pilocytic astrocytoma (WHO Grade I)

These  are  relatively  circumscribed,  slowly  growing,  often  cystic  astrocytomas  occurring in children and young adults (Figure 2). They constitute the most common glioma  in children, in whom the majority (67%) arises in the cerebellum (Ohgaki H and Kleihues P, J  Neuropathol Exp Neurol. 2005). These tumors are of low to moderate cellularity and rarely mitosis, pleomorphic nuclei, endothelial proliferation, infarct­like necrosis and infiltration of  leptomeninges  are  not  signs  of  malignancy. Pilocytic  astrocytomas  are  highly vascularized. 

Long survival times are the rule in these tumors and they may stabilize or even spontaneously  regress  during  their  evolution  (Gunny  R  et  al.,  2005).  Supratentorial  location  is  associated  with less favorable prognosis (Kidd EA et al., 2006).

A B C D

E F

A B C D

E F

A B C D

E F

Figure  2:    Pilocytic  astrocytoma.  Morphological  MR  imaging  and  histopathological  illustration:  T1­WI  (A),  T2­WI  (B),  FLAIR  (C)  and  T1­WI  with  contrast  (D)  show  a  cystic  basal  ganglia  mass  with  a  solid  component  which  enhances  intensely  (arrow).  Corresponding  histological  slices  with  Hematoxylin  and  Eosine  coloration  (E)  and  GFAP  (F)  (200x)  show  the  morphological  characteristics  of  a  pilocytic  astrocytoma.

1.2.1.2. Diffuse astrocytoma (WHO Grade II)

These tumors typically affect young adults with a peak incidence between ages 30 and 40,  and most commonly develop supratentorially. The tumor is composed of well differentiated  fibrillary  or  gemistocytic  neoplastic  astrocytes  with  a  cellularity  which  is  moderately  increased  compare  to  normal  brain  (Figure  3).  Nuclear  atypia  is  a  typical  feature  whereas  mitotic  activity  is  generally  absent.  The  mean  survival  time  after  surgical  resection  ranges  between 6 to 8 years, with marked individual variations (Louis DN et al., 2007). Young age,  total tumor resection and presentation with epilepsy as the single symptom are associated with  more favorable prognosis. (Okamoto Y et al., 2004, Peraud A et al., 1998; van Veelen ML et  al.,  1998)  Large tumor size  and presentation with  neurological deficit  are associated with  a  worse prognosis (Karim AB et al., 1996; Danks RA et al., 1995). 

A B C

D

A B C

D

Figure 3:  Diffuse astrocytoma. Morphological MR imaging and histopathological illustration: T1­WI (A),  FLAIR (B) and T1­WI with contrast (C) show a left parietal mass which show no enhancement (arrows). 

Corresponding  histological  slice  with  Hematoxylin  and  Eosine  coloration  (D)  (200x)  show  the  morphological characteristics of a diffuse astrocytoma.

1.2.1.3.Anaplastic astrocytoma (WHO Grade III)

These  tumors  arise  from  diffuse  astrocytoma  with  a  tendency  of  progression  to  glioblastoma in a mean time interval of approximately 2 years (Ohgaki H et al., 2004). The  mean age at diagnosis is between 45 and 51. They affect adults and are preferentially located 

in the cerebral hemispheres. They are histologically characterized by nuclear atypia, increased  cellularity  and  significant  proliferative  activity  (Figure  4).  Endothelial  proliferation  may  be  present in a few cases. As in low grade astrocytomas increasing age is a negative prognostic  factor.

A B C D

E F

A B C D

E F

Figure 4: Anaplastic astrocytoma. Morphological MR imaging and histopathological illustration: T1­WI  (A),  T2­WI  (B),  FLAIR  (C)  and  T1­WI  with  contrast  (D)  show  a  left  frontal  mass  which  show  no  enhancement (arrows). Corresponding histological slices with Hematoxylin and Eosine coloration (E) and  GFAP (F) (200x) show the morphological characteristics of an anaplastic astrocytoma.

1.2.1.4.Glioblastoma (WHO Grade IV)

They  constitute  the  most  frequent  primary  brain  tumor  and  the  most  malignant  with  predominant  astrocytic  differentiation.  They  preferentially  affect  adults  with  a  peak  incidence  between  45  and  75  years  of  age.  Fronto­temporal  location  is  typical  and  tumor  infiltration often extends into the adjacent cortex and through the corpus callosum into the  contralateral  hemisphere.  Less  than  half  of  the  patients  survive  more  than  a  year  despite  progress in radio/chemotherapy. Older age represents the most significant adverse prognostic  factor (Ohgaki H et al., 2004). Primary glioblastomas (> 90 %) develop very rapidly with a  short  clinical  history  (less  than  3  months),  generally  without  clinical  or  histopathological  evidence  of  a  preexisting,  precursor  lesion.    Whereas  secondary  glioblastomas  (<  10  %)  develop through progression from diffuse astrocytoma or anaplastic astrocytoma (Ohgaki H et  al.,  2004).  Glioblastoma  histopathological  features  include  nuclear  atypia,  cellular 

pleomorphism, mitotic activity, endothelial proliferation and necrosis (Figure 5). The regional  heterogeneity of glioblastoma is remarkable and therefore the histopathological diagnosis on  specimens obtained by stereotaxic biopsies may be challenging (Burger PC et al., 1989). The  presence of endothelial proliferation is one of the histopathological hallmarks of glioblastoma. 

It typically consists of multilayered, mitotically active endothelial cells together with smooth  muscle  cells/pericytes.  Tumor  necrosis  is  a  fundamental  feature  of  glioblastoma,  and  its  presence  is  one  of  the  strongest  predictors  of  aggressive  clinical  behavior  in  diffuse  astrocytomas (Burger PC et al., 1987; Homma et al., 2006). There are two forms of necrosis,  one  which  can  be  seen  by  neuroimaging  as  a  non­enhancing  core  representing  non­viable  tumor tissue, where microscopically necrotic glioma cells can vaguely be identified as well as  faded  images  of  large,  dilated  necrotic  tumor  vessels.  The  second  form  of  necrosis  can  be  only noted microscopically and consists of multiple, small, irregularly shaped band­like foci,  surrounded  by  radially  oriented,  densely  packed,  small  fusiform  glioma  cells  in  a  pseudo­

palissading  pattern.  Despite  the  advances  in  surgery,  radiotherapy  and  chemotherapy,  the  overall  survival  of  patients  with  glioblastoma  remains  poor.  Less  than  20  %  of  patients  survive more than one  year (Ohgaki  H et al.,  2004). Age is  the most  significant prognostic  factor with younger patients having a significantly better prognosis (Burger PC et al., 1989). 

A B C D

E F G

A B C D

E F G

A B C D

E F G

Figure  5:  Glioblastoma.  Morphological  MR  imaging  and  histopathological  illustration:  T1­WI  (A),  FLAIR (B), T2­WI (C) and T1­WI with contrast (D) show a left occipital mass which enhances intensely  and heterogeneously (arrows). Corresponding histological slices with Hematoxylin and Eosine coloration  (E),  GFAP  (F)  and  Ki­67  (G)  (40x,  200x  and  200x)  show  the  morphological  characteristics  of  a  Glioblastoma.

1.2.2. Oligodendroglial Tumors

This group of tumors consists of diffusely infiltrating tumors composed predominantly  of  oligodendroglial  cells.  They  include  low  grade  oligodendrogliomas  (WHO  grade  II)  and  anaplastic oligodendrogliomas (WHO grade III). Morphological features indicating anaplasia  include  increased  cellularity,  marked  cytologic  atypia,  high  mitotic  activity,  vascular  proliferation and necrosis with or without pseudo­palissading. Anaplastic oligodendrogliomas  have  a  relatively  better  prognosis  than  anaplastic  astrocytomas  because  of  their  high  sensitivity to  chemotherapy. Oligoastrocytomas  correspond to  tumors  showing a  mixture  of  tumor  cells  resembling  those  found  in  oligodendrogliomas  and  diffuse  astrocytomas.  The  differential  diagnosis  of  anaplastic  oligoastrocytomas  versus  glioblastoma  may  be  problematic (Louis DN et al., 2007).

1.2.2.1. Oligodendroglioma (WHO Grade II)

These  tumors  correspond  to  diffusely  infiltrating  well  differentiated  glioma  composed  of  neoplastic  cells  morphologically  resembling  oligodendrocytes.  They  typically  are located in the hemispheres and arise in adults with a peak incidence between 40 and 45  years of age. They are moderately cellular, may contain microcalcifications and show a dense  network of branching capillaries (Figure 6). They typically grow slowly with relatively long  survival times; a 10­year survival rate of 51 % (Ohgaki H and Kleihues P­ J Neuropathol Exp  Neurol., 2005). Younger age, frontal location, high post­operative Karnofsky score, and  macroscopically  complete  surgical  resection  are  associated  with  a  more  favorable  outcome  (Shaw EG et al., 1992; Kros JM et al., 1994; Schiffer D et al., 1997).

A B C D

E F G

A B C D

E F G

Figure  6:  Low  grade  oligodendroglioma.  Morphological  MR  imaging  and  histopathological  illustration: 

T1­WI  (A),  T2­WI  (B),  FLAIR  (C),  and  T1­WI  with  contrast  (D)  show  a  right  insular  mass  with  no  enhancement  (arrows).  Corresponding  histological  slices  with  Hematoxylin  and  Eosine  coloration  (E),  GFAP (F) and Ki­67 (G) (x40) show the morphological characteristics of low grade oligodendroglioma.

1.2.2.2. Anaplastic oligodendroglioma (WHO Grade III)

These tumors correspond to oligodendrogliomas which present anaplastic features  such  as  high  cellularity,  marked  cytological  atypia,  high  mitotic  activity,  endothelial  proliferation and necrosis (Figure 7). The peak incidence is between 45 and 50 years of age. 

They  develop  by  progression  from  a  pre­existing  WHO  grade  II  oligodendrogliomas.  The  mean  time  progression  from  grade  II  oligodendroglioma  to  secondary  anaplastic  oligodendroglioma is approximately 6­7 years (Lebrun et al., 2004; Ohgaki H and Kleihues  P­ J Neuropathol Exp Neurol. 2005). Younger patients, those with better performance status  and those receiving more  extensive  resections  have a better  prognosis (Cairncross  G et al.,  2006; Shaw EG, 1992).

A B C D

E F G

A B C D

E F G

Figure  7:  Anaplastic  oligodendroglioma.  Morphological  MR  imaging  and  histopathological  illustration: 

T1­WI  (A),  T2­WI  (B),  FLAIR  (C),  and  T1­WI  with  contrast  (D)  show  a  left  parietal  mass  wwhich  moderately enhances (arrows). Corresponding histological slices with Hematoxylin and Eosine coloration  (E),  GFAP  (F)  and  Ki­67  (G)  (x400,  x200,  x200)  show  the  morphological  characteristics  of  anaplastic  oligodendroglioma.

1.2.2.3.Oligoastrocytoma (WHO Grade II)

These  tumors  are  composed  of  a  mixture  of  two  distinct  neoplastic  cell  types  morphologically  resembling  the  tumor  cells  in  oligodendroglioma  and  diffuse  astrocytoma. 

The  median  age  of  patients  with  oligoastrocytomas  ranges  between  35  and  45  years.  They  arise preferentially in the cerebral hemispheres. These are moderately cellularized neoplasms  with  no  or  low  mitotic  activity  (Figure  8).  Microcalcification  and  microcystic  degeneration  may be present. A median survival time of 6.3 to 6.6 years has been reported (Shaw EG et al., 

1992;  Okamoto  Y  et  al.,  2004). Younger  age  at  operation,  total  tumor  resection  and  post  operative radiation therapy are associated with a better prognosis (Shaw EG et al., 1992).

A B C D

E F G

A B C D

E F G

Figure 8: Low grade oligoastrocytoma. Morphological MR imaging and histopathological illustration: T1­

WI (A), T2­WI (B), FLAIR (C), and T1­WI with contrast (D) show a right frontal mass which moderately  enhances (arrows). Corresponding histological slices with Hematoxylin and Eosine coloration (E), GFAP  (F)  and  Ki­67  (G)  (x40,  x200,  x200  respectively)  show  the  morphological  characteristics  of  low  grade  oligoastrocytoma.

1.2.2.4.Anaplastic oligoastrocytoma (WHO Grade III)

These tumors correspond to oligoastrocytomas with features of anaplasia such as  increased  cellularity,  nuclear  atypia,  increased  mitotic  activity and  endothelial  proliferation. 

Those  with  necrosis  should  be  classified  as  glioblastoma  with  oligodendroglial  component. 

The  mean  age  at  diagnosis  is  44.  These  tumors  are  also  predominantly  hemispheric.  The  prognosis  of  patients  with  anaplastic  oligoastrocytomas  is  better  than  for  patients  with  glioblastoma. A median survival time of 2.8 years has been reported (Shaw EG et al., 1992).

1.2.3. Ependymal Tumors

Ependymomas  arise  from  ependymal  cells  covering  the  ventricles.  Infra­tentorial  ependymomas predominate in children whereas supra­tentorial ependymomas affect pediatric  as well as adult patients (Louis  DN  et al.,  2007). Ependymal tumors  include myxopapillary  ependymomas and subependymomas (WHO Grade I), ependymomas (WHO Grade II) which  are the most frequent, and anaplastic ependymomas (WHO Grade III). The prognostic value 

of the grade is  controversial.  The only prognostic  factors currently admitted are patient age  and  tumor  location.  Complete  surgical  resection  is  the  treatment  of  choice  in  these  tumors  (Louis DN et al., 2007).

1.2.3.1. Ependymoma (WHO Grade II)

These tumors  are generally slowly growing tumors  of children and  young adults.  In the  spinal cord, they constitute the most common neuroepithelial neoplasms in adults. The most  common  pattern  is  a  well­delineated,  moderately  cellularized  glioma  with  rare  or  absent  mitoses.  There  are  four  histopathological  variants:  cellular  ependymoma,  papillary  ependymoma,  clear  cell  ependymoma  and  tanycytic  ependymoma.  The  most  important  prognostic  factor  is  the  tumor  site.  Spinal  and  supratentorial  ependymomas  are  associated  with better survival rates (Ernestus RI et al., 1996). Cerebrospinal dissemination indicates a  poor prognosis (Louis DN  et al., 2007). Age below 3  years and incomplete tumor resection  are both indicators of a poor outcome (Horn B et al., 1999).

1.2.3.2. Anaplastic ependymoma (WHO Grade III)

These tumors are characterized by an ependymal differentiation with accelerated growth and  unfavorable clinical outcome. Histologically they present with high mitotic activity, increased  cellularity,  microvascular  proliferation  and  pseudo­palissading  necrosis.  Anaplastic  changes  are by far more frequent in childhood intracranial ependymomas than in  those of the spinal  cord.  Age  below  3  years,  anaplastic  histological  features,  incomplete  tumor  resection  and  evidence for CSF metastases have been all proposed as indicators of an adverse outcome in  children (Horn B et al., 1999; Jaing TH et al., 2004).

1.2.4. Other tumors of glial origin

Gangliogliomas  consist  of  tumors  containing  both  astrocytic  tumor  cells  and  atypic  ganglion  cells.  Glial  tumors  of  uncertain  origin  include  three  neoplasms:  astroblastoma,  gliomatosis cerebri and choroid glioma of the 3^rd ventricle (Louis DN et al., 2007).

1.3. Biology of gliomas

Gliomas frequently demonstrate a complex cellular heterogeneity.  This heterogeneity  is reflected in their growth and dissemination within the neuroaxis. It is this cellular variation  between the main types of gliomas, as well as within individual tumors, that explains why the  clinical behavior within the same grade and response to treatment cannot always be predicted. 

Immunohistochemical  analyses  (including  indices  of  tumor  proliferation)  and  molecular  genetic changes have been investigated to define objective prognostic criteria. In addition to  the histological features used in grading, various cellular and extracellular features of gliomas  have  established  links  with  oncogenic  processes  that  influence  the  proliferative  and  infiltrative  potentials  of  these  tumors.  Extracellular  matrix  components  as  well  as  tumor  angiogenesis  constitute  examples  of  such  features.  Tumor  hypermetabolism  in  terms  of  glucose or amino acid uptake has also been related to a more aggressive potential of gliomas  within the same histological grade.

1.3.1. Glioma protein expression

Gliomas in general express glial fibrillary acid protein (GFAP) which is a cytoskeletal  protein  (Kleihues  P  et  al.,  1987).  In  astrocytomas,  decreasing  GFAP  expression  usually  accompanies  decreasing  differentiation  (Tascos  NA  et  al.,  1982).  The  expression  of  S­100  protein in astrocytomas is very similar to that of GFAP. As for GFAP, a low S­100 protein  content correlates with advanced dedifferentiation (Jacque CM et al., 1979; Louis DN et al. 

2007).  Vimentin  shows  a  pattern  of  immunoreactivity  similar  to  GFAP. Its  presence  in  astrocytomas indicates a lower degree of differentiation and there is a tendency for vimentin  to  be  expressed  in  high­grade  astrocytomas  (Herpers  MJ  et  al.,  1986).  Vimentin  is  infrequently  expressed  in  low­grade  oligodendroglioma,  but  more  often  found  in  anaplastic  oligodendroglioma  (Dehghani  et  al.,  1998).  Oligodendroglial  tumors  with  vimentin  expression have a poorer prognosis than those lacking vimentin expression (Dehghani et al.,  1998). 

1.3.2. Genetic alterations

Diffuse  glial  tumors  have  the  tendency  to  progress  towards  a  more  malignant  phenotype and acquire histopathological and biological characteristics of the glioblastoma. It  has been demonstrated that the astrocytoma progression to secondary glioblastomas reflects a  sequential  accumulation  of  genetic  alterations  (Furnari  FB  et  al.,  1995;  Kleihues  P  et  al., 

1994; Ohgaki H et al., 1995). The identification of these genetic alterations is essential for our  understanding  of  the  evolution  of  gliomas  and  their  biological  characteristics.  Among  the  genetic  alterations  classically  described, p53  mutation  is  the  genetic  hallmark  of  low­grade  diffuse astrocytomas (60% in fibrillary astrocytomas and 80% in gemistocytic astrocytomas),  anaplastic  astrocytoma  (70%)  and  secondary  glioblastomas  (65%). Yet,  oligodendroglial  tumors are characteristically associated with co­deletion of 1p and 19q (60­80%) (Okamoto Y  et  al.,  2004).  Loss  of  1p/19q  is  associated  with  longer  patient  survival  in  low  grade  oligodendrogliomas  and  with  positive  response  to  chemotherapy  and  radiation  therapy  in  anaplastic oligodendrogliomas (Felsberg J et al., 2004; Cairncross JG et al., 1998). There is  an  amplification  of  the  gene  encoding  for  epidermal  growth  factor  receptor  (EGFR)  particularly in primary glioblastomas (36%) and less often in secondary glioblastomas (8%)  (Ohgaki H et al., 2004). EGFR amplification is associated with poorer survival in adults with  glioblastoma (Smith JS et al., 2001). Methylation of the O⁶­methylguanine methyltransferase  (MGMT) promoter in glioblastoma is associated with improved outcomes, especially among  patients treated with alkylating agents (Hegi ME et al., 2005; Stupp R et al, 2005). Isocitrate  dehydrogenase  1(IDH1)  mutations  constitute  a  highly  selective  molecular  marker  of  secondary glioblastomas and are a strong predictor of a more favorable prognosis in diffuse  astrocytomas  and  oligodendroglial  tumors  (Parsons  DW  et  al.,  2008;  Nobusawa  S  et  al.,  2009; Sanson M et al., 2009).

1.3.3. Cell proliferation

As  previously  mentioned,  increased  cellularity  is  one  of  the  histological  features  described in anaplastic gliomas. A more quantitative approach for appreciation of cellularity  is to measure cell density. Previous reports showed that proliferative activity and cell density  are  highly  correlated  in  astrocytic  tumors.  A  high  level  of  cell  density  in  high  grade  astrocytomas has been associated with shorter survival time (Kiss R et al., 1997).

Tumor cell proliferation represents the convergence of many cellular  factors.  These  include  cell  cycle time,  growth  fraction, population  doubling  time  and  cell  loss.  Basing the  proliferative potential of brain tumors on identification of mitotic figures is subject to inter­

observer  variability.  Moreover,  identification  of  mitotic  figures  is  an  assessment  of  only  a  small  portion  of  the  proliferative  phase  of  cell  cycle  (Prayson  RA,  2005).  

Immunohistochemical techniques such as bromodeoxyuridine labeling index (BrdU LI), MIB­

1 antibody to the Ki­67 antigen (MIB­1), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and silver 

nucleolar  organizing  regions  (Ag­NOR)  have  been  developed  to  assess  the  proliferative  potential of brain gliomas (Quiñones­Hinojosa A et al., 2005).

MIB­1  is  a  sensitive  marker  of  the  growth  fraction  that  recognizes  proliferation­

associated nuclear proteins that are present during G1, S, and G2/M phases, but absent in G0  (Gerdes J et al., 1984).  In a prospective study comparing predictive power for survival for  gliomas, MIB­1 was found to be superior to BrdU LI and PCNA (McKeever PE et al., 1998). 

MIB­1  was  found  to  be  an  independent  and  statistically  significant  prognostic  factor  of  survival in pilocytic and diffuse astrocytomas (Bowers DC et al., 2003; Jaros E et al., 1992)  and also in ependymomas (Wolfsberger S et al., 2004). In patients with glioblastoma, MIB­1  was not found to be an independent prognostic factor (Moskowitz SI et al., 2006). PCNA is a  DNA polymerase delta accessory protein that is associated with DNA replication and is thus  reflective of cells in the S phase. Although higher PCNA labeling index are associated with  malignancy, the broad range of PCNA values within tumor subgroups can be so marked that  low grade gliomas are indistinguishable from high­grade (Louis DN et al., 1991). 

In  addition  to  MIB­1  determination,  cell  density  has  the  advantage  to  integrate  cell  loss  and  cell  proliferation  dimensions,  allowing  a  better  evaluation  of  the  net  growth  of  a  given  tumor  (Gordower  L  et  al.,  1998).  In  fact,  tumor  growth  requires  a  coincidental  acquisition  of  genomic  lesions  triggering  deregulated  cell  proliferation  together  with  those  suppressing the concomitant cell death (Evan G, 1997).

1.3.4. Cell migration 

Tumor  cell  migration  refers  to  multiple  mechanisms  such  as  adhesion,  motility  and  invasion  (Friedl  P  and  Bröcker  EB,  2000).  Invasion  involves  the  ability  of  tumor  cells  to  translocate through extracellular matrix (ECM) barriers by the release of proteolytic enzymes  (Tysnes  BB  et  al.,  2001).  The  ECM  of  the  brain  represents  20%  of  the  normal  adult  brain  volume  (Nicholson  C  and  Sykova  E,  1998).  Two  main  classes  of  extracellular  macromolecules  make  up  the  ECM. The  first  group  of  macromolecules  consists  of  fibrous  proteins (collagen and elastin) and fibrous adhesive proteins (fibronectin and laminin). ECM  of the normal brain contains less collagen, fibronectine and laminin compared to other organs  in the body and they are localized to the perivascular space (Gladson CL, 1999). The second  group of macromolecules consists of polysaccharide chains called glycosaminoglycans, which  are  linked  to  proteins  in  the  form  of  proteoglycans.  Hyaluronic  acid  or  hyaluronan  (HA)  differs from other proteoglycans in that it is not attached to a protein. Hyaluronan is a highly 

hydrophilic  glycosaminoglycan  of  the  ECM  with  an  enormous  amount  of  solvent  attached  (Bertolotto A et al., 1986; Comper WD and Laurent TC, 1978; Laurent TC and Fraser JRE,  1992).  The  structure  of  the  ECM  of  the  brain  is  organized  around  hyaluronan  molecules. 

Hyaluronan  is  attached  to  other  proteoglycans  of  the  lectican  family  and  forms  superstructures.  These  superstructures  are  connected  by  different  glycoproteins  such  as  tenascins (Rauch U, 2004).

During  glioma  growth and  migration, the tumor  cells closely interact  with  the ECM  (Bellail AC et al., 2004). Changes in volume, shape and composition of the extracellular space  influence the biological behavior of brain tumors.  In astrocytomas, the extracellular volume  shows a dramatic increase compared to normal  brain cortex  (Zamecnik J, 2005). A positive  correlation  has  been  reported  between  the  size  of  the  extracellular  volume  fraction  and  the  malignancy grade of the tumors (Vargova L et al., 2003). In high grade gliomas there is an  overproduction  of  certain  ECM  glycoproteins  which  stabilize  the  extracellular  volume  and  serve as a substrate for adhesion and migration of the tumor cells. In gliomas, glycoproteins  such as tenascin­C, vitronectin, osteopontin and Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine  (SPARC)  are  frequently  over­expressed.  Malignant  gliomas  contain  higher  amounts  of  hyaluronan than adult brain tissue (Delpech B et al., 1993, Gladson CL, 1999).

The expression of the HA­receptors, CD44 and Receptor for HA Mediated Mobility  (RHAMM), is virtually ubiquitous among glioma cell lines. There is a gradient of expression  amongst gliomas; high grade gliomas expressing more CD44 and RHAMM than lower grade  lesions (Akiyama Y et al., 2001). Integrins are a large family of cell membrane receptors that  mediate  interaction  between  the  cell  and  the  components  of  the  extracellular  matrix. 

Vitronectin  and  tenascin­C  are  among  ECM  ligands  recognized  by  the  integrins  and  their  interaction stimulates cell migration (D’Abaco GM and Kaye AH, 2007). 

1.3.5. Angiogenesis

Angiogenesis consists in the development of new blood vessels from pre­existing ones  and results from an altered balance of proangiogenic and antiangiogenic factors (Foscher I et  al., 2005). The association between tumor growth and angiogenesis is well known (Folkman  J, 1971). High grade gliomas and glioblastomas in particular are among the most vascularized  tumors  in  humans.  Tumor  angiogenesis  occurs  through  several  mechanisms.  Hypoxia  is  considered  a  major  driving  force  of  glial  tumor  angiogenesis  and  leads  to  intracellular  stabilization of the hypoxia­inducible factor 1­a (HIF­1a) (Acker T and Plate KH, 2004). HIF­

1a  accumulation  leads  to  activation  of  many  hypoxia­regulated  genes  such  as  vascular 

endothelial  growth  factor  (VEGF)  which  appears  to  be  the  most  important  mediator  of  glioma­associated vascular dysfunctions. VEGF is produced by perinecrotic palissading cells  as  a  consequence  of  cellular  hypoxia.  VEGF  induces  tumor  angiogenesis  and  increased  vascular permeability (edema) (Acker T and Plate KH, 2004). The expression of VEGF and  VEGF receptors (VEGFR­1 and VEGFR­2) correlates with the grade in diffuse astrocytomas  (Abdulrauf  SI  et  al.,  1998;  Zagzag  D  and  Capo  V,  2002).  Other  angiogenic  factors  are  angiopoietins, in  particular, Ang­1  and  Ang­2  have  been  implicated  in  glioma  angiogenesis  (Zagzag  D  et  al.,  1999). During angiogenesis,  endothelial  cells  must  adhere  to  the  ECM  in  order to proliferate, migrate and maintain an appropriate cell shape.  Attachment and adhesion  of  endothelial  cells  to  the  ECM  is  regulated  by  cell  surface  adhesion  receptors  such  as  integrins (Wang D et al.,  2005). ECM  components such as fibronectin and  tenascin­C have  been  detected  in  the  ECM  surrounding  newly  formed  blood  vessels  in  high  grade  astrocytomas and are recognized as proangiogenic molecules (Wang D et al., 2005). 

Many  authors  have  investigated  the  possible  role  of  adding  vessel  quantification  to routine histologic  grading in  gliomas. The protocol of Weidner et al. is the most frequently  used in order to quantify tumor vascularity. Histochemical or immunohistochemical stains for  endothelium or other vascular wall components (Factor VIII­related antigen, CD34, CD31) is  performed  according  to  standard  methods.  Qualitative  identification  of  the  area  of  highest  vessel density is then performed by either manual or computer­assisted counting (Weidner N  et  al.,  1991;  Folkerth  RD,  2000).  Other  parameters  such  as  vessel  diameter,  perimeter  and  area  may  also  be  evaluated.  A  significant  negative  correlation  has  been  reported  between  increasing microvessel counts and disease­free survival in supra­tentorial astrocytomas (Leon  SP  et  al.,  1996).  Also  microvessel  density  has  been  identified  as  independent  prognostic  marker of survival in fibrillary low grade astrocytomas (Abdulrauf SI et al., 1998). 

1.3.6. Tumor metabolism

Positron  emission  tomography  (PET)  is  a  molecular  imaging  technique  that  uses  radio­labeled molecules to image molecular interactions of biological processes in vivo. PET  can  provide  valuable  metabolic  information  and  is  used  for  characterizing  brain  tumors,  evaluating  response  to  therapy  and  prognosis.  In  brain  tumors,  ¹⁸F­Fluorodeoxyglucose  (FDG) and ¹¹C­Methionine (MET) are the most widely used tracers indicating glucose uptake  and amino acid uptake, respectively. Amino acid PET tracers are more sensitive than FDG in  imaging recurrent tumors and in particular recurrent low­grade tumors. 

1.3.6.1. ¹⁸F­Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography (FDG­PET) FDG­PET depicts  the  increased  capacity  for  glucose  transport  in  malignant  glial  cells. In 1982, Di Chiro et al. reported the successful use of FDG­PET imaging in evaluating  primary  brain  tumors  and  radiation  necrosis  (Patronas  NJ  et  al.,  1982;  Di  Chiro  G  et  al.,  1982). Low grade tumors reveal low levels of metabolism whereas high grade tumors appear  hypermetabolic  compared  to  normal  brain  tissue.  However,  low  grade  oligodendrogliomas  and pilocytic astrocytomas may also appear hypermetabolic on FDG­PET images (Kaschten  B et al., 1998). Metabolic activity of tumor as shown by FDG­PET is also a good indicator of  the prognosis in patients with primary brain tumors (Alavi JB et al., 1988; De Witte O et al.,  1996).  Herholz  et  al.  found  that  cell  density  correlated  significantly  with  FDG  uptake  (Herholz K et al., 1993). However, due to the high rate of physiologic glucose metabolism in  normal  brain  tissue,  low­grade  tumors  with  low  FDG  uptake  may  be  difficult  to  detect  by  FDG­PET. Coregistration of FDG­PET images with MR images in order to delineate area of  interest greatly improves the performance of FDG­PET (Wong TZ et al., 2004). 

1.3.6.2. ¹¹C­Methionine Positron Emission Tomography (MET­PET)

MET­PET  has  the  advantage  of  showing  selective  uptake  in  the  brain  tumor  compared  with  normal  brain  tissue.  Therefore  in  low  grade  gliomas  MET­PET  offers  significantly better contrast than FDG­PET relative to surrounding gray matter activity. The  mechanisms  and  biological  significance  of  tumor  uptake  of  MET  is  not  completely  understood.  Uptake  of  MET  in  gliomas  is  attributed  to  the  activation  of  carrier­mediated  transport at the level of the blood­brain barrier. It does not directly reflect protein synthesis,  but rather the activity of the transport system and incorporation in proteins (Bustany P et al. 

1986; Derlon JM et al. 1989). There is a correlation between MET uptake and the histological  grade  in  gliomas  (Kaschten  B  et  al.  1998). High  MET  uptake  is  associated  with  a  poor  survival time in WHO Grade II and WHO Grade III gliomas (De Witte O et al., 2001).

1.3.6.3. Other PET tracers

Because of the short half­life of ¹¹C (20 minutes), ¹⁸F­labeled aromatic amino acid  analogs  have  been  developed  for  tumor  imaging.  Tumor  uptake  of  O­(2­¹⁸F­fluoroethyl)­

tyrosine (FET) and 3,4­dihydroxy­6­¹⁸F­fluoro­L­phenylalanine (FDOPA) has been reported to  be  similar  to  that  of ¹¹C­methionine  (Weber  WA  et  al.,  2000;  Becherer  A  et  al.,  2003).  The  thymidine  analog  3’­deoxy­3’­¹⁸F­fluorothymidine  (FLT)  PET  was  developed  as  a  non­

invasive method to evaluate tumor cell proliferation (Shields AF et al., 1998). Uptake of ¹⁸F­

FLT  by  tumors  correlates  with  Ki­67  (Chen  W  et  al.,  2005;  Jacobs  AH  et  al.,  2005). ¹⁸F­

Fluoromisonidazole is a nitroimidazole derivative that has been developed as a PET agent to  image hypoxia (Rasey JS et al., 1996). ¹⁸F­Fluoromisonidazole uptake was found in high grade  gliomas but not in low grade gliomas (Cher LM et al., 2006). 

1.4. Neuroimaging of gliomas 

Unlike any other organ in the body the brain has multiple protection layers such as the  skull that ensure a homeostatic environment. The resulting reduced access to the brain and the  absence of plasmatic brain tumor markers bring neuroimaging to the forefront for diagnosis,  preoperative  therapy  planning  as  well  as  for  evaluation  of  treatments.  Un­enhanced  CT  is  usually the first line imaging technique used to evaluate patients with suspected brain tumors  because it is widely available, fast and well tolerated. CT is very sensitive in detecting lesions  associated  with  brain  tumor  such  as  hemorrhage,  calcifications,  mass  effect  and  hydrocephalus.  However  MRI  is  considered  the  current  imaging  standard  for  brain  tumor  patients because of its higher anatomical resolution and higher sensitivity for lesion detection  compared  to  CT.  Moreover  CT  uses  ionizing  radiation  and  the  iodinated  contrast  material  used may cause serious allergic reactions. Gadolinium which is used as contrast agent in MRI  is better tolerated and has a lower risk profile.

1.4.1. Morphologic MR brain imaging 

Morphologic MR imaging is based on anatomic information provided by different MR  sequences (T1­weighted images (WI), T2­WI, Fluid­attenuated inversion recovery (FLAIR),  T1­WI with contrast). This information allows tumor detection and tumor localization with a  high  sensitivity  and  some  degree  of  tumor  characterization,  based  on  the  respective  signal  intensity on the images. 

1.4.1.1. Tumor characterization and grading

Tumors  are  best  detected  on  T2­WI  and  FLAIR  images  and  usually  as  areas  of  high signal intensity. On T1­WI they appear with low signal intensity. Low grade gliomas are  best  depicted  on  FLAIR  images  and  usually  show  minimal  or  no  mass  effect.  Cystic  components within or associated with the tumor can also be detected on T2­WI and FLAIR  images. However the signal intensity of a cyst on FLAIR images is dependent on its protein  content  and  may  be  quite  variable.  Calcifications  and  hemorrhage  are  best  detected  on 

gradient­echo T2­WI and may appear as areas of high signal intensity on non­contrast T1­WI.  

T1­WI with contrast is  one of the most important MR sequences for the characterization of  brain tumors (Felix R et al., 1985). Most high grade gliomas show contrast enhancement due  to destruction of the blood­brain barrier (BBB); whereas low­grade tumors usually show no or  minimal enhancement. MR imaging also depicts signs of increased intracranial pressure and  mass  effect,  as  well  as  edema.  High  grade  tumors  usually  appear  as  a  heterogeneous  mass  which is hypointense on T1­WI and hyperintense on T2­WI and FLAIR images with various  degrees of contrast enhancement and edema. Ring­like enhancement surrounding irregularly  shaped foci of presumed  necrosis is suggestive of  glioblastoma. However anaplastic tumors  can  often  present  as  non­enhancing  lesions.  Lastly,  treatment  induced  changes  such  as  radiation  necrosis  can  be  difficult  to  distinguish  from  recurrent  tumor  by  morphologic  MR  imaging (Levivier M et al., 1996).

1.4.1.2. Stereotactic biopsy guidance and neuronavigation

The first stereotactic frame in humans was used in 1947 (Spiegel EA et al., 1947). 

Preoperative images were used to target an instrument towards a precise location within the  brain.  In order to  perform  this  task  a  frame was  rigidly  attached to  the  head  of  the  patient,  followed  by image  acquisition  resulting in  images with  reference marks  related to  a  frame­

based  coordinate  system.  Using  the  same  coordinate  system,  an  instrument  could  subsequently be guided towards any target depicted on the images. Frames were first adapted  to be used with CT and then MRI (Leksell L et al., 1985). Stereotactic frames are still used in  the treatment of movement disorders, pain disorders, epilepsy, cyst or abscess drainage and  tumor biopsies. Neuronavigation is a technique used for localizing the position of an operative  instrument and neurosurgical image guidance without the use of a head mounted frame. Most  systems are based on the  optical triangulation of  infrared light  sources  fixed  to  the surgical  instrument.  Briefly,  a  navigation  system  is  a  three­dimensional  digitizer  that  correlates  its  measurements to a reference data set, such as the preoperatively acquired MRI image stack. 

This  correlation is  achieved through a  patient­to­image  registration  procedure  resulting  in  a  mathematical  transformation  matrix  mapping  each  position  in  “world  space”  onto  “image  space”. Thus, throughout the remainder of the surgical procedure the position of the surgical  instrument can be demonstrated on a computer screen, relative to MR images (Willems PW et  al.,  2006).  The  standard  imaging  method  for  neuronavigation  is  a  high  resolution  isotropic  T1­WI sequence.