III. Résultats et Discussion:
III.5 Evaluation du rôle du complexe LINC dans le mécanisme de déformation:
les filaments intermédiaires constitueraient la résistance cellulaire aux contraintes mécaniques (Schoumacher M., et al., 2011). Comme les déformations nucléaires entre les piliers nécessitent d'appliquer des forces importantes sur ces derniers, notre travail confirmerait donc que l'actine et les filaments intermédiaires seraient les acteurs principaux de la déformation. Enfin Dupin I., et al., présentent un schéma de positionnement du noyau lors de la migration cellulaire très intéressant. Dans ce modèle, l'actine est motrice et les filaments intermédiaires agissent comme "enveloppe dynamique guidante" du noyau. En effet, l'actine serait le moteur dans la progression cellulaire et les filaments intermédiaires s'accumuleraient à l'opposé de la direction du noyau afin de le guider (Dupin I., et al.,2010). A nouveau cette description de guidage du noyau cellulaire par l'actine et les filaments intermédiaires concorde parfaitement avec nos observations même si elle ne mentionne pas la myosine indépendance. Le mécanisme de déformation cellulaire dans ce cas serait donc une migration entre les piliers avec l'actine comme moteur principal et les filaments intermédiaires comme guides du noyau et protecteur de l'intégrité cellulaire. De plus, le guidage du noyau par l'actine et les filaments intermédiaires ne repose pas sur de simples contacts aspécifiques avec la membrane nucléaire. Effectivement, des liens physiques ont été décrits entre le cytosquelette et la membrane nucléaire.
III.5 Evaluation du rôle du complexe LINC dans le mécanisme de déformation:
Le cytosquelette cellulaire, et en particulier l'actine est connue pour avoir des liens étroits avec l'environnement extracellulaire par l'intermédiaire des points focaux (Geiger B., et al., 2009). Ces liens sont essentiels notamment dans la sensibilité et la transduction des signaux au sein d'une cellule (Na S., et al., 2008). Ces mécanismes sont largement acceptés comme régulant le comportement cellulaire et notamment par modification de l'expression génique (Vogel V. and Sheetz M., 2006). Cependant le lien entre le cytoplasme et le noyau est en général moins connu. Il implique le cytoplasme et un complexe protéique appelé complexe LINC. Ce complexe protéique a aussi un rôle mécanique. Il stabilise la structure du noyau et conditionne son positionnement au sein de la cellule (Maniotis A.J., et al.,1997; Starr D.A., et al., 2007; Wilhelmsen K., et al., 2006). Il permet aussi la migration nucléaire en relayant les forces intra- et extra- cellulaires jusqu'à l'enveloppe nucléaire (Dahl K.N., et al., 2008; Starr D.A., et al., 2009).
Le cytosquelette peut donc exercer des forces sur le noyau cellulaire comme nous l'avons décrit précédemment. Cependant, ces pressions ne s'effectuent pas par simple contact des filaments sur la membrane nucléaire. Les forces sont transmises par l'intermédiaire du LINC qui lie physiquement le cytosquelette à la membrane nucléaire et même au nucléosquelette.
Dans le but de comprendre le rôle de ce lien physique entre le cytoplasme et le noyau durant la déformation cellulaire entre les micro-piliers, nous avons inhibé certaines protéines de ce complexe. Les protéines SUN1, SUN2 et Nesprine2 qui sont connues pour être liées à l'actine ont donc été bloquées par transfection de SiRNA spécifiques. Une partie des cellules a été ensuite transfectée avec de l'histone-GFP et de l'actine-RFP, ensemencées sur micro-piliers et observées 6h par microscopie confocale. L'autre partie des cellules traitées avec les SiRNA ont été cultivées 24h sur les supports microstructurés, puis fixées, marquées au DAPI, à la phalloïdine-TRITC, et avec des anticorps couplés au FITC dirigés contre SUN1, SUN2 ou nesprine2. Les observations ont été réalisées par microscopie confocale. Les résultats montrent que 3 à 6h après avoir touché la surface, les cellules non traitées avec SiRNA sont déjà déformées. En présence de SiRNA dirigés contre SUN1 et SUN2, le comportement cellulaire de déformation semble freiné. En effet, les cellules SaOs-2 se déforment significativement moins à 6h de contact avec la surface microstructurée (FigIII.12). De plus, les cellules traitées avec des SiRNA bloquant la Nesprine2 semblent aussi nécessiter plus de temps pour se déformer. Effectivement, les cellules SaOs-2 ne disposant plus librement de la Nesprine2 ne sont que partiellement déformées à 6h de culture sur les micro-piliers et le noyau est encore placé au dessus des piliers. Ces résultats révèlent que les composants du complexe LINC pourraient avoir une implication dans la déformation des cellules SaOs-2 et en particulier pour la déformation du noyau. Afin de comprendre cette implication et de peut-être identifier un acteur primordial, nous avons observé les cellules dans les mêmes conditions après 24h de culture.
Les résultats ne démontrent pas de rôle essentiel pour les protéines SUN1, SUN2 et Nesprine2. Les cellules SaOs-2 en présence ou non de ces protéines du complexe LINC apparaissent nettement déformées entre les micro-piliers après 24h (FigIII.13). Toutefois, il existe une faible inhibition significative du taux de déformation quand les protéines SUN1 et Nesprine2 sont inhibées (Fig III.13). Des expériences
supplémentaires à 48h permettront de comprendre si ces inhibitions sont dues à une diminution de la vitesse de déformation ou si elles sont définitives.
T
5 min
3 h
6 h
SNesprine 2
SiRNA
Sun 1
SiRNA
Sun 2
-2 P Histone-GFP ADN Actine-RFP
15µm 10µm 10µm 2 3 4 5 6 7 8 9 ! "#$ !% &% '()*+ , s+ -./.0s: ;< =>?;@ AB s+ -./sC ,: D
Pourcentage de déformation
FEGH HHIJ K: Etude en dynamique de l'effet des SiRNA dirigés contre SUN1, SUN2 et Nesprine2 sur la déformation des cellules SaOsL2: Les cellules SaOs-2 ont été transfectées avec de l'histone-GFP, de l'actine-R MNOQUOVWX RY Z
dirigés contre SUN1, SUN2 ou Nesprine2. Les cellules ont alors été ensemencées sur micro[pX \X O ]VOQ^ _ VO ]` aO V
6h par microscopie confocale. L'évolution des déformations, quantifiée au cours du temps montre un ralentissement significatif de la déformation à 6h de culture lors de l'inhibition des sun1, sun2 et nesprine2 (*).
b cd
Sun 1 Sun 2 Nesprine 2
e f g h
S
iR
N
A
A
v
e
c
S
iR
N
A
Actine DAPI
ijkjlmn10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 15µm oqo roqo 40,0 60,0 80,0
tuvwxy z x{|}~y z x{|}~y z x{ |}|z
*
Pourcentage de déformation
: Etude du rôle du complexe LINC dans les déformations des cellules SaOs-2: Les cellules SaOs-2 ont été transfectées avec des SiRNA dirigés contre Sun1, Sun2 et nesprine2 puis ensemencées sur les micro
24h les cellules ont été fixées et marquées au DAPI, à la phalloïdineTRITC e
Sun1, Sun2 ou Nesprine2 couplés au FITC. Les observations ont été effectuées par microscopie confocale. La déformation, quantifiée dans chaque condition, montre une différence significative (à plus de 99% "
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Le complexe LINC est décrit dans de nombreux travaux comme essentiel dans le positionnement du noyau et même primordial dans la transmission des forces entre le cytoplasme et le nucléoplasme (Ostlund, C., et al., 2009; Tzur Y.B., et al., 2006; Lombardi M.L., et al., 2011; Wang N., et al., 2009; Haque F., et al., 2010; Crisp M., et
al., 2005; Starr D.A., et al., 2010). Plus précisément, les protéines SUN1 et SUN2,
décrites comme liées aux Nesprines et lamines, sont connues pour être actrices dans le positionnement et la migration du noyau (Haque F., et al., 2006; Hodzic D.M.,
et al., 2004). Il ne serait donc pas surprenant que l'inhibition de ces dernières affecte
la déformation du noyau. Par ailleurs, la Nesprine2 est présentée comme intégrée au lien entre le cytosquelette et le noyau (Nery F.C., et al., 2008). De plus, des études ont révélé que les inhibitions de la Nesprine2 dans certains modèles inhibaient la migration (Friedl P., et al., 2011). Ceci corrobore les observations précédentes de ralentissement de la migration/déformation entre les piliers (FigIII.12).
En conclusion, le rôle identifié précédemment pour la Nesprine2 existe très certainement mais n'est pas primordial dans les mécanismes de déformation sur piliers. De plus, les protéines SUN1 et SUN2, sans être nécessaires, semblent aussi faciliter la déformation nucléaire. Il est très possible que plusieurs complexes protéiques au sein du LINC soient à l'origine de la transmission des forces au noyau. Le rôle d'une protéine serait ainsi masqué par une autre qui prendrait le relais. Un moyen qui pourrait permettre d'identifier un rôle clé du complexe LINC serait d'inhiber plusieurs protéines en même temps comme l'ont fait Haque F., et al., avec SUN1 et SUN2 pour analyser leur rôle dans la localisation de l'emerine (Haque F., et al., 2009). En effet, SUN1 et SUN2 qui ont des rôles analogues peuvent peut-être se substituer l'un à l'autre lors des déformations cellulaires entre les micro-piliers.
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jusqu'au noyau. Cependant, il permet aussi par son lien aux lamines et à la chromatine de modifier l'expression génique (Wang N., et al., 2009). Le LINC est effectivement lié aux lamines et des modifications dans l'organisation de cette dernière située proche de la chromatine perturbent l'activité génique (Schirmer E.C.,
et al., 2007; Venkatesan Lyer K., et al., 2012; Shimi T., et al., 2008). Afin de
déterminer les éventuelles modifications dans l'expression génique causées par la déformation des cellules, nous avons décider d'effectuer des études comparatives des expressions des cellules déformées et non déformées.
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