FACULTE DES SCIENCES
Institut de Biologie et Médecine Moléculaire
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire Faculté de Médecine
Génération et analyse phénotypique des souris invalidées pour le récepteur nucléotidique P2Y
13Ben Addi Abduelhakem
Directeur de thèse : Dr. Bernard Robaye
Co-directeur de thèse : Prof. Jean-Marie Boeynaems
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur
en Sciences
Année académique 2007-2008
µ micro
a.a acides aminés
AC Adénylate Cyclase
ADN acides désoxyribonucléiques
ADNc ADN complémentaire
ADNg ADN génomique ARN acide ribonucléique b bases
BMDC cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse
cAMP adenosine monophosphate cyclique
Cellules ES cellules souches embryonnaires
CFA adjuvant complet de Freund CFTR Cystic Fybrosis
Transmembrane Regulator
CHO Chinese Hamster Ovary Ci Curie (unité de
radioactivité)
CNT transporteur concentratif d’adénosine
DC Cellules Dendritiques DNFB 2,4-dinitrofluorobenzene DO densité optique
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
ENT transporteur équilibrant d’adénosine
g gramme
GPCR récepteurs couplés aux protéines G
HCG Hormone chorionique gonadotrope
HPLC High performance liquid chromatography
i.p. intrapéritonéal i.v. intraveineuse Ig Immunoglobuline KLH keyhole limpet hemocyanine
LB lymphocytes B LPS Lipopolysacharide LT lymphocytes T M molaire
min minute n nano
PCR réaction de polymérisation en chaîne
PEF fibroblaste embryonnaire primaire
PLC Phospholipase C PMS Pregnant mare’s serum r.o. rétro orbitale
rad radian
RT Température ambiante s.c. sous-cutané
SPF Animalerie exempt de pathogène
U Unité (activité) U.V. Ultra violet
Chapitre I. Introduction ...3
I.1 Historique ... 3
I.2 Les nucléotides ... 4
I.2.1 Libération des nucléotides dans l’espace extracellulaire ... 4
I.2.2 Situations menant à la libération des nucléotides ... 5
I.2.3 Voies de libération des nucléotides... 6
I.2.4 Métabolisme des nucléotides dans l’espace extracellulaire... 7
I.2.5 Quantification des nucléotides dans l’espace extracellulaire... 9
I.3 Les récepteurs de l’adénosine et des nucléotides extracellulaires ... 10
I.3.1 Les récepteurs P1 ... 10
I.3.2 Les récepteurs P2 ... 12
I.3.2.1 Les récepteurs P2X ... 13
I.3.2.2 Les récepteurs P2Y ... 15
I.3.2.2.1 Nomenclature des récepteurs P2Y ... 15
I.3.2.2.2 Structure des récepteurs P2Y ... 16
I.3.2.2.3 Couplage aux protéines G et voies de signalisation des récepteurs P2Y... 17
I.3.2.2.4 Classification des récepteurs P2Y... 19
I.3.2.2.5 Les différents sous-types P2Y ... 20
I.3.2.2.5.1 Le récepteur P2Y1... 20
I.3.2.2.5.2 Le récepteur P2Y2... 20
I.3.2.2.5.3 Le récepteur P2Y4... 21
I.3.2.2.5.4 Le récepteur P2Y6... 22
I.3.2.2.5.5 Le récepteur P2Y11... 22
I.3.2.2.5.6 Le récepteur P2Y12... 23
I.3.2.2.5.7 Le récepteur P2Y13... 23
I.3.2.2.5.8 Le récepteur P2Y14... 25
I.4 Rôles physiologiques des récepteurs P1 et P2 ... 26
I.4.1 Rôle des récepteurs P1 et P2 dans l’agrégation plaquettaire ... 26
I.4.2 Rôle des récepteurs P1 et P2 dans le système immunitaire ... 28
Chapitre II. But du travail ...32
Chapitre III. Résultats ...33
III.1 Génération des souris P2Y13-/-
... 33
III.1.1 Construction du vecteur d’invalidation... 33
III.1.2 Analyses des cellules ES ... 33
III.1.3 Génération des chimères et production des souris P2Y13-/- ... 34
III.1.4 Vérification de l’invalidation ... 35
III.2 Production et test d’anticorps dirigés contre le récepteur P2Y13 murin ... 36
III.3 Analyse phénotypique des souris P2Y13-/- ... 37
III.3.1 Rôle du récepteur P2Y13 dans le système immunitaire : approches in vivo .. 38
III.3.2 Rôle du récepteur P2Y13 dans la biologie des splénocytes ... 42
III.3.2.1 Rôle du récepteur P2Y13 dans les DC spléniques... 42
III.3.2.2 Expression du récepteur P2Y13 dans les lymphocytes B... 45
III.3.2.3 Expression du récepteur P2Y13 dans les lymphocytes T... 45
III.3.3 Rôle du récepteur P2Y13 dans les DC dérivées de la moelle osseuse (BMDC) ... 46
III.3.4 Rôle du récepteur P2Y13 dans les cellules de Langerhans ... 47
III.3.5 Rôle du récepteur P2Y13 dans la biologie des mastocytes ... 49
III.3.6 Rôle du récepteur P2Y13 dans le pancréas ... 49
III.3.7 Rôle du récepteur P2Y13 dans le foie ... 50
III.4 Rôle des récepteurs P1 dans la biologie des BMDC ... 53
III.4.1 Fonction et expression des récepteurs P1 dans les BMDC ... 53
III.4.2 Voie de signalisation du récepteur A2B... 54
III.4.3 Effet de l’adénosine sur la maturation des BMDC... 54
III.4.4 Régulation de l’expression génique par l’adénosine ... 55
III.4.5 Confirmation des régulations géniques au niveau protéique ... 55
III. 4.7 Effet de l’adénosine sur la capacité des BMDC à activer les lymphocytes T56 III.4.8 Effet de l’adénosine sur la capacité tolérogène des BMDC ... 57
Chapitre IV. Discussion ...58
Annexes ...75
Chapitre I. Introduction
I.1 Historique
La première référence à une activité physiologique des nucléotides dans l’espace extracellulaire date de 1929 [1]. Cette publication stimula les recherches sur l’action cardiovasculaire des nucléotides et nucléosides. Plus tard, les travaux de Holton [2] et de Berne [3] contribuèrent de manière importante à imposer l’idée que les nucléotides et nucléosides extracellulaires ont un rôle physiologique. Ce concept fut consolidé par Rall et Sattin [4, 5] qui étudièrent les mécanismes de transduction impliqués dans la signalisation de l’adénosine extracellulaire.
En 1972, Burnstock postula que l’ATP, via l’activation de récepteurs purinergiques, jouait un rôle de neurotransmetteur au niveau des cellules musculaires lisses du tractus gastro-intestinal et de la vessie [6]. Il proposa ensuite une base de classification des récepteurs purinergiques : les P1 qui sont activés par l’adénosine et les P2 qui sont sélectifs pour les nucléotides. Par la suite, une série d’études démontrèrent l’importance des nucléotides extracellulaires dans la physiologie de l’organisme [7].
Les premières séquences de récepteurs purinergiques furent identifiés en 1989 avec le clonage, dans notre laboratoire, de plusieurs récepteurs couplés aux protéines G [8-10].
Depuis lors, la liste des récepteurs clonés s’est considérablement allongée et une nouvelle classification basée sur les homologies de séquences s’est imposée [11]. De plus étant donné l’existence de récepteurs pyrimidinergiques (activés par l’UTP ou l’UDP), l’appellation
« récepteurs purinergiques » fut abandonnée au profit de « récepteurs nucléotidiques ».
Enfin, l’invalidation génique des récepteurs nucléotidiques et des enzymes qui régulent leur disponibilité dans l’espace extracellulaire a permis de mieux comprendre les mécanismes d’actions de ces derniers et d’étendre la connaissance sur leurs multiples fonctions [12-15]
I.2 Les nucléotides
Les nucléotides et nucléosides sont des molécules essentielles à la vie. En effet, ils constituent les unités de base dans les acides nucléiques (ADN et ARN). D’autre part, l’ATP est la principale source d’énergie directement utilisable pour les cellules mais est aussi le précurseur d’un certain nombre de cofacteurs enzymatiques essentiels tels que le NAD+ ou le coenzyme A. L’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est l’une des molécules clés dans la signalisation intracellulaire. Enfin, les nucléotides et nucléosides forment une famille de molécules impliquées dans la communication intercellulaire. Cette dernière fonction sera détaillée dans les paragraphes suivants.
Un nucléoside est composé d’un sucre à cinq carbones (ribose) et de l’une des 5 bases azotées : adénine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) et uracile (U). Les 2 premières bases sont appelées purines. Les 3 dernières constituent les pyrimidines. La liaison d’un ou plusieurs groupements phosphates aux nucléosides conduit à la formation des nucléotides mono-, di- et triphosphates (figure I.1).
I.2.1 Libération des nucléotides dans l’espace extracellulaire
Les mécanismes et les voies de libération des nucléotides dans l’espace extracellulaire ne sont pas toujours aisés à définir. Néanmoins, plusieurs groupes ont démontré que la libération des nucléotides dans l’espace extracellulaire est un phénomène contrôlé.
La libération d’ATP a été étudiée en utilisant différentes méthodologies sur divers types cellulaires (voir paragraphe I.2.5). Bien que la présence d’ADP et d’adénosine dans l’espace extracellulaire puisse résulter de l’hydrolyse de l’ATP (voir paragraphe I.2.4), ces purines sont susceptibles d’être libérées directement [16, 17]. De plus, l’existence de récepteurs pyrimidinergiques laisse penser que d’autres types de nucléotides sont libérés. En effet l’UTP mais également l’UDP-glucose sont déversés, par des mécanismes contrôlés, dans l’espace extracellulaire [18].
Outre la libération des nucléotides « classiques », les diadénosines polyphosphates (Ap3A, Ap4A, Ap5A, Ap6A) sont également sécrétés dans l’espace extracellulaire. Ces molécules
agissent sur différents récepteurs P2 et leur hydrolyse génère de l’ATP, de l’ADP et de l’adénosine [19].
I.2.2 Situations menant à la libération des nucléotides
La lyse cellulaire est une source majeure de nucléotides dans l’espace extracellulaire. En effet, la concentration intracellulaire d’ATP est de l’ordre de 5 mM. La libération, même partielle, du contenu cellulaire permet d’atteindre des concentrations locales d’ATP de l’ordre de 20µM [20, 21].
Outre la lyse cellulaire, les nucléotides peuvent être libérés par exocytose. Les neurones, plaquettes, mastocytes,…contrôlent la libération d’ATP et d’autres médiateurs extracellulaires en les empaquetant dans des granules sécrétoires tels que les vésicules synaptiques [22-24].
Une libération de nucléotides par un mécanisme n’impliquant ni la lyse cellulaire ni l’exocytose a été démontrée dans quatre situations : lors de stress mécanique, en condition d’hypoxie, après stimulation par un agoniste ou encore spontanément [25, 26].
• La libération d’ATP lors d’un stress mécanique est un processus physiologique régulé et qui n’implique pas de lyse cellulaire. Le changement de milieu de culture, du débit de flux sanguin ou encore des exercices musculaires constituent des stimulations mécaniques suffisantes pour induire une libération d’ATP [27-29]. Ce phénomène semble être important pour le contrôle du volume cellulaire [30]. Les cellules épithéliales, par exemple, sont particulièrement sensibles aux forces mécaniques. Il a été montré que la distension de la vessie chez la souris induit la libération par l’épithélium d’ATP qui, en stimulant les terminaisons nerveuses sub-épithéliales, permet au système nerveux autonome de contrôler les réflexes du remplissage de la vessie [31].
• Un défaut d’apport en oxygène peut avoir de graves conséquences pour les tissus.
L’inflammation, l’ischémie ou la présence d’une tumeur sont des conditions pouvant conduire à l’hypoxie [32-34]. Lorsque l’oxygène vient à manquer, des modifications significatives du métabolisme apparaissent. Ces changements coïncident avec une
diminution d’ATP intracellulaire et une augmentation importante de l’adénosine extracellulaire [35-39].
• Des exemples de libération d’ATP suite à une stimulation par un agoniste ont été rapportés par plusieurs groupes. Yang et ses collaborateurs ont montré que les cellules endothéliales isolées à partir de cœurs de cochons d’inde libèrent des nucléotides en réponse à la bradykinine, la sérotonine et l’acétylcholine [40]. Des molécules exogènes, telles que l’oxazolone, peuvent également stimuler la libération d’ATP et d’ADP par des kératinocytes [41]. Les nucléotides peuvent également induire leur propre libération.
I.2.3 Voies de libération des nucléotides
La libération de nucléotides intervient dans diverses situations. Les mécanismes cellulaires qui contrôlent ce phénomène sont multiples et variés. Plusieurs pistes, parfois controversées, ont été investiguées. Des canaux et des protéines de transport sont supposés intervenir dans la sécrétion des nucléotides [26].
• Les protéines liant l’ATP (ATP-Binding Cassete proteins), telles que la P- glycoprotéine et le CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), et les connexines formeraient des canaux permettant la libération de l’ATP. Néanmoins, il n’existe pas d’évidence permettant d’affirmer qu’elles soient directement liées à ce phénomène [42-44].
• Les transporteurs d’adénosine et en particulier les ENTs (Equilibrative Nucleoside Transporters) libèrent des quantités non négligeables de ce nucléoside dans l’espace extracellulaire. En effet, l’augmentation de la concentration d’adénosine intracellulaire, lors d’une consommation importante d’ATP, peut mener à la libération d’adénosine dans l’espace extracellulaire via les ENTs [45-48].
• La libération contrôlée de nucléotides dans l’espace extracellulaire peut également se faire via le transport vésiculaire. Ce processus débute avec le transport de nucléotides dans les vésicules du Golgi et fait intervenir des protéines telles que Mcd4p et V-
ATPase [24]. Cependant le rôle précis de Mcd4p dans le transport d’ATP et son interaction avec le complexe V-ATPase ne sont pas encore connus.
I.2.4 Métabolisme des nucléotides dans l’espace extracellulaire
Les effets physiologiques des purines et pyrimidines dépendent essentiellement de la présence de leurs récepteurs à la surface membranaire. Néanmoins, la disponibilité des nucléotides et nucléosides dans l’espace extracellulaire est un mécanisme supplémentaire de contrôle sur l’action de ces récepteurs. Ce niveau de régulation est apporté par des ecto-nucléotidases qui métabolisent très rapidement les nucléotides. Ainsi, le temps de demi-vie de l’ATP dans le sang, par exemple, est de l’ordre de la seconde [49].
Ces ecto-enzymes sont exprimées par un grand nombre de types cellulaires. Les ecto- nucléotidases peuvent être membranaires ou solubles. Les formes solubles sont parfois issues de la dégradation protéolytique des domaines extracellulaires de leurs formes membranaires.
Certaines de ces enzymes participent à la dégradation des nucléotides alors que d’autres les régénèrent. Le métabolisme des nucléotides est assuré par plusieurs familles d’enzymes : les ecto-nucléoside triphophate diphosphohydrolases (E-NTPDases), les ecto-nucléotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (E-NPPs), les phosphatases alcalines, l’ecto-5’- nucleotidase, l’ecto-nucléoside diphosphokinase (ecto-NDPK) et l’adénylate kinase.
• Les E-NTPDases, appelées également apyrases, hydrolysent les nucléosides triphosphates (NTPs) et les nucléosides diphosphates (NDPs) en leur nucléoside monophosphate (NMP) correspondant. Huit membres de cette famille ont été recensés : E-NTPDases 1-8. Tous ont en commun cinq domaines extrêmement conservés qui sont essentiels pour leur activité catalytique. Certaines de ces isoenzymes sont associées à la surface cellulaire alors que d’autres sont intracellulaires. La sélectivité des différents membres pour les NTPs et les NDPs est variable. L’E-NTPDase-1, appelé également CD39, a la même affinité pour les NTPs et les NDPs alors que l’E-NTPDase-2 (CD39L1) hydrolyse préférentiellement les nucléosides triphosphates (ratio 1:0.03) [50-52].
• La famille des E-NPPs comprend cinq membres : E-NPP-1-5. Les isoformes 1-3 sont des métalloenzymes constituées d’une extrémité aminoterminale cytoplasmique, d’un seul domaine transmembranaire et d’une extrémité carboxyterminale extracellulaire
qui contient le site catalytique. Ces isoenzymes hydrolysent les NTPs, les NDPs, l’AMPc et l’UDP-glucose en leur NMP correspondant.
• Les phosphatases alcalines (AP) ont la particularité de catalyser l’ensemble des étapes de la conversion des NTPs en leur nucléoside correspondant. Cette famille contient quatre membres : l’AP intestinale ( I AP), l’AP tissu non spécifique (NS AP), l’AP placentaire (PLA AP) et l’AP des cellules germinales (G AP).
• L’ecto-5’-nucléotidase, appelée également CD73, est une enzyme liée à la membrane par une ancre glycosylphosphatidylinositol et qui convertit les NMPs en leur nucléoside correspondant et en phosphate inorganique.
• Les nucléotides extracellulaires sont des substrats d’enzymes qui participent à l’inter conversion et à la préservation des nucléotides triphosphates. Plusieurs groupes ont décrit l’activité de l’ecto-nucléoside diphosphokinase à la surface des cellules 1321N1 (lignée astrocytaire humaine), des gliomes de rats (lignée C6) et des cellules épithéliales. Cette enzyme catalyse la transphosphorylation des nucléotides diphosphates en leur NTP correspondant [53, 54].
• L’adénylate kinase catalyse, de manière réversible, la conversion de deux molécules d’ADP en ATP+AMP [55-57]. Contrairement à l’ecto-NDPK, cette enzyme n’est sélective que pour les purines.
L’adénosine, libérée ou générée dans l’espace extracellulaire, active une famille de récepteurs membranaires (voir paragraphe I.3.1). Sa disponibilité est également régulée par des protéines de transport (ENTs et CNTs) et des enzymes de dégradation (adénosine désaminase)
• Les protéines ENT 1 et 2 sont des transporteurs qui équilibrent les concentrations d’adénosine tandis que les CNT1 et 2 sont des transporteurs qui concentrent le nucléoside. Le niveau d’expression de ces protéines permet de contrôler de part et d’autre les quantités d’adénosine disponibles [58].
• L’adénosine désaminase (ADA) catalyse la désamination de l’adénosine en inosine. Cette enzyme est présente dans et à la surface des cellules [59].
L’ecto-ADA s’associe à des protéines membranaires telles que CD26 ou le récepteur A2B [60].
I.2.5 Quantification des nucléotides dans l’espace extracellulaire
Estimer la quantité de nucléotides dans l’espace extracellulaire est rendu difficile par un certain nombre de problèmes techniques. La centrifugation, le changement de milieu, ou encore la purification de cellules induisent déjà une libération de grandes quantités de nucléotides (voir paragraphe I.2.2). Les cellules détériorées fournissent un autre facteur de confusion dans l’interprétation des mesures de nucléotides extracellulaires. De plus, le métabolisme des nucléotides dans le milieu extracellulaire (voir paragraphe I.2.4) est également un phénomène qui rend difficile l’estimation des quantités et de la nature des différents nucléotides libérés.
Les nucléotides peuvent être quantifiés par différentes méthodes : l’HPLC, la bioluminescence, les biosenseurs,…
• L’HPLC permet de quantifier les différents nucléotides dans les surnageants cellulaires. Les concentrations estimées avec cette méthode sont de l’ordre du nanomolaire avec des différences notables en fonction des tissus et des conditions expérimentales. Ce procédé a pour inconvénient tenir compte uniquement des quantités de nucléotides et nucléosides résultantes mais pas de celles qui sont réellement libérées [61].
• La détection d’ATP par bioluminescence à la surface extracellulaire a été rendue possible grâce à une protéine chimérique composée de la luciférase et de la protéine A [62]. La luciférase, en présence d’ATP, catalyse la transformation de la luciférine en luciferyl adenylate qui réagit ensuite avec l’O2 pour générer de l’oxyluciférine et des photons. La protéine A a pour rôle de lier les immunoglobulines d’isotype G (IgG). En pratique, les cellules sont d’abord incubées avec des IgG dirigées contre l’un de leurs épitopes extracellulaires puis avec la protéine chimérique. La lumière émise lors de la réaction est quantifiée à l’aide d’un luminomètre. Cette procédure a permis de mettre en évidence des concentrations locales d’ATP de l’ordre du micromolaire. Cette
méthode a deux avantages : elle permet de détecter l’ATP à la surface directement après sa libération dans le milieu extracellulaire et de suivre ce phénomène sur des temps très courts.
• Les cellules qui expriment des récepteurs de nucléotides peuvent être utilisées comme biosenseurs. En effet, la mesure des changements en messager secondaire (par exemple le ∆Ca2+) induit par les nucléotides permet d’estimer indirectement la concentration des nucléotides à la surface extracellulaire [63]. Cependant cette méthode est peu quantitative et possède plusieurs inconvénients.
I.3 Les récepteurs de l’adénosine et des nucléotides extracellulaires
Les nucléotides et nucléosides exercent leurs effets paracrines et/ou autocrines en activant des récepteurs présents à la surface membranaire des cellules (figure I.2). Bien que la variété des nucléotides et nucléosides connus pour activer ces récepteurs soit assez limitée (ATP, ADP, adénosine, UTP, UDP et UDP-glucose), le nombre de récepteurs identifiés à ce jour est nettement plus important.
La première subdivision de ces récepteurs permet de différencier les récepteurs de l’adénosine (P1) des récepteurs P2 qui sont activés par les nucléotides mentionnés ci-dessus. Cette classification, initialement basée sur des données pharmacologiques, s’est maintenue bien que les critères actuellement pris en compte soient structurels.
I.3.1 Les récepteurs P1
La subdivision initiale des récepteurs de l’adénosine en sous-types A1 et A2 était basée sur l’affinité de ceux-ci pour des agonistes et des antagonistes [64, 65]. Par la suite, la distinction entre les sous-types A2A et A2B fut également basée sur des données pharmacologiques [66].
Depuis lors, ces récepteurs ont été clonés et caractérisés [67].
Actuellement, la famille P1 compte 4 membres distincts : A1, A2A, A2B et A3 (Tableau I.1).
Leurs structures génomiques sont similaires avec un seul intron dans la région codante.
Plusieurs groupes ont montré l’existence de transcrits de tailles différentes pour chacun de ces
récepteurs [68-71]. Néanmoins, ces transcrits ne seraient pas les produits d’épissage alternatif mais seraient plutôt dus à un contrôle de la transcription par des séquences promotrices distinctes [72].
Les récepteurs de l’adénosine sont des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (GPCR). Tous modulent l’activité de l’adénylate cyclase. Les récepteurs A1
[73] et A3 [74] sont couplés négativement à cette enzyme via la protéine Gi/o tandis que les récepteurs A2A [75] et A2B [76] l’activent via la protéine Gαs. Certains récepteurs P1 peuvent également être couplés à d’autres protéines G comme Gαq [77, 78].
Les récepteurs P1 sont exprimés dans divers tissus. Leurs distributions tissulaires ont été établies par des études de liaison aux radioligands, par RT-PCR ou encore à l’aide d’anticorps. Généralement leurs transcrits et protéines sont colocalisés. Néanmoins, il a été montré que la distribution protéique du récepteur A1, par exemple, est différente de celle du transcrits dans le système nerveux central du rat et de la souris [79]. Les fonctions des récepteurs P1 sont très variées [67, 80].
Le récepteur A1
Le récepteur A1 est fortement exprimé dans le système nerveux central et en particulier dans le cortex cérébral, le cervelet, l’hippocampe, le thalamus ainsi que la moelle épinière [81]. Ce récepteur est impliqué dans les effets sédatif et anxiolytique de l’adénosine dans le système nerveux central [82, 83]. Plusieurs études ont montré que le récepteur A1 protège le cœur [84], les poumons [85] et le cerveau [85] des lésions d’ischémie reperfusion. Ces résultats ont été renforcés par la démonstration que la surexpression du récepteur A1 dans le cœur de souris transgéniques résulte en une protection substantielle contre les dégâts dus à l’ischémie reperfusion [86]. D’autre part, les souris invalidées pour le récepteur A1 montrent des signes d’anxiété plus importants et d’hyperalgésie [87] ainsi qu’une diminution de la fertilité chez les mâles [88].
Le récepteur A2A
Le récepteur A2A est présent en forte quantité dans la rate, le thymus, les leucocytes (lymphocytes et granulocytes), les plaquettes et les neurones du striatum [89, 90]. Il est impliqué dans la vasodilatation [91], l’inhibition de l’agrégation plaquettaire [92] ainsi que dans le système immunitaire. Ces deux dernières fonctions seront détaillées dans les
paragraphes suivants. Les souris déficientes en récepteur A2A montrent une activité exploratoire diminuée, plus d’agressivité et de l’hypoalgésie [93]. De plus, la pression sanguine, la fréquence cardiaque et l’agrégation plaquettaire sont plus élevées chez ces souris [93]. Les souris A2A-/-
sont également moins protégées contre les dégâts causés par des réponses inflammatoires [94].
Le récepteur A2B
Le transcrit du récepteur A2B est détecté dans plusieurs tissus mais à une faible intensité. Les tissus où il est le plus fortement exprimé sont le caecum, le colon et la vessie [71]. L’absence de ligand sélectif pour le récepteur A2B fait que très peu de données sur sa fonction sont disponibles. Tout comme le récepteur A2A, le récepteur A2B est impliqué dans la vasodilatation [95] et le système immunitaire [96]. La récente génération des souris A2B-/-
a permis de démontrer le rôle anti-inflammatoire de ce récepteur [97] et son implication dans le contrôle de la dégranulation des mastocytes [98].
Le récepteur A3
Bien que la distribution du récepteur A3 soit assez large chez la plupart des animaux, il existe des différences importantes de son niveau d’expression entre les espèces. Chez le rat, le récepteur A3 est fortement exprimé dans les spermatocytes et les spermatides alors qu’il l’est plus modérément dans les poumons [99]. Chez l’homme, au contraire, le récepteur A3 est principalement détecté dans le foie et les poumons [100]. Ce récepteur est impliqué dans les réponses allergiques [101], l’apoptose [102, 103] et le contrôle du cycle cellulaire [104]. La délétion du récepteur A3 chez la souris a d’abord permis de confirmer son rôle dans les cellules du système immunitaire [105]. D’autre part, les conséquences de l’ischémie reperfusion sur les cœurs des souris A3-/- sont moins importantes que sur ceux des souris sauvages [106]. Contrairement au récepteur A1, le récepteur A3 semblerait exacerber les lésions dues à l’ischémie reperfusion.
I.3.2 Les récepteurs P2
La famille des récepteurs P2 englobe deux groupes de protéines membranaires : P2X et P2Y.
Ces deux sous-familles sont très différentes quant à leurs structures moléculaires et à leurs modes d’activation.
I.3.2.1 Les récepteurs P2X
Les récepteurs P2X sont des canaux ioniques qui s’ouvrent en réponse à la liaison avec l’ATP extracellulaire. A ce jour, sept membres de cette famille ont été clonés et caractérisés : P2X1-7. La longueur de leurs gènes est très variable mais leur structure est assez conservée.
Les séquences génomiques comportent entre 11 et 13 exons. Plusieurs variants de transcrits pour chaque récepteur P2X ont été rapportés [107].
Les protéines des récepteurs P2X ont une longueur qui varie entre 384 et 595 a.a. Le degré d’identité entre leurs séquences protéiques varie entre 26 et 50% [108]. La région la moins conservée est l’extrémité carboxy-terminale. La structure tertiaire des récepteurs P2X consiste en deux régions transmembranaires hydrophobes, une large boucle extracellulaire et deux extrémités (amino- et carboxy-terminales) cytoplasmiques (figure I.3). Des données pharmacologiques indiquent que ces récepteurs s’associent en multimères pour être fonctionnels [109]. La stoechiométrie de ces assemblages impliquerait trois sous-unités qui forment un trimère [110]. La plupart des récepteurs P2X s’associent en homomères et/ou hétéromères. Cependant, le récepteur P2X6 ne peut former d’homomère fonctionnel tandis que le récepteur P2X7 ne semble former que des homomères. D’autre part des variants d’épissage peuvent s’associer avec la forme longue du récepteur pour former des canaux ioniques fonctionnels [111].
L’activation des récepteurs P2X entraîne une entrée, dans les cellules, de calcium extracellulaire (ainsi que de K+ et de Na+) qui est suivie par une rapide dépolarisation membranaire (de l’ordre de 10 ms) [112]. Cette dernière étape peut mener à l’activation de canaux ioniques voltage-dépendant (canaux calcique de type L), et à l’activation des MAP kinases ERK-1 et -2 [113]. La sélectivité des récepteurs P2X pour ces cations dépend de la nature des multimères formés [114]. L’activation des récepteurs P2X est généralement suivie par la désensibilisation plus ou moins rapide de ceux-ci. D’autre part, une stimulation prolongée les conduit à former des pores ioniques non sélectifs [115, 116].
Le ligand naturel des récepteurs P2X est essentiellement l’ATP. Néanmoins, il a été montré que le transfert de groupements ADP-ribose à partir du NAD+ extracellulaire sur certains résidus du récepteur P2X7 entraîne l’activation de celui-ci [117]. Plusieurs agonistes et antagonistes, généralement des dérivés peu sélectifs de l’ATP, ont été synthétisés.
L’interaction entre les récepteurs P2X et leur agoniste naturel a été étudiée en détail sur l’homomère P2X2. Ding et al ont montré que l’activation de ce récepteur nécessite la liaison de trois molécules d’ATP [118]. Du point de vue pharmacologique, les différentes sous-unités P2X sont relativement aisées à discriminer. Ainsi, les récepteurs P2X1 et P2X3 ont une haute affinité pour l’ATP (EC50 = 1 µM), sont rapidement activés (0,01-0,1 s) et désensibilisés (0,1- 10 s). Les récepteurs P2X2, P2X4, P2X5 et P2X6 ont une affinité plus faible pour l’ATP (10 µM) et sont désensibilisés plus lentement. Le récepteur P2X7 a une faible affinité pour l’ATP (300-400 µM) et est peu ou pas désensibilisé [119]. Les hétéromères, par contre, sont plus difficiles à différencier car ils présentent des profils pharmacologiques mixtes, caractéristiques des sous-unités P2X qui les composent.
Tout comme les récepteurs P1, les récepteurs P2X sont exprimés dans la plupart des tissus. La présence de récepteurs fonctionnels a été démontrée dans les neurones, les cellules gliales, les os, les muscles, les cellules endothéliales, épithéliales et hématopoïétiques [107, 120].
Un grand nombre de publications ont montré que les récepteurs P2X jouent d’importantes fonctions dans les systèmes nerveux central et périphérique. En effet, les récepteurs P2X sont impliqués dans la transmission synaptique rapide [121], la libération de neurotransmetteurs [122] ou encore dans la génération des signaux nociceptifs [123]. Ces récepteurs modulent également les réponses immunes. Nous reviendrons sur ce point dans les paragraphes suivants. La génération de souris transgéniques pour les récepteurs P2X a permis de confirmer et d’approfondir les connaissances sur leurs fonctions physiologiques. Chez les souris P2X1-/-, la fertilité des mâles est réduite de 90% [124]. Ce phénotype n’est pas lié à un défaut intrinsèque aux spermatozoïdes mais à une réduction du nombre de ceux-ci dans l’éjaculat, résultant d’une moindre contraction des canaux déférents lors de la stimulation du système nerveux sympathique. La délétion du récepteur P2X2 chez la souris a permis de démontrer que celui-ci médie les effets de l’ATP sur la ventilation en condition d’hypoxie [125]. Les souris déficientes en récepteur P2X3 ont un comportement associé à une moindre sensibilité à la douleur ainsi qu’à une diminution des réflexes de vidange de la vessie caractérisée par une baisse de la fréquence urinaire et une augmentation du contenu de la vessie [126]. A ce jour, aucune souris transgénique pour les récepteurs P2X4, P2X5 et P2X6 n’a été décrite. La génération des souris P2X7-/-
a permis de démontrer que les effets pro-inflammatoires et pro- apoptotiques de l’ATP sur les macrophages et les monocytes sont dus à ce récepteur [127, 128]. De plus, ces souris présentent des altérations au niveau des os : diminution de la
formation du périoste et augmentation de la résorption des trabécules du tibia [129]. Par ailleurs, il a été montré que des mutations ponctuelles pouvaient affecter la fonctionnalité et l’expression du récepteur P2X7 chez la souris consanguine C57BL/6 [130] et chez l’homme [131].
I.3.2.2 Les récepteurs P2Y
I.3.2.2.1 Nomenclature des récepteurs P2Y
Les récepteurs P2Y sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (GPCR, figure I.4). L’appellation P2Y est utilisée pour tous récepteurs fonctionnels qu’ils soient de mammifères ou non. Les récepteurs orphelins de mammifères qui sont potentiellement des P2Y ainsi que les récepteurs fonctionnels qui n’ont pas d’orthologue chez les mammifères sont dénommés p2y. Le chiffre en indice (P2Y1-n ou p2y1-n) liste les récepteurs dans l’ordre chronologique suivant lequel ils ont été identifiés.
Les premiers récepteurs P2Y furent clonés en 1993 dans deux laboratoires différents [132, 133]. Ils correspondaient à des récepteurs dont l’existence avait précédemment été prédite par des données pharmacologiques : P2Y1 (anciennement P2Y) et P2Y2 (anciennement P2U).
Depuis lors, d’autres récepteurs ont été isolés à l’aide du clonage de gènes par homologie et un chiffre en indice leur a été assigné dans l’ordre chronologique suivant lequel ils ont été découverts (P2Y4, P2Y6 et P2Y11). Alors qu’il était attendu depuis longtemps, le récepteur de l’ADP couplé à une protéine Gαi exprimé dans les plaquettes (anciennement P2T) a été isolé tardivement et a reçu l’appellation P2Y12 [134]. Les récepteurs P2Y13 et P2Y14 sont les deux derniers apparus dans cette famille. A l’heure actuelle, la famille des récepteurs P2Y humains comprend huit membres (Tableau I.2) : P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y13 et P2Y14
[135]. Tous ces récepteurs, à l’exception de P2Y11, ont également été isolés chez la souris.
Les chiffres en indice manquants représentent soit des protéines présentes uniquement chez des espèces non mammifères soit des récepteurs orphelins dont les séquences sont proches de celles des P2Y, mais pour lesquels il n’y pas d’évidence qu’ils sont activables par des nucléotides. Les récepteurs p2y3 aviaire et p2y8 du xénope seraient les orthologues de P2Y6 [136] et P2Y4 [137], respectivement. Les récepteurs p2y7 [138] et p2y9 [139] se sont avérés être des récepteurs du leucotriène B4 et de l’acide lysophosphatidique, respectivement. Les récepteurs p2y5 [140] et p2y10 [141] sont encore considérés comme des récepteurs orphelins
malgré que le récepteur p2y5 humain semble répondre à l’ATP [142]. Enfin, Inbe et al avaient proposé que le récepteur p2y15 était activé par l’AMP [143] mais un autre groupe a formellement établi qu’il s’agissait d’un récepteur de l’α-cétoglutarate [144].
I.3.2.2.2 Structure des récepteurs P2Y
Contrairement aux récepteurs P2X, les gènes des récepteurs P2Y ne contiennent pas d’intron dans leur séquence codante, à l’exception du récepteur P2Y11 [145].
Les récepteurs P2Y ont une longueur qui varie entre 308 et 379 acides aminés, une masse de 41-53 kDa (après glycosylation) et une identité des séquences protéiques qui varie entre 19 et 55%. Leur structure tertiaire consiste en sept hélices alpha transmembranaires relativement bien conservées, une extrémité amino terminale extracellulaire qui contient des sites potentiels de glycosylation, et une queue carboxy terminale intracellulaire qui contient des sites consensus de phosphorylation par des protéines kinases. Les sept zones transmembranaires accolées formeraient un puit central susceptible d’interagir avec les ligands. Le modèle moléculaire de cette famille est basé sur des informations structurelles obtenues sur la rhodopsine et la bactériorhodopsine [146]. Ces données ont permis de proposer que plusieurs résidus des domaines transmembranaires 3, 5, 6 et 7 interagissent avec les ligands. En effet, des études de mutagenèses dirigées sur les récepteurs P2Y1 et P2Y2 ont montré que la substitution de résidus polaires par des acides aminés neutres dans ces zones diminuait les réponses aux stimulations par les agonistes [147, 148]. Les boucles extracellulaires 2 et 3 semblent également être impliquées dans la reconnaissance des ligands [149, 150]. La glycosylation de l’extrémité amino terminale est essentielle pour la transduction des signaux intracellulaires mais pas pour la liaison des ligands [151]. Il a été montré que certains résidus de l’extrémité carboxy terminale sont cruciaux pour la liaison des récepteurs aux protéines G [152].
Les GPCRs forment aussi bien des homodimères que des hétérodimères avec des récepteurs de la même famille ou avec des GPCRs d’autres familles. Le seul exemple, bien caractérisé, d’hétérodimérisation impliquant un récepteur P2Y est l’assemblage P2Y1/A1 [153]. Ce couplage donne lieu à un récepteur présentant un profil pharmacologique mixte ainsi que des caractéristiques uniques.
I.3.2.2.3 Couplage aux protéines G et voies de signalisation des récepteurs P2Y
Les récepteurs P2Y sont couplés à des protéines G trimériques (α, β, γ) spécifiques [154, 155]. Ils sont également susceptibles de se lier à une ou plusieurs protéines G différentes [156]. Le couplage d’un récepteur P2Y à plusieurs protéines G implique, d’une part, la capacité d’activer simultanément plusieurs voies de signalisation, et, d’autre part, la possibilité d’activer l’une ou l’autre de ces voies en fonction du ligand et donc de la conformation active du récepteur. L’activation du récepteur P2Y11, par exemple, par l’ATP génère une augmentation du taux d’AMPc et d’inositol trisphosphate (et donc de calcium cytoplasmique) alors que l’UTP induirait uniquement une élévation de calcium intracytoplasmique sans avoir d’effet sur l’AMPc [157].
Les protéines G impliquées dans les cascades de transduction des récepteurs P2Y sont des hétérotrimères αβγ qui forment une vaste famille de protéines assurant un couplage spécifique entre les récepteurs et leur(s) système(s) effecteur(s). Elles sont constituées d’une sous-unité α (Gα) et d’un dimère βγ (Gβγ) indissociable. Ce complexe est situé à la face cytoplasmique de la membrane plasmique. A l’état basal, la sous-unité α lie le GDP et forme un complexe de haute affinité avec l’hétérodimère βγ. Lorsque l’agoniste se lie au récepteur, il modifie la conformation de ce dernier et permet ainsi son interaction avec la protéine Gα. Cette liaison favorise l’échange GDP/GTP au niveau du site nucléotidique de la sous-unité α, ce qui provoque la dissociation du récepteur, de la sous-unité α et du complexe βγ. Les complexes α- GTP et βγ interagissent de manière spécifique avec leurs effecteurs (enzymes ou canaux ioniques). La réassociation des sous-unités de la protéine G s’opère grâce à l’activité GTPase intrinsèque de la sous-unité α qui hydrolyse le GTP en GDP et replace le système dans son état basal.
Les protéines G ont été classées en fonction de la nature de leur sous-unité α avec l’idée que seul celle-ci pouvait activer un système effecteur en aval. Elles se répartissent en quatre familles (Gs, Gi, Gq et G12) sur base de leur structure primaire [158]. D’autre part, plusieurs sous-unités β et γ ont été décrites [159]. Les complexes βγ seuls ou en combinaison avec les sous-unités α jouent un rôle important dans la régulation des messagers secondaires [160]. Les multiples combinaisons possibles résultant de l’association en hétérotrimère donnent une idée de l’extrême complexité des cascades de transduction des signaux.
Les voies effectrices classiques des GPCRs impliquent des phospholipases C (PLC), des adénylates cyclases (AC), des canaux ioniques ou encore la cascade des MAPKinases
Les PLC hydrolysent le phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2) et entraînent la formation de deux messagers secondaires intracellulaires : l’inositol(1,4,5)trisphosphate cytosolique (IP3) et le diacylglycérol membranaire (DAG). A ce jour, une dizaine de PLC ont été identifiées (sans tenir compte des variants d’épissage) et ont été classées en trois catégories sur une base structurelle : (PLCβ,γ,δ). L’IP3 induit une libération de Ca2+ à partir des réserves du réticulum endoplasmique. En présence de Ca2+, le DAG active des protéines kinases C (PKC) qui phosphorylent une série de protéines cytoplasmiques. Les PKC exercent également un rétrocontrôle négatif sur la réponse cellulaire en déstabilisant les GPCRs par phosphorylation.
Les AC sont des enzymes membranaires qui transforment l’ATP en AMPc. Neuf isoformes membranaires et une soluble ont été dénombrées [161]. Elles se différencient les unes des autres par leur distribution tissulaire et leur sensibilité aux protéines G, aux kinases ou encore à la concentration intracellulaire en Ca2+. L’AMPc généré va permettre l’action des protéines kinases A (PKA) qui interviennent dans la phosphorylation de nombreux substrats, la désensibilisation des GPCRs et l’inhibition de certaines AC.
Les récepteurs couplés aux protéines G peuvent moduler l’activité des canaux ioniques [162]. La régulation de ces canaux peut être secondaire à une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire. Néanmoins, il a été démontré que les sous-unités Gβγ pouvaient inhiber directement les canaux calciques de type N [163]. De plus, la mise en évidence d’une interaction directe entre le récepteur β2-adrénergique et l’échangeur Na+/H+, indépendamment d’un effet direct ou indirect des protéines G, augmente encore la complexité des interactions entre ces récepteurs et les protéines effectrices [164].
Les MAPKinases (Mitogen-Activated Protein Kinases ; ERK-1 et ERK-2) sont classiquement considérées comme des points de convergence des signaux mitogéniques. Elles relaient le signal mitogénique vers le noyau et modulent l’activité de facteurs de transcription.
Ces sérine/thréonine kinases peuvent être activées via des mécanismes intracellulaires complexes qui impliquent une cascade de phosphorylation induite par des récepteurs qui ont une activité tyrosine kinase (par exemple des récepteurs de facteurs de croissance), une
transactivation de ces mêmes récepteurs par des GPCRs [165] ou une activation directe par les GPCRs [166]. Dans certains cas, il semble que l’activation des protéines ERKs par les GPCRs requiert au préalable que ces derniers soient internalisés [167].
I.3.2.2.4 Classification des récepteurs P2Y
Du point de vue pharmacologique les récepteurs P2Y peuvent être subdivisés en quatre groupes :
• les récepteurs P2Y1,11,12,13 qui répondent préférentiellement aux nucléotides adényliques (ADP et ATP) ;
• les récepteurs P2Y4 humain,6 activés par les nucléotides uridyliques (UDP et UTP) ;
• les récepteurs P2Y2,4 rongeur qui ont une sélectivité mixte; et
• le récepteur P2Y14 liant l’UDP-glucose et l’UDP-galactose.
Du point de vue phylogénique et structurel (séquences protéiques), deux sous-groupes distincts, caractérisés par une grande divergence des séquences, ont été établis [135]. Le premier sous-groupe comprend les récepteurs P2Y1,2,4,6,11, et le second inclut les sous-types P2Y12,13,14 (Tableau I.3).
Les deux sous-groupes diffèrent par plusieurs autres caractéristiques. En particulier, ils possèdent des motifs d’acides aminés supposés spécifiques dans les zones transmembranaires 6 et 7. Ces résidus sont supposés être importants pour la liaison des ligands [147, 148]. Tous les récepteurs P2Y humains partagent le motif typique H-X-X-R/K dans le domaine transmembranaire 6. Par contre, le motif Q/K-X-X-R (dans la zone transmembranaire 7) est particulier aux récepteurs P2Y1,2,4,6,11. Dans les sous-types P2Y12,13,14, ce motif est substitué par K-E-X-X-L. D’autre part, chez l’homme, les gènes des récepteurs P2Y12,13,14 sont regroupés dans une même région du chromosome 3 à proximité de trois autres GPCRs orphelins structurellement liés aux récepteurs P2Y [168]. Deux de ces récepteurs possèdent les motifs typiques que l’on retrouve sur les sous-types P2Y12,13,14.
Enfin, le couplage aux protéines G permet de différencier les deux sous-groupes des récepteurs P2Y. Les sous-types P2Y1,2,4,6,11 utilisent principalement le couplage Gq/G11 pour
activer la voie PLC/IP3 alors que les membres de l’autre groupe sont presque exclusivement couplés aux protéines de la famille Gi.
I.3.2.2.5 Les différents sous-types P2Y
I.3.2.2.5.1 Le récepteur P2Y1
Les récepteurs P2Y1 humain, murin, du rat, bovin, de la dinde et du xénope ont été clonés et caractérisés. Pour la plupart de ces récepteurs, l’ADP est un agoniste plus puissant que l’ATP et ses dérivés du type 2-methylthio sont encore plus actifs. L’UDP, UTP, CTP et GTP n’ont pratiquement pas d’effet sur ce récepteur [155]. L’agoniste le plus efficace est un analogue du 2-methylthioADP, le MRS2365 (avec une EC50 de 0.4 nM) [169]. Les antagonistes les plus sélectifs sont le MRS2179, le MRS2279 et le MRS2500.
Le transcrit du récepteur P2Y1 est exprimé dans un grand nombre de tissus : le placenta, la prostate, le cerveau, les intestins, les muscles du squelette, le cœur, le pancréas [170, 171]. Il est également détecté dans les cellules épithéliales et endothéliales, les plaquettes, les cellules immunes et les ostéoclastes [172].
Le rôle biologique du récepteur P2Y1 dans l’agrégation plaquettaire a été largement étudié (voir paragraphe I.4.1). La génération des souris P2Y1-/-
a permis de confirmer son rôle dans l’agrégation plaquettaire [13, 173]. De plus, des souris transgéniques qui surexpriment le récepteur P2Y1 spécifiquement dans les plaquettes ont été produites [174]. Leurs plaquettes présentent une hyper réactivité in vitro.
I.3.2.2.5.2 Le récepteur P2Y2
Le récepteur P2Y2 a été cloné et caractérisé à partir de cellules ou tissus humains, murins, de rats, de chiens et de porcs [175]. Il est activé par des concentrations équivalentes d’ATP et d’UTP alors que l’ADP et l’UDP sont des agonistes nettement moins efficaces. Par ailleurs, des agonistes stables (résistant à l’hydrolyse) du récepteur P2Y2 ont été synthétisés : l’UTPγS et l’INS 37217 (Up4dC). L’AR-C126313 et son dérivé l’AR-C118925 ont été décrits comme des antagonistes efficaces [176]
L’ARNm du récepteur P2Y2 est exprimé dans un grand nombre de tissus : les poumons, les muscles squelettiques, le cœur, la rate, le cerveau, les reins, les tissus adipeux, l’estomac, les ostéoblastes, les cellules immunes, épithéliales et endothéliales [175]. Par ailleurs, son niveau d’expression peut être augmenté dans les cellules musculaires lisses par des médiateurs de l’inflammation (TNF-α, IL-1β,..) [177].
L’activation du récepteur P2Y2 augmente la sécrétion de Cl- et inhibe l’absorption de Na+ par les cellules épithéliales pulmonaires [178] ainsi que par les cellules épithéliales intestinales [179]. Cette propriété confère au récepteur P2Y2 une importance toute particulière. En effet, l’activation des canaux Cl- permet d’hydrater le mucus pulmonaire et favorise ainsi le fonctionnement de l’escalator mucociliaire qui assure l’élimination des particules et pathogènes. Un agoniste P2Y2 pourrait donc compenser la déficience du CFTR dans la mucoviscidose en activant un canal Cl- alternatif. Des agonistes du récepteur P2Y2 sont en cours d’évaluation pour déterminer leur efficacité chez des patients atteints de mucoviscidose [180] ou du syndrome de l’oeil sec [181]. La génération des souris déficientes en récepteur P2Y2 a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la stimulation des canaux Cl- dans les cellules épithéliales pulmonaires [182] et dans l’inhibition de l’absorption de sodium par les cellules épithéliales de l’intestin [183].
I.3.2.2.5.3 Le récepteur P2Y4
Les récepteurs P2Y4 humain, du rat et de la souris ont été clonés et caractérisés. L’UTP est l’agoniste le puissant du récepteur humain [184]. Les orthologues murin et du rat, par contre, sont activés de manière équipotente par l’ATP et l’UTP [185, 186]. L’ATP, en revanche, est un antagoniste du récepteur humain [187].
Chez l’homme, comme chez la souris, le transcrit du récepteur P2Y4 est particulièrement abondant dans les intestins mais est également détecté dans d’autres tissus : le cerveau, le tissus adipeux, le foie et l’estomac [171, 186, 188].
Les souris invalidées pour le récepteur P2Y4 n’ont pas de phénotype évident, mais la sécrétion de chlore induite par l’ATP et l’UTP dans le jéjunum et le colon des souris sauvages est abolie dans celui des souris P2Y4-/- [14, 179].
I.3.2.2.5.4 Le récepteur P2Y6
Les récepteurs P2Y6 humain, du rat et de la souris sont essentiellement activés par l’UDP [189, 190]. L’UDPβS, l’Up3U et l’INS48823 sont des agonistes stables du récepteur P2Y6
[191]. Le MRS2578 et le MRS2567 sont des antagonistes sélectifs du récepteur P2Y6 [192].
L’une des caractéristiques pharmacologiques unique du récepteur P2Y6 est sa lente désensibilisation [193].
L’expression tissulaire du récepteur P2Y6 est assez large. Son ARN messager est principalement détecté dans la rate, le placenta et les reins [171, 190].
Le récepteur P2Y6 est impliqué dans la contraction des cellules musculaires lisses [194] et dans la production d’IL-8 par les monocytes [195]. Notre laboratoire a généré des souris P2Y6-/- conditionnelles afin d’étudier le rôle physiologique de ce récepteur.
I.3.2.2.5.5 Le récepteur P2Y11
Parmi les récepteurs P2Y, le récepteur P2Y11 humain a un profil unique. C’est le seul récepteur qui a un intron dans sa séquence génique [145]. De plus, les gènes humains SSF1 et P2Y11 subissent un épissage intergénique, un phénomène assez rare chez les mammifères [196]. Par ailleurs, le récepteur P2Y11 humain n’a pas d’orthologue connu chez la souris et le rat.
Le ligand préférentiel du récepteur P2Y11 est l’ATP. Néanmoins, il a été rapporté que l’UTP se comporte également comme un agoniste [157]. Ce récepteur est aussi activé par les dérivés de l’ATP que sont l’ATPγS et l’AR-C67085MX. Cette dernière molécule est également un antagoniste du récepteur P2Y12. Deux antagonistes du récepteur P2Y11 sont répertoriés : la suramine et le réactif Blue 2, mais ces agents ne sont pas très sélectifs [197]
Le récepteur P2Y11 est exprimé dans un grand nombre de tissus : le cerveau, la rate et les intestins. Il est impliqué dans la maturation [198] et la migration [199] des cellules dendritiques ainsi que dans la différentiation des granulocytes [200].
I.3.2.2.5.6 Le récepteur P2Y12
Les récepteurs P2Y12 humain, de la souris et du rat ont été identifiés et caractérisés [135].
Leur ligand naturel est l’ADP mais ils sont également activés par des analogues stables : l’ADPβS et le 2-méthylthioADP. Plusieurs antagonistes plus ou moins sélectifs ont été synthétisés : l’AR-C69931MX, l’AR-C67085MX et le métabolite actif du clopidogrel [201- 203].
Le récepteur P2Y12 est fortement exprimé dans la lignée cellulaire des mégacaryocytes/plaquettes ainsi que dans le cerveau, en particulier dans la microglie [134, 204].
Le récepteur P2Y12 est essentiel dans le phénomène de l’agrégation plaquettaire (voir paragraphe I.4.1) [205]. Il est également impliqué dans l’effet chimiotactique de l’ADP sur les cellules microgliales [206]. La génération de souris P2Y12-/-
a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans ces deux processus [12, 207].
I.3.2.2.5.7 Le récepteur P2Y13
Le récepteur GPR86 humain (également appelé GPR94 ou SP174) a été déorphanisé, en 2001, dans notre laboratoire [208]. Par la suite, il fut nommé P2Y13. Afin de déterminer les agonistes de ce récepteur, sa séquence codante a été transfectée dans la lignée astrocytaire humaine 1321N1. L’ADP s’est avéré être son ligand préférentiel avec une EC50 de 11,4 nM.
Des dérivés stables de l’ADP, le 2-méthylthioADP et l’ADPβS, activent le récepteur P2Y13 avec des EC50 de 14.2 et 42.5 nM, respectivement. L’Ap3A a également été décrit comme un agoniste du récepteur P2Y13 [209]. D’autre part, plusieurs antagonistes, plus au moins sélectifs, ont été identifiés : l’AR-C69931MXet le MRS2211 [209, 210].
La réponse fonctionnelle (IP3) induite par l’ADP dans les cellules 1321N1-P2Y13 co- exprimant Gα16 est fortement inhibée en présence de toxine pertussique ; ce qui indique que le récepteur P2Y13 est couplé une protéine de la famille Gi. En effet, l’ADP, à de faibles concentrations, inhibe l’accumulation d’AMPc dans les CHO-P2Y13 induite par la forskoline (terpène qui active les AC). A de plus hautes concentrations d’ADP, (>30 nM) l’effet inhibiteur s’inverse et une augmentation du taux d’AMPc est observée. En présence de toxine pertussique, seul la phase ascendante est obtenue, même à de faibles concentrations d’ADP.
L’effet biphasique de l’ADP sur l’accumulation d’AMPc suggère que le récepteur P2Y13 est
simultanément couplé aux protéines Gi et Gs ; lesquelles exercent des effets opposés sur les AC. Ce type de couplage a déjà été rapporté pour le récepteur α2-adrénergique lorsqu’il est transfecté dans des CHO [211]. Cependant, comme ce sont des systèmes similaires, il est n’est pas exclu qu’il s’agisse d’un artéfact de surexpression. Par ailleurs, il a été rapporté que le récepteur P2Y13 est également capable d’inhiber les canaux calciques de type N [212].
Les récepteurs P2Y13 de la souris et du rat ont été clonés sur base d’homologies avec la séquence humaine [213, 214]. La séquence génique murine est située sur le chromosome 3D à proximité des récepteurs P2Y12 et P2Y14. La séquence protéique du récepteur P2Y13 murin partage 75% d’identité avec son orthologue humain. Du point de vue pharmacologique, les récepteurs P2Y13 humain, murin et du rat sont très semblables. Ils sont tous les trois préférentiellement activés par l’ADP, l’ADPβS et le 2-méthylthioADP ; et sont couplés à une protéines Gi [208, 213, 214]. Aucun antagoniste pour le récepteur murin n’a été décrit à ce jour. Par contre, le récepteur P2Y13 de rat est antagonisé par l’AR-C69931MX [213].
Le récepteur P2Y13 humain est exprimé dans divers tissus. Il est surtout présent dans la rate, la moelle osseuse, les ganglions, le foie et le cerveau [208]. Son transcrit est également présent dans les monocytes, les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et de sang, les cellules de Langerhans et les lymphocytes [214, 215]. Contrairement à ce qui est généralement observé dans un grand nombre de types cellulaires, le récepteur P2Y13 semble être le seul récepteur P2Y exprimé dans les globules rouges et les réticulocytes humains [216]. La distribution tissulaire chez la souris et le rat est similaire à celle de l’homme : l’ARNm est le plus abondant dans la rate, le cerveau et le foie [213, 214]. Le transcrit murin a également été détecté dans le pancréas.
Le profil de sa distribution tissulaire (forte expression dans les organes lymphoïdes) suggère que le récepteur P2Y13 est impliqué dans la physiologie du système immunitaire. De plus, des travaux ont suggéré que ce récepteur régule le phénomène d’adaptation de l’organisme à des conditions d’hypoxie [216] et stimule l’endocytose des HDL par les hépatocytes [217].
L’adéquation entre l’apport et la demande en oxygène requiert un mécanisme qui contrôle le flux sanguin en réponse à la diminution du niveau d’oxygénation des tissus. Plusieurs études ont démontré que les globules rouges sont des senseurs de l’hypoxie, et différents mécanismes par lesquels ces cellules stimulent la vasodilatation ont été proposés [218-220]. De plus, il a
été montré, in vitro, que les globules rouges sont essentiels dans ce processus d’adaptation car les vaisseaux sanguins se dilatent, en réponse à de faibles taux d’oxygène, uniquement s’ils sont perfusés avec ces cellules [221]. Parmi les facteurs extracellulaires qui régulent ce phénomène, l’ATP est un excellent candidat puisqu’il est libéré par les globules rouges en condition d’hypoxie [222] et parce qu’il stimule la sécrétion d’agents vasodilatateurs (NO, prostaglandines, EDHF) par les cellules endothéliales [223]. Néanmoins, ce système nécessite un signal d’arrêt pour éviter une vasodilatation trop importante. Wang et al ont montré que l’ADP, issu de la dégradation de l’ATP, inhibe la libération d’ATP par les globules rouges.
L’expression de transcrits P2Y13 dans les globules rouges et le blocage de l’action de l’ADP par un antagoniste P2Y13 (AR-C69931MX) suggèrent l’implication du récepteur P2Y13
(figure I.5) [216].
L’élimination de l’excès de cholestérol par le foie est essentielle pour éviter le développement de l’athérosclérose et de maladies cardiovasculaires. Ce processus nécessite que ce lipide soit transporté des artères vers le foie puis capté par les hépatocytes pour être finalement métabolisé en acides biliaires par la 7-α-hydroxylase. Le transport du cholestérol vers le foie en vue de sa dégradation est assuré par les HDL (High Density Lipoprotein). Généralement, l’internalisation du complexe HDL-cholestérol fait intervenir des récepteurs tels que le SR-BI [224]. D’autre part, l’apoliporotéine A-I libre, qui est également un constituant des HDL, se fixe sur une molécule de surface identique à la chaîne β de l’ATP synthétase mitochondriale, et stimule l’endocytose des holo-HDL (complexe HDL-cholestérol) par les hépatocytes [225].
Ce mécanisme est strictement lié à la génération d’ADP dans le milieu extracellulaire par cette ATP synthétase. L’ADP stimule l’internalisation des holo-HDL par un récepteur inconnu de faible affinité. Le blocage de cet effet par des siRNA ciblant le récepteur P2Y13
suggère que ce dernier est impliqué dans ce processus (figure I.6) [217].
I.3.2.2.5.8 Le récepteur P2Y14
A ce jour, le récepteur P2Y14 est le dernier des P2Y identifié. Il a été cloné chez l’homme, la souris et le rat. Ses agonistes sont l’UDP-glucose, l’UDP-galactose, l’acide UDP- glucoronique et l’UDP-N-acétylglucosamine [226]. A l’heure actuelle, aucun antagoniste n’est disponible pour ce récepteur.
