Tests de transmigration dans des chambres de Boyden:

cytosquelette et observées après 24h de culture sur les substrats micro-structurés. Dans ces conditions les résultats observés reflètent réellement l'effet des drogues sur la déformation et sont présentés dans la partie résultat (III.4.2).

II.5.4. Inhibition de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire par les siRNA:

Pour les expériences de transfections avec siRNA, seules les cellules SaOs-2 ont été étudiées car les cellules TC7 sont difficilement transfectables à des taux permettant ce type de travail. Trois protéines du complexe LINC (SUN1, SUN2 et Nesprine2) ont été inhibées ainsi que deux protéines du cytosquelette, la myosine II et la lamine A. L'insertion des siRNA dans les cellules a été effectuée par utilisation d'un kit de transfection nommé siPORT™ NeoFX™ (Life Technologies™). Ce kit est basé sur des liposomes qui permettent d'obtenir un taux important de cellules transfectées. Et même si ces transfections sont transitoires elles permettent dans ce cas une inhibition des protéines cibles dans plus de 80% des cellules. La transfection a été effectuée selon le protocole donné par le fournisseur avec des concentrations en siRNA de 30nM. L'analyse des résultats a été réalisée dans un premier temps sur des cellules fixées et immunomarquées puis en dynamique pendant 24h avec des cellules transfectées avec de l'histone-GFP et de l'actine-RFP.

II.6. Tests de transmigration dans des chambres de Boyden:

Les tests de transmigration ont été effectués sur quatre types cellulaires, SaOs-2, TC7, MG-63 et OHS-4. Les expériences ont été réalisées en deux étapes, une première de mise au point sur les cellules SaOs-2 et une seconde de comparaison des quatre lignées.

II.6.1. Mise au point des conditions de transmigration sur cellules SaOs-2:

La mise au point a été réalisée sur les cellules SaOs-2 dans 6 conditions (figII.11). Ces conditions dépendent de deux paramètres principaux qui sont la fonctionnalisation de la membrane poreuse d'une part et l'ajout d'attractant d'autre part. La fonctionnalisation a été effectuée par incubation 1h à 37°C avec une solution de fibronectine à 10ng.ml^-1. La fixation de la fibronectine s'effectue par simple adsorption des protéines sur la surface, elle a été réalisée sur la face inférieure de la membrane, des deux côtés ou pas du tout.

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L'attractant utilisé dans les expériences de transmigration a été le SVF. Pour cela, le SVF a été ajouté de part et d'autre de la membrane dans les conditions dites sans attractant (chemo-) et uniquement dans le compartiment inférieur pour les expériences avec attractant (chemo+).

Les cellules SaOs-2 ont été alors ensemencées dans chaque condition à 5.10⁴ cellules/cm² sur les parties supérieures des chambres de Boyden et observées en conditions fixées et vivantes. Les cellules fixées l'ont été après 6h de culture et ont été marquées au DAPI et à la phalloïdine-TRITC. Leur observation a été effectuée de part et d'autre de la membrane poreuse par microscopie confocale avec les objectifs X20 ou X63 à immersion à huile. L'objectif le plus faible a permis de réaliser les études quantitatives alors que l'objectif X63 a été mis à profit pour une approche qualitative. Enfin pour comprendre la cinétique de traversée, les cellules SaOs-2 ont été transfectées avec de l'histone-GFP et de l'actine-RFP, ensemencées sur les membranes poreuses et observées pendant 6h en vivant par microscopie confocale.

Fibronectine

Boyden

Attractant

Milieu de culture

/Chemo

-FN -/- = Membrane non fonctionnalisée

FN -/+ = Membrane fonctionnalisée sur

la partie inférieure uniquement

FN +/+ = Membrane fonctionnalisée de

part et d’autre.

Chemo - = Sans chimioattractant

Chemo + = Avec chimioattractant

FN -/+

Chemo

-FN +/+

Chemo

-FN

-/-Chemo +

FN -/+

Chemo +

FN +/+

Chemo +

®¯°± ±²³³: Schémas des conditions de mise au point des chambres de Boyden. Six conditions ont été

testées autour de deux paramètres principaux qui sont la fonctionnalisation du support et l'ajout ou non de chimioattractant.

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II.6.2. Comparaison des capacités de transmigration des cellules MG-63, OHS-4 SaOs-2 et TC7:

Une fois la mise au point réalisée, les comparaisons entre les cellules SaOs-2, TC7, MG-63 et OHS-4 ont pu être effectuées. Pour cela la condition de culture avec une membrane fonctionnalisée en dessous et du chimioattractant a été choisie (FN -/+, chemo+). Les cellules ont été ajoutées sur la partie supérieure de la membrane à raison de 5.10⁴ cellules/cm² et cultivée 6h pour SaOs-2, MG-63 et OHS-4, et 48h pour TC7. L'observation de la transmigration a été effectuée comme précédemment sur des cellules fixées et vivantes.

Les cellules fixées ont été marquées avec du DAPI et de la phalloÏdine-TRITC imagées avec un objectif X20 pour les quantifications et avec un objectif X63 à immersion à huile pour les analyses qualitatives.

Les cellules vivantes ont été transfectées avec de l'histone-GFP et de l'actine-RFP et observée en culture sur les membranes poreuses pendant 6h pour les ostéosarcomes. Les cellules TC7 quant à elles ont été marquées au CFDA,SE et suivies pendant 6h en culture sur les chambres de Boyden.

II.7. Etude de l'expression génique des cellules déformées:

Les cellules cultivées sur micro-piliers présentent des déformations très importantes qui pourraient impliquer des gènes en particulier ou même modifier l'expression de certains gènes à cause de la déformation du noyau lui-même. L'expression des gènes est possible à évaluer en termes qualitatif et quantitatif en étudiant les ARN messagers.

II.7.1. Extraction d'ARN:

L'extraction d'ARN a été effectuée pour les cellules SaOs-2 et TC7 dans deux conditions, d'une part en culture sur piliers, d'autre part sur des surfaces planes. Dans chaque cas des surfaces de PLLA (avec ou sans piliers) ont été fixées dans des boîtes de Pétri de 10cm de diamètre non préparée pour la culture cellulaire. Un million de cellules ont été ensemencées et cultivées 24h pour SaOs-2 et 72h pour TC7. Après ces temps d'incubation, les cellules ne pouvant pas être récupérées par grattage, les substrats ont été récupérés et rassemblés dans des tubes stériles de 2ml. Un millilitre de Trizol (Sigma Aldrich) a été ajouté dans chaque tube et le tout a été agité pendant 30sec. La solution de Trizol chargée en cellules fractionnées a été

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récupérée par aspiration avec une micropipette et déposée dans un second tube. Ces solutions ont été plongées dans l'azote liquide afin de conserver les extraits en attente de la suite de l'extraction. La décongélation a été réalisée sur glace. Deux cents microlitres de chloroforme ont été ajoutés et bien homogénéisés avec le reste de la solution. Après 15min d'incubation à température ambiante, les solutions ont été centrifugées 15min à 12000g à 4°C. La phase aqueuse de chaque tube a alors été transférée dans d'autres tubes et 0,5ml d'isopropanol ont été ajoutés et homogénéisés. Après 10 min d'incubation à température ambiante, une nouvelle centrifugation à 12000g pendant 8min à 4°C a été réalisée. Les surnageants ont alors été éliminés et l'ARN lavé par un bain dans de l'éthanol à 75%. Les solutions ont été centrifugées une dernière fois à 7500g pendant 5min à 4°C, les surnageants éliminés et l'ARN resuspendu dans de l'eau déminéralisée. Tout au long de l'extraction les échantillons ont été conservés sur glace sauf pour les incubations à température ambiante.

II.7.2. PCR et séquençage d'ARN:

Les ARN des cellules SaOs-2 et TC7 ont été rétro-transcrits sous forme d'ADNc avec un kit "High capacity cDNA Reverse Transcription Kit" (Applied Biosystems, Life Technologies) dans un thermocycleur (Eppendorf, France). Les ADNc obtenus ont permis d'une part l'étude de l'expression des gènes cdx2, HNF1-4α (Hepatocyte Nuclear Factor) et GATA-6. Ces études ont été menées par RT-QPCR avec un kit "Taqman Gene Expression Assays" (Applied Biosystems, Life Technologies). D'autre part les ADNc ont été séquencés dans le cadre d'une sous-traitance à l'IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire) à Strasbourg (France). Les analyses des séquences géniques ont été réalisées avec Excel et le logiciel libre "DAVID Bioinformatics Resources 6.7" (Huang D.W., et al., 2008).