Nature et déroulement du mécanisme de déformation des cellules:

III.7 Nature et déroulement du mécanisme de déformation des cellules:

Les mécanismes de déformation des cellules sur les micro-piliers ont donc été décrits comme dépendant de la nature, la quantité et l'organisation du cytosquelette. De plus, après blocage du cytosquelette les cellules restent rondes au dessus des micro-piliers. Ces observations révèlent que le mécanisme de déformation entre les piliers est actif. Afin de vérifier cette hypothèse nous avons décidé d'observer si les cellules SaOs-2 étaient à même de réaliser des déformations entre les piliers de façon antigravitationnelle. Pour cela, les cellules SaOs-2 ont été cultivées 24h sur des supports de culture plats fonctionnalisés poly-lysine sur lesquels les cellules adhèrent et s'étalent. Après ce temps d'incubation, un support microstructuré a été déposé sur les cellules de façon à ce que le haut des piliers touche en partie les cellules. Les cellules SaOs-2 ont été cultivées 24h supplémentaires puis fixées, marquées au DAPI et à la phalloïdine-FITC avant d'être observée par microscopie à épifluorescence.

Les résultats montrent que les cellules SaOs-2 se déforment entre les piliers indépendamment de l'emplacement des piliers dans l'environnement cellulaire. Ceci confirme le caractère actif de la déformation (FigIII.16). Par ailleurs, Pan Z., et al., ont montré que la déformation par ascension entre piliers était aussi réalisée par des cellules souches mésenchymateuses de rats (Pan Z., et al., 2012).

2 10µm

S -2 Actine ADN

F   : Déformation antigravitationnelle des cellules SaOs-2 entre les micro-piliers: Les cellules SaOs-2

ont été cultivées 24h sur un support plat, puis un substrat de PLLA microstructuré a été ajouté sur les cellules de façon que les piliers touchent les cellules. Après 24h de culture, les cellules ont été fixées, marquées au DAPI et à la phalloïdine-        !  !  " "  ##$ %" &   ' $ $&  (

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Ce modèle avec micro-piliers nous permet donc de caractériser des déformations cellulaires actives. Ces déformations ressemblent à des migrations dans des espaces confinés comme nous l'avons vu précédemment dans l'étude de l'implication de chaque constituant du cytosquelette. Différents types de migration existent et sont le fruit d'évènements clés permettant la progression des cellules dans leur environnement: la migration amiboïde, la migration mésenchymateuse et la migration collective. Les principaux évènements à la base des migrations sont la formation d'extensions membranaires, de filopodes ou pseudopodes, les rétractions aux extrémités cellulaires, les forces contractiles et la polarisation cellulaire (Lauffenburger D.A. et Horwitz A.F., 1996; Renkavitz J., et al., 2009; Kramer N., et

al., 2012). Des combinaisons de ces différentes manifestations physiques constituent

les différents mécanismes de migration. Il serait donc intéressant de comparer la migration entre les piliers aux modèles connus de migration. Deux types de migrations amiboïdes ont été caractérisées. La première est dite par formation de bulles ou bourgeonnements. La seconde fait appel à des filopodes ou lamellipodes. La migration amiboïde par bourgeonnement se déroule en trois étapes, initiation, expansion et rétractation. L'initiation correspond à la dissociation de l'actine corticale et de la membrane plasmique. Ce désappariement provoque un bourgeonnement qui s'agrandit sous la pression osmotique de la cellule (phase d'expansion). La troisième étape est la reconstruction du cortex d'actine qui associé à la myosine II entraine une contraction et l'affaissement du bourgeonnement. Ce type de migration est donc indépendant des points focaux et nécessite des réseaux d'actine et myosine (Charras G. et Paluch E., 2008; Gadea G., et al., 2008; Kramer N., et al., 2012; Yoshida K et Soldati T., 2006; Renkavitz J., et al., 2009). Cette migration par bourgeonnement a déjà été identifiée comme associée à des cancers (Fackler O.T. et Grosse R., 2008).

La seconde migration amiboïde présente des filopodes et lamellipodes (Renkavitz J.,

et al., 2009). Ces derniers sont propulsés par les filaments d'actine et nécessitent

des adhésions faibles (Yoshida K. et Soldati T., 2006; Kramer N., et al., 2012). La migration mésenchymateuse nécessite des adhésions focales fortes et des contractions cellulaires. Dans ce cas, la cellule apparait allongée car sa progression dépend de sa capacité à s'étirer (extensions membranaires), s'accrocher et se

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rétracter (Kramer N., et al., 2012; Gadea G., et al., 2008). Cette migration est décrite comme dépendante de l'actine et de la myosine (Zhong J., et al., 2010).

Les migrations collectives sont caractérisées par des liaisons intercellulaires fortes, des front de migrations constitués de plusieurs cellules synchronisées, des rétractations à l'arrière de la migration et des communications intercellulaires (Friedl P. et Wolf K., 2009). Ces types de migration nécessitent la myosine pour se dérouler normalement (Anon E., et al., 2012). Dans notre cas, nous avons utilisé une lignée de cellules cancéreuses d'origine mésenchymateuse (SaOs-2) et une lignée d'origine épithéliale (TC7). Logiquement, cette dernière devrait présenter une migration/déformation collective entre les piliers.

Effectivement les TC7 s'organisent tout d'abord sous forme de sphéroïdes. C'est uniquement après s'être bien liées entre elles que les cellules s'étalent en un feuillet et se déforment toutes en même temps. Cette déformation nécessite 48 à 72h (FigIII.17).

T03 4 TC7

T5

6789 99:; <: Déformation des cellules TC7 sur micro-piliers: Les cellules TC7 s'organisent tout d'abord sous

forme de sphéroïdes. Dans les 48 à 72h qui suivent, les cellules tout en restant fermement liées les unes aux autres s'étalent et se déforment simultanément.

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Les cellules TC7 semblent donc bien adopter une migration de type collective. En effet, les liaisons intercellulaires sont fortes et les cellules migrent toutes en même temps entre les piliers.

Comme attendu, les cellules SaOs-2 sont capables de se déformer de manière isolée. La déformation s'effectue en même temps que l'adhésion cellulaire.

La déformation des cellules SaOs-2 semble proche de la migration mésenchymale. En effet, les implications importantes des points focaux (FigIII.5) et des extensions membranaires dans la déformation entre piliers rappellent les caractéristiques de la migration mésenchymale. Toutefois comme Zhon J., et al., le décrivent, la migration mésenchymale est dépendante des forces contractiles procurées par des

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DE GH-2

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IJKL LLMN O: Déformation des cellules SaOs-2 sur micro-piliers: Les cellules SaOs-2 se déforment dans le même

temps qu'elles adhèrent à la surface. Leur déformation s'effectue entre 2 et 8h après qu'elles touchent la surface. Certaines cellules migrent légèrement avant de se déformer, d'autres se divisent. Toutefois la déformation reste rapide.

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interactions actine-myosine (Zhong J., et al., 2010). Comme nous l'avons observé précédemment la déformation entre les piliers est indépendante de la myosine. Le mécanisme de déformation des cellules SaOs-2 n'est donc pas une progression classique de type mésenchymale. D'ailleurs, la déformation des cellules SaOs-2 est pluri-étapes et semble faire appel à différentes techniques de progression au sein de l'environnement (FigIII.19A).

La première étape est la formation d'une extension riche en actine qui s'organise autour des piliers. La formation de points focaux en association avec le réseau d'actine doivent permettre de tracter la cellule au contact des piliers. Durant cette même étape il est courant d'observer un positionnement des centrosomes sur le haut des noyaux avec les microtubules distribués tout autour (FigIII.5). La seconde étape est caractérisée par la mise en place d'un cortex d'actine sous forme de fibres de stress sur le dessus de la cellule (FigIII.19B, C). Ces fibres permettent une poussée entre les piliers du corps cellulaire et du noyau. Après plusieurs heures, la cellule est complètement déformée entre les piliers. Les fibres de stress ont presque toutes disparues à la faveur de condensations d'actine très importantes autour des piliers (FigIII.19D). Cette organisation du cytosquelette permet de garder une tension horizontale parallèle au support qui maintient les cellules déformées entre les piliers. Cette conformation facilite aussi les migrations horizontales des cellules entre les piliers (FigIII.19E). Par ailleurs, l'observation des filaments intermédiaires dans des cellules déformées montre que ces derniers restent organisés autour du noyau (FigIII.5).

Il apparait donc que la déformation des cellules entre les piliers n'est pas directement comparable aux modèles connus de migration cellulaire. Des études ont décrit aussi la migration de noyaux à travers un espace confiné nécessitant leurs déformations. Friedl P., et al., montrent que la migration d'un noyau dans un espace confiné se déroule en quatre étapes. La première est la résistance du noyau, la seconde est l'affaissement local d'une partie de la membrane nucléaire permettant l'insertion d'une première petite partie du noyau. La troisième étape consiste en la compression et au glissement du noyau à travers l'orifice et enfin la libération du noyau par une poussée à l'arrière. Cette migration associée à une déformation est décrite comme s'effectuant par à-coups (Friedl P., et al., 2011).

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XYZ[ [[\] ^: Etapes de déformation des cellules SaOs-2: Sur la partie gauche de la figure, les cellules SaOs-2

ont été transfectées Histone_GFP et Actine-RFP avant d'être observées 12h sur micro-p `a `bc d pe c

microscopie confocale. La partie droite schématise et résume toutes les observations de déformation de cellules saOs_2 sur micro-p `a` bcdf g ae hi `d ae jk l e m `n o b me`d e od d` ab d icqe l`de r `ild j bd j`hhscbl r b d

parties du cytosquelette. Cette déformation s'effectue en 4sr epbdp c`lé`pea bduv b dé baao a bdecc`w bl rr io r

d'abord à la surface (A). Puis les cellules se polarisent par formation d'une extension membranaire riche en actine semblable à un lamellipode pour attraper un ou plusieurs piliers (B). Cette étape est suiviepe c

l'organisation de l'actine en filaments de stress au dessus du noyau ou x y z {| yx } ~€u b d j bcl` bcd

permettent d'exercer une poussée du haut vers le bas de la cellule. La cellule et son noyau sont alors déformés entre les piliers. L'actine s'organise autour des piliers et n'est presque plus visible sur le haut des cellules (D). C'est alors une tension horizontale parallèle au support qui permet le maintien des cellules entre les piliers et leur migration (E).

 B C D

Actine

Microtubules

Noyaux

Filaments intermédiaires

Histone-GFP

Actine -RFP

-2

œ ž

Dans le cas des déformations nucléaires des cellules entre les piliers, les noyaux ne semblent pas opposer de résistance. Leurs passages entre les piliers paraissent plus fluides que pour la migration à travers un pore. Toutefois dans le but de comprendre si la migration entre les micro-piliers pourrait être comparées à celle qui se déroule à travers des membranes poreuses, nous avons décidé de comparer notre modèle à celui des chambres de Boyden ou modèles de transmigration (Kramer N., et al., 2013).

III.8 Comparaison de la déformation entre micro-piliers aux chambres de