Divisions cellulaires sur micro-piliers:

caractérisation de cellules cancéreuses et en particulier pour les cellules cancéreuses ayant un comportement collectif. En effet, comme nous l'avons vu, les cellules TC7 se déforment entre les piliers et sont donc identifiables comme cancéreuses alors qu'elles ne transmigrent pas à travers les membranes poreuses. Par ailleurs, ce matériel micro-structuré permettrait d'identifier un comportement cancéreux. En effet, les cellules cancéreuses subissent de très nombreuses et très différentes mutations convergentes vers un comportement presque unique. Ce comportement acquis au cours des différentes mutations leur confèrent des propriétés comme l'immortalité, des capacités accrues à proliférer, la perte d'inhibition de contact et bien d'autres encore (Boehm J.S. et Hahn W.C., 2004; Münger K., et al., 2004; Sherwood A.L., et al., 2008). Apparemment, ce comportement cancéreux permettrait aussi aux cellules de se déformer et de déformer leurs noyaux de façon importante sans modification de leur viabilité. Grâce aux micro-piliers, l'identification des cellules cancéreuses serait possible à des stades encore précoces de la cancérisation, c'est à dire bien avant que les cellules atteignent le stade ultime de la métastase qui est actuellement considéré comme fatal (Zijl F., et al., 2011). Ce dernier point est sans doute le plus intéressant dans l'utilisation de substrats constitués de micro-piliers pour la caractérisation de cellules cancéreuses.

III.9 Divisions cellulaires sur micro-piliers:

Comme nous l'avons vu précédemment les cellules cancéreuses se déforment entre les micro-piliers. Davidson P. avait montré au sein de notre groupe que les cellules cancéreuses prolifèrent normalement sur ces surfaces microstructurées (Davidson P., et al., 2009). Nous nous sommes alors demandé comment les cellules pouvaient se diviser sur des surfaces exposant des contraintes physiques aussi importantes. En effet, la mitose qui est au centre de nombreux travaux, est connue pour nécessiter un arrondissement des cellules. Cet arrondissement est nécessaire pour maintenir une organisation intracellulaire à la base du bon déroulement des divisions cellulaires (Théry M. et Bornens M., 2008; Fink J., et al., 2011). Cependant cet arrondissement n'est plus possible entre les piliers. Nous avons donc décidé d'observer des mitoses sur micro-piliers afin de comprendre les adaptations concédées par les cellules pour le bon déroulement de leur division.

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Actine Microtubules ADN P   

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Actine ADN P   

F  : Observation du déroulement des mitoses des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: Les

cellules SaOs-2 et TC7 en phase de mitose ont été ob !"#$!  %&' ( & ) *#+ , ,' ,. . / %

micro-structurés. Pour cela les cellules fixées ont été marquées au DAPI, à la phalloïdine-02 34/ ,

TRITC et immunomarquées avec des anticorps dirigées contre les microtubules pour les cellules SaOs-2. En dyn) *#+,a56 55 ,5 /&%! %!*) + ,! ) ,7/67 % 89 /b  )% # /& /&%! %!! )5 # !

par microscopie confocale. Les flèches blanches montrent à chaque fois le haut et le bas des piliers, les flèches rouges pointent l'ADN des cellules observées dans des con"#f, ) % #/& #& 7)b#% ,55  8

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Les cellules ont été dans un premier temps observées sur des échantillons avec cellules fixées. Les cellules SaOs-2 et TC7 ont été marquées au DAPI et à la phalloïdine-FITC ou TRITC. Les cellules SaOs-2 ont aussi été marquées avec des anticorps dirigés contre les microtubules couplés au TRITC. Cependant, les tentatives de synchronisation des cellules ayant échouées, et la fixation des cellules entrainant la perte de nombreuses cellules en division, peu d'évènements ont été observés. Une seconde approche a privilégié l'observation des cellules SaOs-2 et des cellules TC7 en dynamique grâce à un marquage au Hoechst.

Les résultats montrent que les cellules SaOs-2 et TC7 adoptent la même stratégie afin de pouvoir se diviser sur les micro-piliers. En effet, les cellules s'arrondissent en remontant au dessus des piliers (FigIII.24). Ces remontées induisent un faible attachement cellulaire aux surfaces expliquant pourquoi la majorité des cellules en division sont perdues lors des fixations. Par ailleurs, nous avons observé que durant la métaphase le disque métaphasique apparait toujours vertical entre les piliers. Plus surprenant encore, les ségrégations des chromosomes à la fin de la métaphase sont non parallèles (FigIII.24). En effet, les deux types cellulaires analysés présentent des ségrégations chromosomiques qui semblent séparer d'abord un côté du disque métaphasique (la partie inférieure) formant des "ponts" ou des "parapluies". Puis une ouverture progressive du disque s'effectue jusqu'à ségrégation totale. Malgré ces ségrégations inhabituelles, la division cellulaire semble s'effectuer correctement jusqu'à la formation des deux cellules filles qui se redéforment rapidement entre les piliers. Toutefois pour s'assurer que le nombre d'accident mitotique n'est pas plus élevé nous avons décidé d'évaluer la quantité de micronoyaux au sein des cellules SaOs-2 cultivées sur micro-piliers en comparaison aux cellules sur substrats plats. Les cellules cancéreuses sont connues pour contenir une proportion importante de micronoyaux à cause d'accidents mitotiques et de la croissance de chromatine acentrique. Ces derniers sont mêmes utilisés comme marqueurs de la cancérisation (Shimizu N., 2011; Demetriou C.A., et al., 2012; Cardinale F., et al., 2012). En effet, durant la mitose, il est possible que des parties de l'ADN soient désolidarisées du reste des chromosomes en cours de ségrégation principalement dans les cellules cancéreuses et les cellules subissant des mitoses anormales (Shimizu N., 2011). Dans ce cas, une membrane se forme autour de ce nouvel amas d'ADN et subsiste dans le cytoplasme cellulaire.

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Les résultats montrent que les proportions de micronoyaux sur support plats et microstructurés sont identiques (FigIII.25). En effet, dans chaque cas, 12 à 14 micronoyaux pour 100 cellules analysées sont énumérés. Ceci prouve que malgré une division anormale, et des ségrégations chromosomiques semblant être retardées la mitose s'effectue sans accident supplémentaire sur les micro-piliers. Ces résultats confirment que les cellules cancéreuses ont la capacité de vivre dans des compartiments exigus avec des contraintes physiques importantes sans encourir d'accidents particuliers et donc sans entrer en apoptose.

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rapportée pour 100 cellules observées

€‚ƒ ƒƒ„… †: Evaluation des quantités de micro-noyaux dans des cellules SaOs-2 cultivées sur micro-piliers et sur supports plats: ‡es cellules SaOs-2 ont été cultivées sur des surfaces de PLLA planes ou microˆ

structurées sous forme de piliers pendant 24h. Les cellules ont ensuite été fixées et marquées au DAPI et à la phalloïdine-FITC avant d'être observées par microscopie confocale.

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