III. Résultats et Discussion:
III.4 Comparaison des comportements de cellules mésenchymateuses et épithéliales cancéreuses
III.4.1 Organisation du cytosquelette et adhésion des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: 108
Comme nous l'avons vu précédemment, le cytosquelette est au centre du mécanisme de déformation des cellules cancéreuses sur les micro-piliers. Son observation permet comme nous venons de le voir de mieux caractériser son implication et de comprendre la mécanique cellulaire sous-jacente. Dans ce but, les cellules SaOs-2 et TC7 ont été respectivement cultivées 24 et 48h sur des supports constitués de micro-piliers carrés de 7µm séparés de 7µm. Les cellules ont été ensuite fixées et marquées afin d'observer, les noyaux, l'actine, la vimentine, la pankératine, la lamine A, les microtubules et la vinculine. Les cellules ont alors été observées au microscope confocal afin de caractériser et de comparer les réseaux de cytosquelette. L'intérêt de ce travail est de comparer en termes de déformations cellulaires des cellules issues de deux types de cancers, l'un osseux, l'autre intestinal. Mais surtout l'objectif est d'observer les mécanismes de déformation d'une cellule mésenchymateuse qui vit de manière isolée dans une matrice extracellulaire (SaOs-2) comparée à des cellules épithéliales qui présentent, elles, un comportement collectif typique (TC7).
Pour les cellules SaOs-2, les résultats confirment que l'actine est toujours dense et périphérique avec des condensations autour des piliers. La grande différence d'organisation de l'actine sur piliers comparée aux SaOs-2 sur supports plats est que l'actine à 24h ne semble plus s'organiser en fibres de stress. Une observation nouvelle est que dans une cellule en cours de déformation, le centrosome est souvent placé sur le sommet du noyau avec les microtubules qui sont distribués tout autour du noyau. Dans ce cas, les microtubules pourraient agir comme une gaine protectrice ou auraient un rôle dans le guidage du noyau. La vimentine est aussi organisée en réseau dense autour du noyau cellulaire déformé. Cependant, des densifications filamenteuses apparaissent aussi près des piliers comme le montrent les flèches bleues sur la FigIII.5. La vimentine pourrait d'une part assumer un rôle mécanique important dans la déformation par son lien aux piliers.
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D'autre part, le réseau dense de vimentine autour du noyau pourrait participer au maintien de l'intégrité nucléaire. La lamine A qui est intimement liée à la membrane interne des noyaux apparait ici présente mais discontinue. Effectivement, la lamine A semble par endroit s'invaginer dans le noyau. De plus, des fragments ou de plus petites protrusions sont identifiables. La lamine A est donc très présente dans les noyaux mais semble affectée par la déformation. La myosine II observée dans les
Actine ADN Microtubules Actine ADN Vimentine
Myosine ADN Actine
ADN Vinculine } ~ }0µm Actine Lamine A
: Organisation du cytosquelette et des points focaux des cellules SaOs-2 : Les cellules SaOs-2 ont
été cultivées 24h sur supports microstructurés p ¡¢£¤ ¥¦§¨ ©§§ª «¬ -FITC ou -®¯¤®°±
Les cellules ont ensuite été immunomarquées avec des anticorps dirigés contre la vinculine, la β-tubuline, la vimentine, la lamine A ou la myosine II. Les acquisitions ont été effectuées par microscopie confocale.
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cellules SaOs-2 déformées n'est pas très dense. Toutefois elle est présente et co-localise majoritairement avec l'actine autour des micro-piliers. Son organisation est discontinue le long des filaments d'actine. Cette partie du cytosquelette pourrait être nécessaire à la mise en tension des cellules pour les maintenir déformées. Enfin, l'organisation des points focaux des cellules SaOs-2 est non homogène. En effet, les points focaux se présentent sous la forme de larges densifications qui sont essentiellement placées au contact des piliers comme le montrent les flèches blanches sur la FigIII.5. Ces densifications sont le plus souvent à la base et sur les arêtes des piliers. Quelques points focaux sont observés sur le dessus des piliers et d'autres plus petits sont identifiables sous les cellules. Ces distributions montrent que les cellules subissent principalement une tension quasi parallèle à la surface (figIII.5). Concernant les cellules TC7, l'actine n'est pas aussi dense que pour les cellules SaOs-2. Toutefois elle n'est pas diffuse. Elle est présente par endroits seulement. Quand elle est présente, elle est dense et périphérique à des groupes de cellules. En effet, dans le cas des TC7, l'actine ne s'organise pas autour de chaque cellule mais une collaboration existe entre les cellules permettant la formation d'un réseau d'actine placé autour de toute la colonie. Parfois des densifications d'actine sont visualisées au centre des colonies cellulaires. Les microtubules sont présents en grande quantité dans les cellules TC7 et leur organisation est différente de celle des SaOs-2. Effectivement, les réseaux de microtubules se révèlent avoir une organisation plus périphérique pour les cellules TC7. Les filaments sont toujours présents autour des noyaux mais ont aussi de larges densifications jusqu'aux extrémités membranaires ainsi qu'autour des piliers. Ceci peut suggérer que le rôle mécanique des microtubules soit plus important pour les cellules TC7 que pour les cellules SaOs-2. Les filaments de kératine sont très présents au sein des cellules TC7 et présentent des organisations proches de la vimentine dans les cellules SaOs-2. La myosine II n'est presque pas identifiable dans les cellules TC7, elle apparaît ponctuellement dans des zones riches en actine. Enfin, la vinculine, composant clé des points focaux n'est pas détectable dans les cellules TC7 déformées sur micro-piliers. Ceci pourrait signifier que les points focaux ne seraient pas primordiaux pour la déformation collective des cellules de carcinome (figIII.6).
En conclusion, des différences importantes en termes de quantité et d'organisation de chaque composant du cytosquelette sont observables entre les types cellulaires comparés ici.
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Le rôle respectif des différents éléments du cytosquelette pourrait donc varier d'une lignée cellulaire à une autre puisque les filaments de même nature ne sont pas organisés de la même manière. La littérature peut aussi nous aider à comprendre quelles sont les implications de chaque partie du squelette cellulaire dans la déformation. L'actine est par exemple définie comme le composant clé dans les lamellipodes et dans toutes les protrusions cellulaires (Roos W.H., et al., 2012; Schaub S., et al., 2007). Ceci concorde avec nos observations de l'actine périphérique qui permettrait l'exploration et l'initiation de la déformation. L'actine est aussi connue pour collaborer avec la myosine afin de créer les forces cellulaires
µ¶ ·¶ ¸ ¹ º Microtubules ADN Actine »¼½ ¼ ¾¿ À Pankeratine ADN Actine
»¼½¼¾¿ À Myosine ADN Actine Vinculine ADN Actine ÉÆÇ È ÊÇ È
ËÌÍÎ ÎÎÏÐ: Organisation du cytosquelette des cellules TC7: Les cellules TC7 ont été cultivées 48h sur
micro-piliers puis marquées au DAPI et à la phalloïdineÑÒÓ ÔÒ Õ Ö× Ø ÙÚØ ÛÛÜ ÛØÙÝ Þ ßØÞ ÙÜ àß Ø áß áàâ â ÜÞ Ý â ãäåÜ áØÙ
avec des anticorps dirigés contræ çè éêëì í çêë æî çè ï-ß ÜðÜÛ àÞØ ñ Ûã ò ãÞ óáä ãß àÞ Ø ÝÜ Ûã âô ÝÙàÞØ ÔÔÖ × Ø Ù
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(Abal M., et al., 2002). Ceci confirme nos observations de colocalisation de ces composants. La myosine est aussi décrite comme impliquée dans les mouvements, migrations et invasions cellulaires, un rôle en somme très dynamique (Jacobelli J., et
al.,2010; Beadle C., et al., 2008). Ce rôle décrit par ces auteurs n'est pas cohérent
avec nos observations. En effet, la myosine apparait plus diffuse dans les cellules SaOs-2 et TC7 déformées suggérant une implication faible dans la déformation sur micro-piliers. La vimentine a été révélée comme importante dans les mécanismes d'adhésion, migration, transmigration par plusieurs auteurs (Lund N., et al.,2010; Nieminen M., et al., 2006). Cette protéine du cytosquelette est donc active dans différents processus mécaniques cellulaires. Ce comportement peut être confirmé par nos observations où la vimentine organisée dans la région périnucléaire s'étend jusqu'aux piliers sur lesquels elle semble s'appuyer. La kératine qui est décrite comme s'organisant dans la région périnucléaire également est aussi nécessaire à la migration dans certaines cellules et en particulier les cellules épithéliales (Busch T.,
et al., 2011; Windoffer R., et al., 2011). Dans notre cas, nous pouvons confirmer que
la kératine est présente autour des noyaux. De plus, sa densité importante dans les cellules TC7 déformées nous indique que son rôle dans la dynamique de déformation pourrait être important. La lamine A est connue pour donner sa forme, sa taille et sa stabilité au noyau cellulaire (Shimi T., et al., 2008). Dans notre cas, l'organisation de la lamine A apparait perturbée par la déformation du noyau. Ceci est cohérent avec le fait qu'elle maintient la forme du noyau. En effet, elle subirait ici le mécanisme de déformation du noyau, se casserait et ne serait donc plus uniforme autour du noyau. Ceci rappelle les aspects des noyaux observés par Shimi T., et al., après inhibition de la lamine B et celles de Le Berre M., et al., qui brisent la lamina nucléaire par confinement cellulaire. Ces deux équipes décrivent la formation de bulles sur la membrane nucléaire en réponse aux stress qu'ils créent (Shimi T., et al., 2008; Le Berre M., et al., 2012). Les microtubules ont divers rôles dont le transport de protéines et la ségrégation des chromosomes lors de la mitose (Roos W., et al., 2005). Dans notre cas, par leur présence en quantité importante, les microtubules apparaissent comme des éléments non négligeables de la déformation des cellules, en particulier pour TC7. Enfin, le cytosquelette forme un réseau enchevêtré de filaments qui sont tous interconnectés. Le plus souvent ce n'est pas un type de filament qui régit une fonction ou un comportement. Les forces et organisations cellulaires ont été décrites, par exemple, comme dépendantes à la fois des
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microtubules et de l'acto-myosine (Goldyn A.M., et al., 2010). Dans notre mécanisme de déformation, plusieurs éléments du cytosquelette sont probablement impliqués. De plus, ces co-implications semblent dépendre du type cellulaire. Afin de mieux comprendre le rôle de chacun, tous les éléments du cytosquelette ont été inhibés l'un après l'autre dans les deux types cellulaires.
III.4.2 Implication de chaque composant du cytosquelette:
Afin de mieux comprendre le rôle du cytosquelette, chacun de ses composants a été spécifiquement inhibé par traitement avec des drogues ou des SiRNA. L'actine a été inhibée en utilisant de la cytochalasine D et de la latrunculine A qui respectivement dépolymérise et empêche la polymérisation de l'actine (Coué M., et al., 1987; Peterson J.R., et al., 2002; Karpushev A.V., et al., 2010). La myosine II a été inhibée ou supprimée respectivement par la blebbistatine et des SiRNA spécifiques (Rehfeldt F., et al., 2007; Kovacs, M., et al., 2004). Les filaments intermédiaires ont été bloqués par traitement avec de l'IDPN et de l'acrylamide qui sont décrits comme des perturbateurs de l'organisation de cette partie du cytosquelette (Kumar N., et al., 2007; Sakai H., et al., 2009; Ofek G., et al., 2009). La production de lamine A a été spécifiquement empêchée en transfectant les cellules SaOs-2 avec des SiRNA ciblés sur ce type de filament intermédiaire. Enfin les microtubules ont été inhibés par l'utilisation de la colchicine et du nocodazole qui respectivement inhibent et dépolymérisent les réseaux concernés (Screpanti E., et al., 2010; Marra C.A., et al., 2009; Zhou Q., et al., 2010; Mena A.L., et al., 2010; Ravelli R.B.G., et al., 2004). Pour suivre leurs effets sur la déformation, les cellules SaOs-2 et TC7 ont été marquées au CFDA,SE et au Hoechst et ensemencées sur micro-piliers avec différentes concentrations de drogues (tableau II.1) pendant respectivement 24h et 48h ou 72h. Les cellules SaOs-2 ont été aussi transfectées avec de l'actine-GFP et de la tubuline-RFP, marquée au Hoechst et traitées avec les drogues pendant 24h. Après ces temps d'incubation, les cellules ont été visualisées en vivant par microscopie confocale.
Les résultats obtenus montrent que pour les cellules SaOs-2, la cytochalasine D et la latrunculine A bloquent la déformation cellulaire à partir de 2µM. En effet, les noyaux
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restent au dessus des piliers, seule une partie du corps cellulaire est toujours déformée (figIII.7 et III.8). Ces résultats prouvent que l'actine a un rôle prépondérant dans le passage des cellules dans les espaces entre les piliers. L'inhibition de la myosine II par des siRNA semble ralentir la dynamique de déformation (figIII.9). Toutefois, un traitement avec de la blebbistatine tout comme l'utilisation de SiRNA dirigés contre la myosine II n'empêchent pas les cellules de se déformer (figIII.7, III.8 et III.10).
ûüýþ þþÿF: Effets des drogues dirigées contre chaque partie du cytosquelette sur la déformation des cellules SaOs-2: Les cellules SaOs-2
de drogues et cultivées 24h sur microp p 2 p p
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observations ont été réalisées par microscopie confocale. La déformation des cellules SaO/-=0>? >@0; @9;>.A0B/@C0D9.
condition. Les valeurs ont été reportées sous forme d'histogramme. Les astérisques témoignent d'une probabilité de diminution de la déformation par rapport au témoin de plus de 95% pour "E" .?A.
plus de 99% pour "**". GHIJ KMNO KPNP KPNQ TTNU OO NT JVIW JJ IX YZY 20,0 40,0 60,0 80,0 [YYZY \
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ÔÕÖ×II.9: Etude cinétique de l'effet des SiRNA dirigés contre la myosine II et la lamine A sur la déformation de cellules SaOsØ2 vivantes: Les cellules SaOs-2 ont été transfectées avec de l'histone-Ù ÚÛÜ
de l'actineÝRFP et des SiRNA dirigés contre la myosine II Þ ß àá à á âãä å æç è åé êåààßà åé Þä ë á àÞ ì é í ëí
ensemencées sur microÝîã àã åì é åë Þïé åìðí å é îåäñáä ë òó
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quantitatives à 3h et 6h montrent une différence significative à plus de 95% entre le témoin et les inhibitions spécifiques (*).
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La myosine aurait donc un rôle mineur et ne serait donc pas nécessaire aux déformations. Les cellules SaOs-2 en présence de 1% d'IDPN ou de 10mM d'acrylamide ne se déforment plus sur les micro-piliers (FigIII.7 et III.8). Ces résultats soulignent l'importance des filaments intermédiaires. Ils ont, comme l'actine, un rôle essentiel dans la déformation.
Tous les filaments intermédiaires ne sont toutefois pas requis. ùú ûü ýþÿ Le de la lamine A grâce à des SiRNA diminue la vitesse de déformation des cellules SaOs-2 entre les piliers (figIII.9). Cependant, après 24h, avec ou sans lamine A, les cellules sont déformées dans les mêmes proportions (figIII.10). Enfin les traitements avec 10µM de colchicine et même 20µM de nocodazole ne modifient pas la capacité des cellules SaOs-2 à se déformer entre les piliers (figIII.7). Les microtubules
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458(*9/.:(-F;<= ==>? @: Etude du rôle de la lamine A et de la myosine II dans les déformations des cellules SaOsB2: Les cellules SaOs-CDE GHG HGIJEKMNO G HN KD Q
non avec des SiRNA dirigés contre la myosine II (A) ou la lamine A (B) puis ensemencées sur les miOI D R
piliers. Après 24h les cellules ont été fixées et marquées au DAPI, à la phalloïdineRUVWU X N G JYN O
des anticorps dirigés contre la lamine A ou la myosine II couplés au FITC. Les observations ont effectuées par microscopie confocale. La déformation a été quantifiée dans chaque condition mais ne présente aucune différence significative.
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n'apparaissent donc pas indispensables à la déformation des cellules. Ces résultats sont confirmés par les expériences de transfections cellulaires associées aux traitements avec les drogues (figIII.8). De plus l'observation de l'organisation des microtubules et de l'actine en présence des inhibiteurs nous confirme la spécificité des drogues.
\]^_ __`aa: Etude du rôle de chaque partie du cytosquelette des cellules TC7 par traitement avec des droguesb Les cellules TC7 ont été marquées au Hoechst et au CFDA,SE, t cd et fg hdjgkl g hm e nnfc got g hmcp qr g h
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CFDA,SE Hoechst
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ÏÐÑÒ ÒÒÓÔ Õ: Etude de l'implication de chaque partie du cytosquelette des cellules TC7 pendant 72h: Les
cellules TC7 oÖ ×Ø× ØÙÚ ÛÜÝØÞ ßÚÝà áÞ âãß ×Þ ×ÚÝäåæ çè éêÚë Ú Ö ×ì íî ×ÛÞ× ÛÚ ï× ØÞßÚ ëÞâðÞ ßìïññØ ÛÞ Ö ×Þ ßìÛáòÝÞ ß
bloquant le cytosquelette. Elles ont été ensuite cultivées 72h sur microóô ïð ïÞ Ûß Ú ë Ú Ö × ì íî ×ÛÞ áõßÞ Ûë ØÞß
vivantes par microscopie confocale. Les déformations ont été ÜÝÚÖ × ïñ ïØÞ ß ìÚ Öß âã Ú ÜÝ Þ âá Öìï× ïá Ö Þ ×
reportées dans un histogramme. Les déformations ayant été significativement inhibées (p>99%), sont signalées par une astérisque "ö".
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Pour les cellules TC7, l'inhibition de l'actine avec 2µM de cytochalasine D ou de latrunculine A bloque en grande partie la déformation entre les piliers (figIII.11 et III.12). L'actine est donc largement impliquée dans le passage à l'état déformé des cellules TC7. L'utilisation de la blebbistatine ne montre par contre aucun changement dans le comportement cellulaire (figIII.12). La myosine qui avait déjà été identifiée comme diffuse n'apparait pas importante pour la déformation cellulaire. L'IDPN et l'acrylamide inhibant les filaments intermédiaires bloquent la déformation des cellules TC7 entre les piliers (figIII.11 et III.12). Ces résultats confirment l'importance des filaments intermédiaires dans les mécanismes de déformation. Les drogues dirigées contre les microtubules bloquent cette fois la déformation cellulaire (figIII.11 et III.12).Ces résultats confirment les hypothèses formulées lors de l'observation de l'organisation des microtubules dans les TC7 déformées. De plus, ces observations confirment que d'un type cellulaire à un autre les mécanismes de déformation ne sont pas les mêmes.
Nous avons à présent une idée plus précise de la mécanique cellulaire aboutissant à la déformation des cellules cancéreuses et de leurs noyaux. La première remarque est que ce mécanisme est actif car en bloquant certaines parties du cytosquelette les cellules restent au dessus des piliers et ne déforment plus leurs corps ni leurs noyaux. L'actine apparait nécessaire à la déformation des cellules et en particulier de leurs noyaux. Effectivement, les cellules sans actine ne déforment plus du tout leurs noyaux mais déforment en partie leurs corps cellulaires. Ces observations sont cohérentes avec de nombreux travaux effectués sur cette partie du cytosquelette. L'actine a été présentée comme englobant le noyau et étant même liée physiquement au noyau cellulaire par le complexe LINC (Khatau S.B., et al., 2008; Khatau S.B., et al., 2010; Nagayama, K., et al., 2011). Versaevel M., et al., ont aussi montré que l'actine a un rôle dans le modelage de la forme des noyaux sur des motifs particuliers (Versaevel M., et al., 2011). L'actine appliquerait donc des pressions sur les noyaux aboutissant à leur déformation. L'actine a aussi été observée à la périphérie des cellules, permettant l'exploration entre les piliers grâce à des extensions membranaires. Ceci est confirmé dans la littérature où l'actine est connue comme le composant clé des lamellipodes qui permettent l'exploration active de l'environnement extracellulaire (Schaub S., et al., 2007).
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Les filaments intermédiaires, qui ont une organisation périnucléaire qui s'étend souvent jusqu'aux membranes plasmiques, sont aussi indispensables. En effet, leur inhibition bloque complètement la déformation des cellules. Les filaments intermédiaires sont décrits comme impliqués dans la morphogénèse et le positionnement des noyaux dans les cellules (Ralston E., et al., 2006; Lund N., et al., 2010). De plus, la déformation entre les piliers est active comme nous l'avons dit précédemment. Elle ressemble à des mécanismes de migrations cellulaires à travers des membranes poreuses. Ces migrations sont nommées transmigrations et sont comparées in vivo aux mécanismes d'invasion des cellules cancéreuses. Des acteurs de ces migrations de cellules cancéreuses ont déjà été identifiés et les filaments de kératine (cellules épithéliales) et de vimentine, (cellules endothéliales) en font partie (Busch T., et al., 2012; Beil M., et al., 2003; Rolli C.G., et al., 2010; Windoffer R., et al., 2011; Nieminen M., et al., 2006). Ces observations sont donc cohérentes avec le rôle des filaments intermédiaires dans la dynamique de déformation des cellules entre les piliers.
Les microtubules ont toujours été décrits comme proches des noyaux et notamment par l'intermédiaire de leur source principale de nucléation, les centrosomes (Abal, M.,
et al., 2002). Au sein des levures, les microtubules permettent de maintenir le noyau
centré dans la cellule (Piel M. et al., 2009). Grant Luxton G.W., et al., leur attribuent