FACULTE DES SCIENCES
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Directeurs de thèse: Dr. C. Maenhaut, Pr. J.E. Dumont, Dr. S. Schurmans, Dr. S. Dremier
Régulation et rôle des petites protéines G Rho dans la cellule thyroïdienne
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences
Nathalie Fortemaison Octobre 2004
Régulation et rôle des petites protéines G Rho dans la cellule thyroïdienne
Thèse privée et publique soutenues respectivement le 7 octobre et 28 octobre 2004, à Gosselies.
Composition du jury
Président du jury: Pr. J. Urbain (IBMM, ULB)
Secrétaire du jury: Pr. J. Roscam (remplacée par le Pr. E. Pays) (IBMM, ULB)
Promoteurs de thèse: Dr. C. Maenhaut, Pr. J.E. Dumont, Dr. S. Dremier (IRIBHM, ULB) Co-promoteur de thèse: Dr. S. Schurmans (IRIBHM/IBMM, ULB)
Directeur de thèse: Pr. G. Vassart (IRIBHM, ULB) Rapporteurs: Dr. V. Kruys, Dr. O. Leo (IBMM, ULB) Expert extérieur: Pr. M-F. van den Hove (UCL)
Je remercie les professeurs J.E. Dumont et G.Vassart pour m'avoir accueillie dans leur laboratoire. Monsieur Dumont, merci à vous d'avoir suivi ce travail avec tant d'intérêt et d'enthousiasme ainsi que pour vos encouragements tout au long de ces années (et surtout dans la phase finale!).
Sarah, si j'en suis arrivée là aujourd'hui, c'est surtout grâce à toi. Mille merci à toi pour m'avoir guidée, conseillée, aidée et soutenue (et le mot est faible en regard de ces derniers mois) tout au long de cette thèse. Tu as été un vrai "coach" pour les préparations au FRIA et ça m'a énormément fait progresser. J'admire ton optimisme, ta bonne humeur et ton courage qui résistent à toutes les épreuves. J'ai eu vraiment beaucoup de plaisir à travailler à tes côtés. J'espère que même si nos chemins vont se séparer, l'amitié qui s'est tissée au cours de ces années nous permettra de nous retrouver. Carine, je te remercie pour tes conseils.
Je tiens à remercier chaleureusement le Pr. K. Aktories ainsi que H. Barth et G. Schmidt pour les différentes toxines bactériennes, sans lesquelles ce travail n'aurait pu être réalisé. J'adresse aussi mes remerciements aux Dr. Collard et Bos, qui nous ont donné les constructions permettant de réaliser les GST-pull down.
Pierre, tu m'as fait découvrir le monde fascinant et complexe du cycle cellulaire. Je te remercie de tout cœur pour ton investissement énorme dans ce travail. Tes connaissances scientifiques dans le domaine sont impressionnantes et discuter avec toi permet toujours d'apprendre quelque chose de neuf.
Francoise, merci à toi de m'avoir fait partager tes connaissances en matière de NADPH oxydase.
Isa, un grand merci pour tous tes conseils et tes remarques.
Chantal, je te remercie du fond du cœur pour toute ton aide technique et plus particulièrement ces derniers mois où je t'ai fort sollicitée. Aah, si on pouvait te cloner (une Chantal pour chacun d'entre nous!), on pourrait en avoir des résultats!!
Mes remerciements vont également à Jacqueline et Claude pour toute leur aide dans les dosages d'AMPc.
Ca a été un plaisir de partager avec vous un bureau où il règne une si bonne ambiance:
Il y a eu …
Sandrine D. et Valérie S., je n'oublierai jamais le premier jour de mon arrivée au labo où j'ai fait votre connaissance et où vous m'avez accueillie comme si vous me connaissiez
depuis toujours. Par la suite, j'ai découvert deux amies toujours prêtes à aider quelqu'un. Les sorties "Quick, Cora ou Westland" resteront de chouettes souvenirs.
Hortensia, tout droit venue du Canada et déjà repartie, ton dynamisme et ton rire nous manquent.
Fred P.,on pouvait discuter des heures sur n'importe quel sujet.
Christine, merci de m'avoir initiée à Reference Manager (hélas, je n'en ai pas encore percé tous ses mystères) et de m'avoir fait découvrir quelques fonctionnalités de Word (décidément en informatique, on en apprend tous les jours). Je te souhaite de trouver un travail épanouissant.
Fafa, j'avoue que nos débats du midi sur les sujets politiques, cinématographiques ou autre (parfois très animés, vu nos divergence d'opinion!) me manquent.
Thalie, trop bref passage dans le bureau.
Mais il y a toujours…
Sandrine W., tu es un concentré de gentillesse (au fait on ne se remettrait pas au fitness?).
Laurent, c'est toujours très agréable de discuter avec toi, que ce soit de voyages, de chats, ou d'autre chose… Mais quand même, se lever aux petites heures un dimanche matin pour regarder de la F1, c'est fou!
Julie, quand tu es arrivée, tu avais l'air bien calme et sérieuse mais au fond tu aimes bien faire la "sotte" et nous faire rire pour notre plus grand plaisir, surtout ne change pas!
Sandra, je te souhaite pleins de beaux résultats pour ta thèse qui commence.
Merci pour tous ces bons moments passés avec vous.
Sans oublier tous ceux et celles qui ont fait et font toujours du labo un endroit où il est agréable de travailler (très important pour le moral surtout quand les manip ne marchent pas):
Sandrine P.,je suis contente de te savoir de retour, deux étages plus bas. Tu sais où venir manger à midi, la porte est toujours ouverte.
Isamini, je garderai un super souvenir de nos cours de hip-hop mais aussi de notre brève initiation à l'équitation.
Sheela, à quand la prochaine partie de whist (il est temps que j'apprenne!).
Daniel, qui laisse des traces partout où il passe (surtout sur Fafa, mais aussi sur les chaises de bureau, enfin… on se comprend), merci pour les fous rires qu'on a eus grâce à toi.
Alex, merci de m'avoir fait découvrir la Trouspinette, pour ta bonne humeur et ton réconfort le jour où j'ai été aussi décomposée que mon gel d'ARN éclaté sur le sol.
Wilma, beloofd, ik herbegin zo vlug mogelijk met het Nederlands (euh, j'avoue, Sandrine m'a un peu aidé).
Xavier P., non vraiment… les chaussettes avec les sandales… je ne changerai pas d'avis!
Katia, notre collaboration "PI3K" n'a malheureusement pas mené à des résultats, mais ça m'a au moins permis de faire plus ample connaissance avec toi et de découvrir entre autre un goût commun pour les voyages exotiques.
Sabine, merci pour ton aide et tes conseils pour les tests Rb kinase.
Xavier D., Dantong, Milutin, un grand merci pour votre aide dans les dosages d'H2O2. Mais aussi Tanja, Séverine, Jingwei, Val D., Nath P., Jing, Romana, Katrien, Colette, Nath S., Vanessa V., Maria, Song, Laurence, Alex V.,… Vous êtes trop nombreux pour vous citer tous, alors je voudrais dire merci à tous ceux et celles qui par une idée, un conseil ou un coup de main ont rendu possible la réalisation de cette thèse.
J'associe à ces remerciements toute l'équipe partie à Gosselies: Fred C. (futur surfeur sous le soleil de Californie, merci pour toutes les réponses à mes questions
"existentielles" de ces dernières semaines, j'espère que les Américaines aiment l'humour belge), Sophie, Pouic-Pouic, Christiane, Daniel, Stéphane, Bernard,…
J'ai une pensée aussi pour Joseph (merci pour les thyroïdes), Yves (merci pour les lignées), Christian (qui répare tout), Johan, Diana, Cathy, Joëlle, Danielle, pour tous les services que vous rendez au labo.
Sonia, Val C., Gaëlle, Florence, Yves, merci pour votre amitié.
Je remercie mes parents grâce à qui j'ai pu réaliser ces études. Maman, tu as le cœur sur la main, tu ferais n'importe quoi pour rendre service, merci pour tout ce que tu as fait et pour ce que tu es.
Benoît, tu as toujours les mots qu'il faut pour me faire retrouver le sourire dans les moments difficiles. Je ne sais pas ce que j'aurais fait sans ton aide informatique (c'est fou ce qu'un PC ça peut rendre dingue!). Tu m'as énormément aidé pour l'impression de cette thèse malgré des journées de travail bien chargées. Merci pour tout ça et pour tout le bonheur que tu m'apportes. Je voudrais aussi remercier tes parents ainsi que tes frères et sœurs pour leur soutien et leurs encouragements qui m'ont fait chaud au cœur.
Ce travail a été réalisé grâce aux soutiens financiers du Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (FRIA), de la Fondation David et Alice Van Buuren ainsi que de la Fondation Rose et Jean Hoguet.
Ré R és su um mé é
Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique,… Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP.
Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.
Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).
Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.
Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.
Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2.
En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.
AMPc adénosine 3’,5’-monophosphate cyclique pb paire de bases
AP-1 "activating protein-1" PBS "phosphate buffer saline"
ATF "activating transcription factor" PCNA "proliferating cell nuclear antigen"
BrdU bromodéoxyuridine PDE phosphodiestérase
BSA "bovin serum albumin" PDGF "platelet-derived growth factor"
CAK "CDK activating protein" PDK "phosphoinositide-dependent kinase"
Cdc "cell division cycle" PF2K phosphofructo-2-kinase
CDK "cyclin dependent kinase" PH "pleckstrin homology domain"
CKI "CDK inhibitor" phox phagocyte oxydase
CNF1 "cytotoxic necrotizing factor 1" PI3-kinase phosphatidylinositol 3-kinase
CRE "cAMP response element" PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
CREB "CRE binding protein" PKA protéine kinase dépendante de l'AMPc CREM "cAMP response element modulator" PKB protéine kinase B
DAG 1,2-diacylglycérol PKC protéine kinase C
DCB dihydrocytochalasine B PKI "PKA inhibitor"
EDTA acide éthylène-diamine-tétra-acétique PKN protéine kinase N
EGF "epidermal growth factor" PLC phospholipase C
ERK "extracellular-signal regulated kinase" PTEN "phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten"
FCS "fetal calf serum" Rac "Ras-related C3-botulinum toxin substrate"
FdC fluorodeoxycitidine Ras "rat sarcoma virus"
FGF "fibroblast growth factor" Rho "Ras homologous member A"
FITC fluorescéine d'isothiocyanate rpm rotation par minute Fra-1 "fos related antigen-1" RSK "ribosomal S6 kinase"
GAP "GTPase activating protein" rT3 "reverse triiodothyronine"
GDI "guanine nucleotide dissociation inhibitor" rTSH récepteur de la TSH
GDP guanosine 5' diphosphate SDS sodium dodécyl sulfate
GEF "guanine nucleotide exchange factor" SH2 "Src homology 2 domain"
GMPc guanosine monophosphate cyclique SH3 "Src homology 3 domain"
Grb2 "growth factor receptor-bound protein 2" Shc "SH2 domain and collagen-like"
GSK-3 glycogène synthase kinase 3 SHIP "SH2-domain containing inositol 5- phosphatase"
GTP guanosine 5' triphosphate Sos "son of sevenless"
HGF "hepatocyte growth factor" SRE "serum responsive element"
p38/HOG-1 "high osmolarity glycerol" T3 triiodothyronine ICER "inducible cAMP early repressor" T4 tétraiodothyronine IGF-1 "insuline-like growth factor 1" TB toxine B
IκB "inhibitor of NF-κB" TCF "ternary complex factor"
IKK IκB kinase Tg thyroglobuline
IP3 inositol 1,4,5 trisphosphate TGFβ "transforming growth factor β"
JNK/SAPK "c-jun terminal kinase/stress activated protein
kinase" ThOX "thyroid oxidase"
kb kilobase TNF "tumor necrosis factor"
KDa kilodalton TPA 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate MAPK "mitogen activated protein kinase" TPO thyroperoxydase
MEK MAPK kinase TRH "thyrotropin releasing hormone"
MRCK "myotonic dystrophy kinase-related Cdc42
binding kinase" Tris tris(hydroxyméthyl)aminométhane
NADPH nicotinamide adénine dinucléotide phosphate TSH "thyroid stimulating hormone"
NF-κB "nuclear factor-kappa B" TTF-1 "thyroid transcription factor-1"
NIS symporteur Na+/I- TTF-2 "thyroid transcription factor-2"
NOX NADPH oxydase WASP "Wiskott-Aldrich syndrome protein"
PAK "p21-activated kinase" WAVE/
Scar "WASP-like verprolin homologuous protein"
Ta T ab bl le e d de es s m ma at ti iè èr re es s
AVANT-PROPOS 1
CHAPITRE I. INTRODUCTION 2
I.1. Les cascades de transduction de signaux : du signal extracellulaire au noyau 2
I.1.1. Les récepteurs 2
a) Les récepteurs à activité enzymatique: exemple des récepteurs à activité tyrosine
kinase 3
b) Les récepteurs couplés aux protéines G 3
I.1.2. Les seconds messagers 4
a) Diacylglycérol, IP3 et calcium 4
b) L’AMP cyclique 4
I.1.3. Activation de cascades intracellulaires et transduction du signal vers le noyau 5 a) Transmission du signal induit par les phospholipides: les phosphatidylinositol 3-
kinases 5
b) Voie Ras-MAPKs 6
c) Transmission du signal induit par l’AMP cyclique 7 I.1.4. Réponses nucléaires: les facteurs de transcription AP-1 9
a) Le proto-oncogène FosB 10
I.2. Le cycle cellulaire 11
I.2.1. Les complexes cycline-CDK 11
I.2.2. Régulation du cycle cellulaire par les CKI 12
I.2.3. Phosphorylation de pRb 13
I.3. Les protéines Rho et le cytosquelette 15 I.3.1. La transduction des signaux et le cytosquelette 15
I.3.2. Les petites protéines G de la famille Rho 15
I.3.3. Activation des petites protéines G 16
I.3.4. Etude des protéines Rho: les toxines bactériennes 16
a) Les "C3-like" ADP-ribosyltransférases 17
b) Les grandes toxines clostridiales 17
c) CNF (cytotoxic necrotizing factor) 18
d) Autres toxines 18
I.3.5. Fonctions des protéines Rho 19
a) Régulation de l'organisation du cytosquelette d'actine 19
b) Régulation de l'expression de gènes 21
c) Régulation de la prolifération 22
d) Rôle des protéines Rho dans la transformation et le cancer 23
e) Autres fonctions 24
I.4. Le modèle thyroïdien 25
I.4.1. Physiologie de la cellule folliculaire thyroïdienne 25
I.4.2. Régulation de la cellule thyroïdienne 26
I.4.3. Les différents modèles expérimentaux de cellules thyroïdiennes 27 a) Modèle in vitro de culture primaire de cellules thyroïdiennes de chien 27 I.4.4. La cascade de l’AMPc dans la cellule thyroïdienne de chien en culture primaire 28 I.4.5. Comparaison de la cascade dépendante de l’AMPc et des voies indépendantes de
l’AMPc dans les thyrocytes de chien en culture primaire 29
CHAPITRE III. RESULTATS 35
I.1. Les petites protéines G de la famille Rho 35 I.1.1. La TSH, l'AMPc et le TPA induisent une désorganisation du cytosquelette d'actine
dans les thyrocytes de chien 35
I.1.2. La cascade dépendante de l'AMPc induit l'inactivation de Rac1, Cdc42 et RhoA
dans les cellules thyroïdiennes 35
I.1.3. Inhibition et activation des protéines Rho par les toxines B, C3 et CNF1: effets sur
le cytosquelette des thyrocytes 36
a) La toxine B 36
b) La toxine C3 37
c) La toxine CNF1 37
d) La dihydrocytochalasine B 38
I.1.4. Rôle des petites protéines G Rho et du cytosquelette d'actine dans l'expression des caractéristiques de différenciation des thyrocytes de chien 38
a) Régulation des protéines Tg et ThOXs 38
b) Régulation des ARNm de Tg, ThOXs, NIS et TPO 39
I.1.5. La toxine B, mais pas la dihydrocytochalasine B, inhibe l'entrée des thyrocytes de
chien en phase S 40
a) Phosphorylation de pRb 41
I.1.6. Rôle des petites protéines G Rho dans la régulation des protéines de la phase G1
du cycle cellulaire 42
a) p27kip1 42
b) Cycline D3 42
c) Cycline D1 42
d) CDK2 43
I.1.7. L'activité des protéines Rho est nécessaire pour l'activation des complexes cycline
D-CDK4 mais pas pour leur formation 43
I.1.8. Rôle des petites protéines G Rho dans l'activation des MAPKs 44
I.1.9. Rôle de Rac1 dans la production d'H2O2 45
a) Inactivation de Rac et génération d'H2O2 46
b) Activité de Rac1 en réponse aux agents stimulant la production d'H2O2 46 I.2. Les petites protéines G de la famille Ras: comparaison de l'activité de Ras et
Rap1 entre les thyrocytes de chien en culture primaire et les lignées thyroïdiennes
de rat 47
I.2.1. Mesure de l’activation de Ras 47
I.2.2. Mesure de l'activation de Rap1 47
CHAPITRE IV. DISCUSSION 49
I.1. Inactivation des Rhos et désorganisation du cytosquelette d’actine 49 I.2. Rôle de la voie Rho-actine dans l'expression des gènes de différenciation 51 I.3. Rôle des protéines Rho dans l'entrée des thyrocytes en phase S: mise en évidence
d'un nouveau mécanisme d'activation des complexes cycline D3-CDK4 par les
protéines Rho 53
I.4. Les protéines Rho et les voies MAPK 56 I.5. Rac et le système générateur d’H2O2 57
I.6. Activation de Ras et Rap1 dans les lignées thyroïdiennes de rat 58
CHAPITRE V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 59
ANNEXE I: ROLE DE FOSB DANS LA CASCADE MITOGENIQUE DE L’AMPc 61 I.1.1. Clonage de l’ADN complémentaire de fosB canin 61
I.1.2. Etude de la régulation de l’ARN messager 62
I.1.3. Etude de la régulation de la protéine 62
I.1.4. Discussion et conclusion 63
ANNEXE II: ROLE DE LA PHOSPHATIDYLINOSITOL-3 KINASE DANS
L’ACTION PERMISSIVE DE L’INSULINE 66
I.1.1. Expression d’une PI3-kinase constitutivement active 66
I.1.2. Dosage de l’activité PKB 67
I.1.3. Discussion 68
METHODES EXPERIMENTALES 70
I.1. Cultures cellulaires 70
I.1.1. Mise en culture primaire des cellules thyroïdiennes de chien 70
I.1.2. Lignées thyroïdiennes de rat 70
I.1.3. Lignée leucocytaire PLB-985 70
I.1.4. Cellules Cos-7 70
I.2. Mesure de la prolifération cellulaire 71
I.3. Immunofluorescence indirecte 71
I.4. Criblage de banques d'ADNc 71
I.5. Extraction des ARN totaux, Northern blotting et hybridation 72 I.6. Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS 72 I.7. Western blotting et immunodétection par ECL (Enhanced Chemiluminescence) 73 I.8. Marquage des thyrocytes au 35S et immunoprécipitation 73
I.9. Extraits nucléaires 73
I.10. Dosage de l'activité PKB 74
I.11. Test Rb kinase 74
I.12. Expression des protéines recombinantes 75 I.13. Mesure d’activation des petites protéines G 75
I.14. Mesure de la production d’H2O2 76
I.15. Dosage de l'AMPc par RIA (Radio Immuno Assay) 76
I.16. Matériel 77
BIBLIOGRAPHIE 78 ARTICLES 106
Notre travail de doctorat avait au départ pour but de contribuer à la caractérisation des cascades biochimiques régulant la prolifération et la différenciation de la cellule folliculaire thyroïdienne.
Au cours de notre thèse de doctorat, trois sujets ont été abordés. Dans un premier temps, nous avons voulu étudier le rôle du proto-oncogène FosB dans la cascade de l'AMPc par la technique de microinjection d'oligonucléotides antisens (à cette époque la technique des siRNA n'avait pas encore été découverte). En effet, il avait été montré dans le laboratoire que l'ARNm de ce proto-oncogène est particulièrement stimulé en réponse à la voie de l'AMPc et il semblait donc être un bon candidat de gène spécifiquement impliqué dans cette voie. Avant d'entamer l'étude proprement dite, nous devions vérifier que la protéine était régulée comme l'ARNm et que les antisens diminuaient bien l'expression de la protéine. Nous avions donc besoin d'un bon anticorps fonctionnant surtout en immunofluorescence. Nous avons dès lors testé plusieurs anticorps commerciaux et bien que ceux-ci reconnaissent la protéine de chien dans un système de surexpression, ils détectent au niveau endogène une protéine dont l'expression n'est pas régulée. Par conséquent, soit la protéine n'est pas régulée, soit les anticorps reconnaissent quelque chose d'autre et ne nous permettent pas de détecter la protéine endogène. Ce travail soit perdait une partie de son intérêt, soit se révélait impossible à réaliser avec les outils existants. Nous n'avons donc pas poursuivi ce projet.
Nous avions en parallèle entamé un second sujet qui avait pour but de vérifier l'hypothèse très intéressante selon laquelle la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) jouerait un rôle dans l'effet permissif de l'insuline dans la cascade mitogénique de la TSH. La stratégie consistait à surexprimer une forme constitutivement active de l'enzyme et à déterminer si celle-ci pouvait remplacer l'effet de l'insuline. Des problèmes de toxicité lié à la surexpression de cette enzyme ne nous ont pas permis de tirer des conclusions. Comme ce travail nécessitait dès lors la mise au point d'une autre technique et donc davantage de temps que prévu initialement sans
"résultats certains", nous avons préféré, à ce stade de notre doctorat, laisser ce sujet en suspens.
Après deux ans d'efforts infructueux, nous avons alors réorienté notre thèse vers un nouveau et vaste sujet, particulièrement d'actualité et encore peu exploré dans la thyroïde: les petites protéines G de la famille Rho. Nous avons investigué leur rôle potentiel dans divers aspects de la régulation de la cellule thyroïdienne. Ce sujet ayant donné des résultats intéressants, pour une question de place, nous avons choisi de le traiter en sujet principal et de présenter les sujets "FosB" et "PI3-kinase" en annexes. Cependant, par souci de clarté, nous avons introduit brièvement ces deux protéines dans les pages qui suivent et les techniques utilisées sont détaillées dans la partie traitant des méthodes expérimentales.
C C ha h ap pi it tr re e I I . . In I nt tr ro o du d uc ct ti io on n
La survie d'un organisme multicellulaire dépend d’un réseau de communications intercellulaires qui coordonne la croissance, la différenciation et le métabolisme de la multitude de cellules qui constituent les divers tissus et organes. Les cellules cancéreuses contiennent généralement l’ensemble des molécules biologiques nécessaires pour la survie, la prolifération, la différenciation, la mort cellulaire et l’expression des fonctions spécifiques du type cellulaire. L’incapacité à réguler ces fonctions peut conduire à un phénotype altéré, à la maladie et/ou au cancer. Une façon de comprendre la biologie du cancer est d’étudier comment ces fonctions sont contrôlées dans les cellules normales et la manière dont elles deviennent incontrôlées dans les cellules cancéreuses.
I.1. Les cascades de transduction de signaux : du signal extracellulaire au noyau
La communication cellulaire peut être très schématiquement représentée par deux étapes.
Tout d’abord, un signal extracellulaire se fixe sur et active un récepteur transmembranaire.
Ensuite, ce dernier stimule une série de signaux intracellulaires en cascades, qui atteignent finalement le noyau et conduisent à des changements programmés au niveau de l'expression des gènes permettant ainsi la réponse cellulaire (ex: prolifération ou différenciation). On distingue différentes classes de protéines parmi les acteurs de la transduction du signal: les récepteurs qui reçoivent le signal, les seconds messagers (ex: AMPc, GMPc, DAG, IP3, Ca2+) qui l'amplifient, les adaptateurs qui le distribuent, et les effecteurs qui induisent la réponse cellulaire. Le dispositif peut être simplifié quand le signal externe active directement un facteur de transcription (récepteurs nucléaires) ou quand le récepteur active directement des protéines effectrices (par exemple par phosphorylation).
Il existe un certain nombre de cascades de signalisation et leur utilisation varie en fonction du type cellulaire. Nous n'entrerons donc dans les détails que pour les trois principales cascades étudiées dans notre modèle expérimental, la cellule thyroïdienne, et qui sont la voie des facteurs de croissance/récepteurs à activité tyrosine kinase, la cascade du phosphatidylinositol et la voie dépendante de l'AMPc.
I.1.1. Les récepteurs
Les signaux extracellulaires (facteurs de croissance, cytokines, hormones, ...) sont pour la plupart perçus par les cellules au moyen de récepteurs transmembranaires. Ces protéines exposent vers l’extérieur le site de liaison de l’hormone ou du facteur de croissance, et vers le cytoplasme, les domaines responsables de la transduction du signal. Il existe également d’autres types de récepteurs à la surface des cellules qui sont les canaux ioniques (ex:
récepteur nicotinique à l’acétylcholine) et dont l'ouverture suite à la liaison du ligand induit un changement dans le flux d’ions dans la cellule (Dajas-Bailador et Wonnacott, 2004).
Cependant, certains ligands sont des petites molécules hydrophobes capables de diffuser à travers la membrane plasmique des cellules. Les hormones stéroïdes sont l’exemple classique de ce groupe de molécules incluant également les hormones thyroïdiennes, la vitamine D3 et l’acide rétinoïque. Une fois dans la cellule, ces molécules se lient à des récepteurs intracellulaires membres de la superfamille des récepteurs aux stéroïdes. Ces derniers sont des facteurs de transcription qui interagissent directement avec l’ADN et modulent la transcription des gènes (Edwards, 2000;Escriva et al., 2004).
domaine tyrosine kinase
domaine « immunoglobulin-like » S-SS-S
S-S
cytosol membrane
Réc. EGF Réc. insuline
IGF-1 Réc. PDGF
domaine riche en cystéines
S-S
Réc. HGF
Figure 1: Représentation schématique de quatre sous-familles distinctes de récepteurs à activité tyrosine kinase (adapté de « Oncogenes and Tumour Suppressors » de Peters &
Vousden, 1997).
a) Les récepteurs à activité enzymatique: exemple des récepteurs à activité tyrosine kinase Les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque sont dotés d’une activité catalytique dans leur partie intracellulaire et opèrent directement en tant qu’enzymes, une fois activés par leur ligand. La plupart de ces récepteurs sont des protéines possédant une activité tyrosine kinase.
Cependant, il existe des récepteurs liés à d'autres activités enzymatiques: guanylate cyclase qui catalyse la formation de GMPc (ex: récepteur de "l'atrial natriuretic peptide") (Kuhn, 2003), sérine/thréonine kinase (ex: récepteur du TGFβ ou transforming growth factor β) (de Caestecker, 2004), ou tyrosine phosphatase qui enlève le groupement phosphate des résidus tyrosine phosphorylés de leurs substrats protéiques (ex: CD45) (Huntington et Tarlinton, 2004). D’autres récepteurs n’ont, quant à eux, pas d’activité enzymatique intrinsèque et interagissent avec des kinases qui ne sont pas des récepteurs. C'est le cas de la superfamille des récepteurs aux cytokines (Ishihara et Hirano, 2002) et des récepteurs immunitaires (ex: "T cell receptor").
Le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance fibroblastique (FGF), le fateur de croissance des hépatocytes (HGF), l'IGF-1 (Insuline-like Growth Factor) et l'insuline appartiennent à la famille des facteurs de croissance qui lient un récepteur possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque (Heldin, 1995). Tous ces récepteurs partagent une structure commune: un domaine N-terminal extracellulaire de liaison au ligand, une hélice α transmembranaire et un domaine C-terminal cytosolique qui possède l’activité tyrosine kinase (Ullrich et Schlessinger, 1990). Cependant le récepteur à l’insuline et d’autres récepteurs apparentés (ex : récepteur IGF-1) sont des dimères constitués de 2 chaînes α extracellulaires, liées chacune par un lien disulfure à une chaîne β qui traverse la membrane et porte l’activité tyrosine kinase (Kasuga et al., 1982) (figure 1).
La première étape de la signalisation à partir de la plupart de ces récepteurs est la dimérisation du récepteur induite par le ligand (Heldin et Ostman, 1996). Dans le cas de la famille du récepteur à l’insuline, la liaison du ligand n’induit pas la dimérisation mais plutôt une interaction entre les deux régions cytoplasmiques des chaînes β. La dimérisation induite par le ligand mène à l’autophosphorylation du récepteur sur un ou plusieurs résidus tyrosine du domaine intracellulaire, les chaînes polypeptidiques dimérisées se phosphorylant l’une l’autre (Pusztai et al., 1993). Cette phosphorylation des résidus tyrosine augmente l’activité du récepteur et crée des sites de liaison spécifiques pour d’autres protéines telles que la phospholipase Cγ ( PLCγ), les phosphatidylinositol 3-kinases et des protéines adaptatrices (Grb2, Nck, Shc, IRS,...) (Cohen et al., 1995), qui transmettent les signaux intracellulaires en aval des récepteurs activés. L’association de ces molécules avec les récepteurs est régulée par des domaines protéiques qui lient spécifiquement des peptides contenant des phosphotyrosines. Le mieux caractérisé de ces domaines est le domaine SH2 (Src Homology 2 domain), constitué d’environ 100 acides aminés. La liaison des protéines à domaine SH2 aux phosphotyrosines du récepteur conduit à leur localisation au niveau de la membrane plasmique, à leur association avec d’autres protéines, à leur phosphorylation et stimule leur activité enzymatique.
b) Les récepteurs couplés aux protéines G
Ces récepteurs sont caractérisés par 7 hélices α qui traversent la membrane plasmique avec un segment N-terminal extracellulaire et C-terminal cytosolique. La liaison du ligand au niveau du domaine extracellulaire induit un changement de conformation qui permet au domaine
Gq PLCβ PLCγ
GTP
PIP2
+ +
ligand
RCPG
+ ligand
RTK
PIP2
DAG
IP3
PKC
phosphorylation de protéines
libération de Ca2+
à partir du RE +
Figure 2: La cascade du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (adapté de «Molecular Biology of the Cell » de Alberts et coll., 1994).
RCPG: récepteur couplé aux protéines G, RTK: récepteur à activité tyrosine kinase, PLCβ:
phospholipase Cβ, PLCγ: phospholipase Cγ, PIP2: phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, IP3: inositol 1,4,5-trisphosphate, DAG: diacylglycérol, PKC: protéine kinase C, RE: réticulum endoplasmique.
cytosolique du récepteur de lier une protéine G associée à la face interne de la membrane plasmique. Ces protéines G sont constituées de trois sous-unités : α, β et γ. La sous-unité α lie les nucléotides guanyliques qui régulent l’activité de la protéine G. A l’état basal, α est liée au GDP et forme un complexe avec β et γ. La liaison de l’hormone induit un changement de conformation du récepteur conduisant à une interaction entre le domaine cytosolique de celui- ci et la protéine G. Cette interaction stimule la libération du GDP, qui est échangé par du GTP, et la dissociation de la sous-unité α liée au GTP de β/γ. Les sous-unités α et β/γ peuvent alors interagir avec leurs cibles. L’activité de α est terminée par hydrolyse du GTP et α-GDP se ré-associe à β/γ (Bouvier et al., 2000).
I.1.2. Les seconds messagers a) Diacylglycérol, IP3 et calcium
Une des voies les plus répandues de la signalisation intracellulaire est basée sur l’utilisation de seconds messagers dérivés du phospholipide membranaire qu’est le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Le PIP2 est un composant mineur de la membrane plasmique, localisé dans le feuillet interne de la bicouche lipidique. Une variété d’hormones et de facteurs de croissance stimule l’hydrolyse du PIP2 par la phospholipase C (PLC) (Singer et al., 1997).
Cette réaction produit deux messagers secondaires, le diacylgycérol (DAG) et l’inositol 1,4,5- trisphosphate (IP3). Le DAG et l’IP3 stimulent des voies de signalisation en aval distinctes: la voie de la protéine kinase C (PKC) et la mobilisation de Ca2+ respectivement (Berridge et Irvine, 1989).
L’hydrolyse du PIP2 peut être activée par des récepteurs couplés aux protéines G et par des récepteurs à activité tyrosine kinase (figure 2). En effet, une forme de la PLC (PLCβ) (Exton, 1997) est stimulée par les protéines G, tandis qu’une seconde (PLCγ) (Carpenter et Ji, 1999) contient des domaines SH2 qui permettent son association avec les récepteurs à activité tyrosine kinase, une fois ceux-ci activés. Cette interaction amène la PLCγ au niveau de la membrane plasmique et conduit à sa phosphorylation sur résidus tyrosine, ce qui augmente son activité catalytique.
Le DAG produit par l’hydrolyse de PIP2 active des protéines sérine/thréonine kinases appartenant à la famille des PKC, qui jouent un rôle important dans le contrôle de la croissance cellulaire et la différenciation. L’activation des PKC peut également être induite par les esters de phorbol (ex : TPA, 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate), des promoteurs de tumeurs qui agissent comme des analogues du DAG. La PKC active ensuite d’autres cibles intracellulaires, telles que la cascade des MAPKs, menant à la phosphorylation de facteurs de transcription, des changements d’expression génique et la stimulation de la prolifération.
Alors que le DAG reste associé à la membrane plasmique, l’autre second messager produit par clivage du PIP2, l’IP3, est libéré dans le cytosol où il induit la libération de Ca 2+ à partir des réserves intracellulaires. Cela conduit à une élévation des taux de Ca 2+ et affecte ainsi l’activité d’une variété de protéines cibles telles que des kinases et des phosphatases, souvent par l'intermédiaire d'une autre protéine, la calmoduline.
b) L’AMP cyclique
En fonction du type cellulaire, l'AMP cyclique (AMPc) peut contrôler la prolifération, la différenciation, la fonction, la sécrétion ou encore l'adhésion cellulaire (Tasken et Aandahl,
Introduction
2004). Bien que considéré dans les années 1970 comme un régulateur négatif de la prolifération, l’AMPc transmet l’effet mitogène d’hormones et de neurotransmetteurs dans un certain nombre de cellules épithéliales (Roger et al., 1995). Par exemple, l’AMPc stimule la prolifération des thyrocytes de chien et humains (Dumont et al., 1989;Dremier et al., 2002), des cellules somatotropes hypophysaires, des cellules épithéliales mammaires, des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Schwann et de la lignée de fibroblastes de souris Swiss3T3 (Roger et al., 1995). Par contre, l’AMPc inhibe la prolifération des fibroblastes, des lymphocytes, des macrophages (Vairo et al., 1990) et des astrocytes (Roger et al., 1995;Richards, 2001).
L’AMPc est formé à partir d’ATP sous l’action de l’adénylate cyclase et dégradé en 5’AMP par des AMPc phosphodiestérases (Conti, 2000). Dix types d’adénylate cyclase ont été identifiés (Sunahara et al., 1996). Toutes (sauf la n°10) présentent une structure similaire:
deux domaines hydrophobes comprenant chacun six segments transmembranaires et deux boucles intracellulaires responsables de l’activité cyclase de l’enzyme. Toutes sont activées par la sous-unité αs de la protéine Gs et la plupart sont inhibées par la sous-unité αi de la protéine Gi. Certaines sont activées, d’autres inhibées par les complexes βγ de Gs ou de Gi.
Leur activité peut également être modulée par le calcium et par phosphorylation par les PKC ou les PKA (Sunahara et al., 1996). L'adénylate cyclase 10, présente dans le testicule, est quant à elle cytosolique et n'est pas activée par les protéines G.
I.1.3. Activation de cascades intracellulaires et transduction du signal vers le noyau a) Transmission du signal induit par les phospholipides: les phosphatidylinositol 3-kinases Le PIP2 est aussi le point de départ d’une autre voie de signalisation qui joue un rôle clé dans la survie des cellules. Dans cette voie, le PIP2 est phosphorylé en position 3 de l’inositol par une enzyme, la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) (Wymann et Pirola, 1998). La phosphorylation du PIP2 conduit à la formation de phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PI(3,4,5)P3] qui fonctionne comme un messager secondaire (Rameh et Cantley, 1999).
Les produits lipidiques des PI3-kinases sont catabolisés par des phosphatases qui enlèvent le groupement phosphate en position 3 ou 5 de l’inositol. Ainsi PTEN hydrolyse le PtdIns(3,4,5)P3 en PtdIns(4,5)P2 (Maehama et Dixon, 1998), tandis que les protéines SHIP ont une activité 5’-phosphatase et produisent du PtdIns(3,4)P2 qui peut activer la signalisation en aval des PI3-kinases (Erneux et al., 1998;Rohrschneider et al., 2000).
Trois classes de PI3-kinases ont été définies sur base de leur homologie de séquence, leur préférence de substrat et leur régulation (Wymann et al., 2003). La classe I, qui est la plus étudiée et la mieux caractérisée, comprend les enzymes phosphorylant le PtdIns(4,5)P2, le PtdIns(4)P et le PtdIns in vitro mais dont leur substrat préférentiel in vivo est le PtdIns(4,5)P2. Ce sont des hétérodimères constitués d’une sous-unité catalytique de 110 kDa (p110) et d’une sous-unité régulatrice de 85 kDa (p85) (Anderson et Jackson, 2003).
La sous-unité p85 comprend deux domaines SH2 qui interagissent avec des résidus tyrosine phosphorylés, séparés par un domaine inter-SH2 (iSH2) d’environ 200 acides aminés qui intervient dans l’association étroite entre p85 et p110. L’interaction des domaines SH2 avec les tyrosines phosphorylées augmente l’activité kinase de p110 (en induisant un changement conformationnel de p85 qui serait transmis à p110 via le domaine iSH2 (Holt et al., 1994)) et permet de concentrer l’enzyme près de la membrane à proximité de ses substrats (Klippel et
5
SH3 BH P SH2 SH2
iSH2 p85α
P
Figure 3: Structure des sous-unités p85 et p110 des phosphatidylinositol-3 kinases de la classe IA.
p85BD: domaine de liaison à p85, RBD (Ras Binding Domain): domaine de liaison à Ras, C2:
protein kinase C homology domain 2, PIK: domaine PI kinase, kinase: domaine catalytique, P:
domaine riche en prolines, BH: Bcr homology domain, SH3: Src homology 3 domain, SH2: Src homology 2 domain, iSH2: domaine inter-SH2.
Introduction
al., 1994). En plus des domaines SH2, p85 contient deux régions riches en prolines entourant un "BCR (breakpoint cluster region) homology domain" (appelé aussi "Rho-GAP homology domain") qui lie les GTPases de la famille Rho (Zheng et al., 1994) et un domaine SH3 amino-terminal (environ 50 acides aminés) qui permet la liaison à des séquences riches en prolines (Funaki et al., 2000) (figure 3).
La sous-unité p110 contient plusieurs régions conservées parmi la plupart des membres de la famille des PI3-kinases : un domaine catalytique C-terminal, un domaine PI-kinase (PIK) de fonction inconnue, un domaine C2 de liaison aux phospholipides, un domaine de liaison à Ras ainsi qu’un domaine N-terminal qui interagit avec la sous-unité p85 (figure 3).
Les PI3-kinases peuvent être activées par liaison des domaines SH2 de p85 aux tyrosines phosphorylées de récepteurs à activité tyrosine kinase (récepteurs EGF, PDGF,…) (Carpenter et al., 1993), par liaison de protéines contenant des domaines SH3 (ex: tyrosine kinases de la famille Src) aux séquences riches en proline de p85 (Pleiman et al., 1994) par liaison de protéines Rho au "BCR homology domain" (Tolias et al., 1995), par liaison de p110 à Ras- GTP ou encore par liaison du domaine SH3 de p85 aux domaines riches en prolines de protéines adaptatrices telles que Shc, Cbl,…(Harrison-Findik et al., 1995;Soltoff et Cantley, 1996).
Les PI3-kinases sont impliquées dans les voies de signalisation régulant la prolifération, la différenciation, le "ruffling" membranaire, l’organisation du cytosquelette, la prévention de l’apoptose, le transport de glucose et le traffic vésiculaire (Wymann et al., 2003). Les effets en aval des PI3-kinases sont transmis par ses produits lipidiques par interactions avec des protéines effectrices. Une cible clé du PtdIns(3,4,5)P3 est la sérine/thréonine kinase PKB (Protéine Kinase B, appelée aussi Akt) (Coffer et al., 1998). Le PIP3 se lie au domaine PH (Pleckstrin Homology domain) de PKB et recrute ainsi PKB à la face interne de la membrane plasmique, où elle est phosphorylée (sur Thr308 et Ser473) et activée par d’autres protéines kinases, les PDKs (Phosphoinositide-Dependent Kinases), qui contiennent elles aussi des domaines PH et lient le PIP3 (Chan et al., 1999). Une fois activée, PKB phosphoryle à son tour un grand nombre de protéines telles que des régulateurs directs de la survie cellulaire (BAD, caspase-9, IKK,…) (Datta et al., 1999), des facteurs de transcription (CREB, E2F, NF- κB, forkhead…) ainsi que d’autres protéines kinases qui régulent le métabolisme de la cellule (PF2K, PDE-3B,…) et la synthèse des protéines (GSK-3,…) (Downward, 1998;Kandel et Hay, 1999).
b) Voie Ras-MAPKs
Les protéines Ras sont un point de convergence majeur de la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase et ont un rôle dans une grande variété de fonctions cellulaires telles que la différenciation, la prolifération et l'apoptose (Campbell et al., 1998;Shields et al., 2000). Ras est activé suite à l'échange de GDP par du GTP par la GEF Sos, qui est amenée à la membrane par son association stable avec la protéine adaptatrice Grb2 (Buday et Downward, 1993). Grb2 contient un domaine SH2 qui lie un motif spécifique contenant des tyrosines phosphorylées au niveau des récepteurs à activité tyrosine kinase activés (ex:
récepteur PDGF et récepteur EGF (Ward et al., 1996)). En fonction du type cellulaire et du récepteur (ex: récepteur insuline), l'interaction récepteur-Grb2 n'est pas toujours directe et peut se faire par l'intermédiaire d'une autre protéine adaptatrice, comme par exemple Shc, qui lie le domaine cytoplasmique du récepteur via son domaine SH2, conduisant à sa
6
SOS
Shc Grb2 Ras
Raf
MEK
ERK
GTP
GDP
RTK
MEK
ERK +
+
+
Figure 4: Activation de la cascade Ras par les facteurs de croissance se liant sur un récepteur à activité tyrosine kinase.
phosphorylation.
Introduction
phosphorylation sur tyrosine et à la liaison consécutive de Grb2 (Margolis et Skolnik, 1994) (figure 4).
Ras est activé par mutations dans 30% des tumeurs humaines et dans certains cancers tels que les carcinomes pancréatiques, cette fréquence atteint 90% (Bos, 1989). La majorité de ces mutations diminuent l’hydrolyse intrinsèque du GTP et rendent la molécule moins sensible à l’hydrolyse stimulée par les GAPs. Ras, rendu alors constitutivement actif, active continuellement les voies de signalisation en aval, indépendamment de toute stimulation par les facteurs de croissance.
Sous sa forme active, Ras interagit avec un grand nombre d’effecteurs (Campbell et al., 1998) et joue un rôle important dans la voie de signalisation menant des récepteurs à activité tyrosine kinase aux MAP kinases. Dans cette voie, Ras active la sérine/thréonine kinase Raf (une MAP kinase kinase kinase). Une fois activé, Raf phosphoryle et active à son tour une seconde protéine appelée MEK (MAP kinase kinase ou ERK kinase) (Marshall, 1994;Marshall, 1996;Cobb, 1999). MEK est une protéine kinase qui active les membres de la famille ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) par phosphorylation sur des résidus thréonine et tyrosine séparés par un acide aminé (ex : Thr183/Tyr185 de ERK2). Une fois activé, ERK phosphoryle une variété de cibles incluant d’autres protéines kinases (ex : p90RSK). Une fraction de ERK activé migre dans le noyau où il régule des facteurs de transcription par phosphorylation (ex : Elk-1, c-jun, c-fos, SAP-1/2, ATF-2, c-myc) (Treisman, 1996).
En plus des ERKs, il existe d’autres MAPKs dont les plus connues sont les JNK/SAPK (c-Jun terminal Kinase/Stress Activated Protein Kinase) (Ip et Davis, 1998) et p38/HOG-1 (High Osmolarity Glycerol) (Ono et Han, 2000). Comme les ERKs, elles sont activées par une double phosphorylation sur thréonine et tyrosine et peuvent également migrer dans le noyau pour aller phosphoryler des facteurs de transcription.
La voie ERKs mène principalement à la prolifération cellulaire et peut être activée par une grande variété de stimuli incluant les facteurs de croissance, les cytokines, les récepteurs couplés aux protéines G, les agents transformants et les carcinogènes (Johnson et Lapadat, 2002). Les JNKs et p38MAPK sont activées par les UV, les cytokines et d'autres stress environnementaux et, dans certains types cellulaires, par les facteurs de croissance ou hormones agissant via les récepteurs couplés aux protéines G. Elles sont principalement impliquées dans la biosynthèse des cytokines et l'apoptose, et dans une moindre mesure dans les voies régulant la prolifération ou la fonction cellulaire (English et al., 1999;Johnson et Lapadat, 2002).
Notons que des croisements ("cross-signalling"), des jonctions et des boucles de rétrocontrôle existent entre ces trois cascades de MAPKs rendant cette signalisation encore plus complexe.
c) Transmission du signal induit par l’AMP cyclique
La régulation de l’expression des gènes par l’AMPc joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération, la survie et la différenciation d’une grande variété de cellules animales.
L’AMPc peut réguler directement les canaux ioniques CNG (Cyclic Nucleotide-Gated ion channels) présents notamment dans le cerveau (dans les neurones olfactifs) (Gold et Pugh, 1997), mais également dans des tissus non neuronaux (Kaupp et Seifert, 2002). Cependant, la majorité des effets de l’AMPc dans les eucaryotes supérieurs sont régulés par l’action des 7
Gs
Epac
CRE C
C
C
C Adénylate
cyclase AMPcÊ
PKA
R R
C
R R
CREB
CREBP
P ATP
ADP
RCPG
+ +
+
noyau
CREB
GDP
+
Figure 5: La cascade de l’AMP cyclique (adapté de « Molecular Cell Biology » de Baltimore et coll., 1996).
RCPG: récepteur couplé aux protéines G, PKA: protéine kinase A, R: sous-unité régulatrice, C: sous-unité catalytique, CREB: CRE binding protein, CRE: cAMP responsive element.
Introduction
protéines kinases A (PKA ou cAMP-dependent protein kinase). Les protéines AKAPs (A kinase anchoring proteins) contribuent à la spécificité et à la polyvalence de la voie AMPc- PKA. Les AKAPs ciblent les PKA vers des substrats spécifiques et des compartiments cellulaires distincts apportant une spécificité spatiale aux effets biologiques de la voie AMPc- PKA. Les AKAPs servent aussi de protéines d'échafaudage qui assemblent la PKA avec des phosphatases, kinases et autres protéines impliquées dans la transduction de signal (Tasken et Aandahl, 2004).
La forme inactive de la PKA est un tétramère constitué de deux sous-unités catalytiques C (3 isoformes Cα, Cβ et Cγ) et deux sous-unités régulatrices R. Deux types de PKA, type I et type II, se distinguant par leurs sous-unités R (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ) ont été identifiés (Doskeland et al., 1993). L’AMPc se lie aux sous-unités R, induisant un changement conformationnel qui entraîne une diminution d’affinité de R pour C, et conduit à leur dissociation des sous-unités C. Les sous-unités C libres sont alors actives et capables de phosphoryler des résidus sérine et thréonine sur leurs protéines cibles. Dans un grand nombre de cellules, l’augmentation d’AMPc active la transcription de gènes cibles spécifiques qui contiennent une séquence régulatrice appelée CRE (cAMP Responsive Element). Dans ce cas, le signal est transmis depuis le cytoplasme vers le noyau par la sous-unité C de la PKA, qui est capable d’entrer dans le noyau après sa libération des sous-unités R (Harootunian et al., 1993). Dans le noyau, les sous-unités C phosphorylent les facteurs de transcription de la famille CREB, tels que CREB (CRE-Binding Protein), CREM (cAMP Responsive Element Modulator) et ATF-1 (Activating Transcription Factor-1), menant à l’activation ou la répression des gènes inductibles par l’AMPc (Quinn, 2002;Servillo et al., 2002) (figure 5). La phosphorylation de CREB sur la Ser133 par la PKA est nécessaire pour son interaction avec CBP (CREB-binding protein), un co-activateur capable d'interagir directement avec les facteurs transcriptionnels de base et qui a aussi une activité d'histone acétyl transférase (Servillo et al., 2002). CREB peut être également phosphorylé et activé par d'autres kinases que la PKA (Richards, 2001). Différentes isoformes des protéines de la famille CREB sont générées principalement par épissage alternatif. Certaines agissent comme des activateurs transcriptionnels: CREMτ, CREB et ATF-1; d'autres comme répresseurs: CREMα, β, γ, CREB-2 et ICER (Inducible cAMP Early Repressor). Ce dernier est transcrit à partir d'un promoteur inductible par l'AMPc localisé dans un intron du gène CREM (Servillo et al., 2002). L'ICER ne contient pas de site de phosphorylation par la PKA qui, par conséquent, ne régule pas son activité. Mais il est par contre fortement induit en réponse à l'AMPc, via plusieurs sites CRE localisés dans son promoteur (Molina et al., 1993).
Pendant longtemps on a cru que la PKA était l'effecteur nécessaire et suffisant de la transduction du signal induit par l'AMPc. Ce concept a été invalidé dans le modèle thyroïdien par S. Dremier, dont les résultats ont suggéré l'existence d'autres protéines cibles de l'AMPc dans l'action de la TSH (Dremier et al., 1997). Par la suite, deux nouvelles protéines directement activées par l'AMPc ont été identifiées (de Rooij et al., 1998;Kawasaki et al., 1998a). Ces protéines possèdent une activité de facteur d'échange de nucléotides guanyliques (GEF) pour les petites protéines G Rap1 et Rap2 (de Rooij et al., 1998;Kawasaki et al., 1998a;de Rooij et al., 2000) et ont par conséquent été appelées cAMP-GEFI (ou Epac1, Exchange protein activated by cAMP) et cAMP-GEFII (ou Epac2). Epac1 est exprimée de façon abondante dans beaucoup de tissus, dont la thyroïde (Kawasaki et al., 1998a), tandis que Epac2 a une distribution plus restreinte dans le cerveau et les glandes surrénales.
Initialement Rap1 a été identifié comme un membre de la famille Ras capable d'inverser le phénotype morphologique de cellules transformées par Ras (Kitayama et al., 1989). Ceci
8
ajouté au fait que Rap1 et Ras partagent des effecteurs communs a mené à l'hypothèse que Rap1 pourrait fonctionner comme un antagoniste de Ras en liant et séquestrant des effecteurs de ce dernier sous forme de complexes inactifs (Bos et al., 2001). Cependant ces résultats ont été obtenus par surexpression de Rap1, or il semblerait que ce ne soit pas le cas de Rap1 endogène. Par exemple, dans des fibroblastes de rat, l'activation de Rap1 endogène n'affecte pas l'activation des ERKs dépendante de Ras (Zwartkruis et al., 1998). Depuis, d'autres fonctions, indépendantes de Ras, ont été attribuées à Rap. Rap1 joue notamment un rôle important dans les fonctions liées à l'adhésion et dépendantes des intégrines telles que les contacts cellule-cellule, la liaison cellule-matrice extracellulaire ou encore la migration (Caron, 2003;Hattori et Minato, 2003;Bos et al., 2003). Il pourrait également avoir un rôle positif ou négatif dans la prolifération et la différenciation cellulaire en fonction du type cellulaire (Vossler et al., 1997;Pizon et al., 1999;Tsygankova et al., 2001;Hattori et Minato, 2003).
En fonction du type cellulaire, Rap1 peut aussi être activé par les récepteurs à activité tyrosine kinase via la protéine GEF C3G (Gotoh et al., 1995) et les seconds messagers tels que le Ca2+
et le DAG via CalDAG-GEFI (Kawasaki et al., 1998b;Dremier et al., 2000). Ceci fait de lui un acteur central dans les processus de transduction de signaux. Les protéines Rap1 sont également des substrats de la PKA (Quilliam et al., 1991;Altschuler et Lapetina, 1993;Vossler et al., 1997), mais le rôle de cette phosphorylation est encore peu clair (Tsygankova et al., 2001).
I.1.4. Réponses nucléaires: les facteurs de transcription AP-1
L'exposition de cellules quiescentes au sérum ou à des facteurs de croissance conduit à l'expression rapide et souvent transitoire de transcrits appelés "immediate early genes" (IEGs) (Curran et Morgan, 1987;Lau et Nathans, 1987). L'induction des IEGs a lieu en absence de synthèse protéique de novo. Parmi les IEGs, on trouve la famille des proto-oncogènes nucléaires fos et jun. La famille fos comprend les membres c-fos (Greenberg et Ziff, 1984;Muller et al., 1984), fosB (Zerial et al., 1989), fra-1 (Cohen et Curran, 1988) et fra-2 (Matsui et al., 1990;Nishina et al., 1990), tandis que la famille jun inclut les membres c-jun (Ryseck et al., 1988;Ryder et Nathans, 1988), junB (Ryder et al., 1988) et junD (Ryder et al., 1989).
Les protéines Jun peuvent homo- ou hétérodimériser l'une avec l'autre ou avec les membres de la famille Fos pour former les facteurs de transcription AP-1 (Angel et Karin, 1991). En revanche, les protéines Fos ne peuvent pas homodimériser. Ces protéines s'associent entre elles par des interactions hydrophobes entre leur domaine tirette à leucines (LZ); la liaison à l'ADN, quant à elle, se produit grâce à la région basique (BR) située juste en amont (Gentz et al., 1989).
Les complexes AP-1 sont activés en réponse à une très large gamme de stimuli tels que esters de phorbol, les facteurs de croissance mitogéniques, les cytokines inflammatoires, les UV et radiations ionisantes ou d'autres stress cellulaires (Wisdom, 1999). Par exemple, l'activité de AP-1 peut être augmentée suite à l'induction de la transcription de c-fos par ERK1/2. Ceux-ci phosphorylent le facteur de transcription Elk1/TCF, responsable de la stimulation de l'expression de c-fos en se liant sur un SRE (Serum Response Element) localisé dans le promoteur de c-fos (Treisman, 1994). L'activité de AP-1 peut être également stimulée par la phosphorylation de Jun par les JNK (Minden et al., 1994). Les complexes AP-1 se lient sur la séquence d'ADN palindromique TGACTCA, appelée TRE (TPA responsive Element) (Angel
BR LZ
1
141 182 211 338
237
1 237 284 FosB
FosB/SF
(ATG) (TAA)
(TGA)
BR LZ
domaine d’activation N-terminal domaine d’activation riche en prolines
groupe de sérines dont la phosphorylation augmente l’activation
motif d’interaction avec TBP (TATA box binding protein)
Figure 6: Structure de la protéine Fos B
Le gène fosB génère deux transcrits codant pour deux protéines: FosB qui compte 338 acides aminés et FosB/SF qui n’en comporte que 237. Cette forme plus courte résulte d’un épissage alernatif du 4° exon du gène fosB. Cet épissage de 141 nucléotides (47 acides aminés), représenté par les pointillés, génère un codon stop conduisant à une protéine dont les 101 acides aminés C-terminaux sont absents.
BR: région basique, LZ: leucine zipper.
et al., 1987), qui est présente dans la région régulatrice d'une variété de gènes généralement importants dans la croissance cellulaire normale ou pathologique, tels que la collagénase, l'interleukine-2, le TGFβ, c-jun (autorégulation positive) ou encore la cycline D1, et contrôlent ainsi leur expression (Angel et Karin, 1991). Jun est également capable d'interagir avec des protéines appartenant à d'autres familles de facteurs de transcription comme ceux de la famille CREB/ATF. Ce dimère reconnaît alors préférentiellement l'élément de réponse à l'AMPc CRE (Macgregor et al., 1990). En contraste avec la forte affinité de liaison des complexes Jun/Fos pour la séquence TRE, les homodimères Jun/Jun montrent une plus faible affinité de liaison à l'ADN (Nakabeppu et al., 1988;Lucibello et Muller, 1992).
L'expression des protéines Jun et Fos joue un rôle central dans le contrôle de la prolifération.
En effet, leur inhibition par des anticorps bloquants ou des antisens bloque la synthèse d'ADN dans des fibroblastes stimulés par les facteurs de croissance (Holt et al., 1986;Nishikura et Murray, 1987;Dobrazanski et al., 1991;Kovary et Bravo, 1991).
a) Le proto-oncogène FosB
L'expression de FosB, dans les fibroblastes, est activée durant la transition G0/G1. La stimulation par des facteurs de croissance mène à une accumulation rapide et transitoire de l'ARNm de FosB (Zerial et al., 1989), dont la cinétique est similaire à celle de c-Fos (Muller et al., 1984), en contraste avec Fra-1 et Fra-2 qui montrent une réponse un peu plus tardive (Cohen et Curran, 1988;Matsui et al., 1990;Nishina et al., 1990).
FosB, comme c-Fos, peut réprimer sa propre expression, via un site SRE (Serum Responsive Element), mais également l'activité du promoteur c-Fos. De même, l'activité du promoteur de FosB est régulée négativement par c-Fos (Lazo et al., 1992).
Dans les fibroblastes, le gène fosB génère deux transcrits, par épissage alternatif de l'exon 4, codant pour deux protéines: fosB (338 acides aminés, 52 kDa) et la forme plus courte FosB/SF (ou ∆FosB) qui contient les domaines de liaison à l'ADN et de dimérisation mais pas les 101 acides aminés de l'extrémité C-terminale (37 kDa) (Dobrazanski et al., 1991;Lazo et al., 1992) (Figure 6). Tout comme FosB, FosB/SF peut s'associer avec les protéines Jun et lier l'ADN en association avec celles-ci (Dobrazanski et al., 1991;Yen et al., 1991). Cependant d'autres groupes ont montré, par des expériences de transfection dans des cellules de carcinomes embryonnaires F9, que la forme courte de FosB n'a pas la capacité d'activer un promoteur contenant un site AP-1 et se comporte comme un dominant négatif de FosB dans ces cellules (Yen et al., 1991;Nakabeppu et Nathans, 1991). En effet, contrairement à FosB, FosB/SF ne peut plus réprimer le promoteur de c-fos, mais il est capable d'inhiber la répression du promoteur c-fos induite par FosB ou c-Fos. Cette découverte les a mené à postuler que la fonction cellulaire de FosB/SF serait de limiter l'activité transcriptionnelle des protéines Jun et Fos après induction par un agent mitogène. En revanche, Dobrazanski et ses collaborateurs ont montré que FosB/SF peut activer, bien que plus faiblement que FosB, un promoteur contenant un site AP-1 dans des fibroblastes transfectés par une construction AP- 1/CAT. De plus, ce n'est que lorsqu'il est exprimé en excès par rapport à FosB qu'il peut diminuer l'activité transcriptionnelle de celui-ci. L'expression constitutive de taux élevés de FosB/SF dans des fibroblastes de souris n'a pas non plus d'effet inhibiteur significatif dans l'induction de la prolifération ou de la progression du cycle cellulaire (Dobrazanski et al., 1991).
