III. Résultats et Discussion:
III.8 Comparaison de la déformation entre micro-piliers aux chambres de Boyden:
III.8.2 Comparaison des capacités à transmigrer des cellules SaOs-2, MG-63, OHS-4 et TC7:
Les cellules SaOs-2 et TC7 ont été dans un premier temps observées en dynamique puis la capacité de transmigration des cellules SaOs-2, MG-63, OHS-4 et TC7 ont été quantifiées par analyse de cellules fixées.
Z[\ SaOs-2 Actine ADN ]^_ ^`b d Corps cellulaire efg fhij
klmn nnoq q: Comparaison en dynamique du comportement des cellules SaOsrq st uvw xy z chambres de Boyden: {|} ~ | } | |
fonctionnalisées sur la partie inférieure et avec du chimioattractant ont été utilisées. Les cellules SaOs-
ont été transfectées avec de l'actine | |
l'histone | } ~| |} |} {
Ces dernières ont été ensuite ensemencées et cultivées 6h sur les membranes poreuses. Les observations ont été réalisées par microscopie confocale et montrent que les cellules SaOs
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6h alors que les cellules TC7 restent sur la face supérieure. Les flèches blanches montrent des extensions membranaires des cellules TC7 qui tentent d'explorer le | | | ||}|
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Les résultats montrent que les cellules TC7 ne sont pas capables de traverser la membrane poreuse en 6h. Les cellules tentent d'émettre sans succès des extensions membranaires dans les pores comme le montre la FigIII.22 alors que les cellules SaOs-2, comme confirmé ici, traversent en moins de 6h la membrane poreuse. Toutefois, il est possible que les cellules TC7 nécessitent davantage de temps pour transmigrer tout comme elles ont besoin de 48h sur micro-piliers pour se déformer. Les chambres de Boyden ont alors été préparées de la même manière avec de la fibronectine sur la face inférieure et avec ajout de chimioattractant. Les cellules SaOs-2, MG-63 et OHS-4 ont été ensemencées et cultivées 6h alors que les cellules
¢ £¤¥¦ §¨ ©ª«ª¦¥ TC7 OHS-4 SaOs-2 MG-63 ¬ ®¯ °± ²³ ° ´ ®µ ¶·µ· ¸ ¹¸ 40 60 º»¼½±¾ ¿À Á ½Â¾ Áÿ Ä-2 6h Å Æ°¾ Actine ADN Ç ÈÉ ÈÊ ËÌ ÍÎ Ï ÐÑÒÓ Ô Õ ÖÒ×ÒÑÒØØÏØÒ Ù ayant transmigré p=0,029 ÚÛ¬¶µ
ÜÝÞß ßßàá â: Comparaison des capacités à transmigrer des cellules SaOs-2, MG-63, OHS-4 et TC7 à travers de chambres de Boyden fonctionnalisées à la fibronectine sur la face inférieure et avec du chimioattractant :
LãäåãææçæãäèaOs-2, MG-63 et OHS-éê ë ìí ìíåç æ ìîïíã äðñã ìæãäåãææçæãäò óôé õñäç öæã ä÷ã ÷øö ù ëãäúêö ãç äãä
avant d'être fixées. Les cellules ont été ensuite marquées au DAPI et à la phalloïdineû òüýò ó ùïù ë ìþ ÿ Tìöã
observées par microscopie confocale. Les pourcentages de åãææçæ ã äù c ù ë ì÷ î ö íìö ùïãö äæã äúêöã äê ë ìí ìí
calculés pour chaque condition sur 10 à 15 champs pris au hasard et contenant 20 à 100 cellules. Les résultats sont rapportés qualitativement sur les clichés et quantitativement dans l'histogramme ciûþ ã ääç ä. Une approche statistique par test ANOVA a permis d'évaluer la significativité des résultats obtenus.
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TC7 ont été cultivées 48h sur les chambres de Boyden afin d'observer si un temps plus long leur permettait de transmigrer. La culture des cellules a été stoppée par fixation dans du paraformaldéhyde. Les cellules ont alors été marquées avec du DAPI et de la phalloïdine-TRITC puis imagées par microscopie confocale afin d'évaluer les quantités de cellule de part et d'autre des membranes.
Les résultats montrent que seules les cellules TC7 ne traversent pas la membrane poreuse. Même après 48h de culture les cellules restent dans le compartiment supérieur (FigIII.23). Leur impossibilité à migrer dans les pores est très certainement liée à leur comportement collectif. Les liaisons intercellulaires étant très fortes, elles empêcheraient les cellules de se détacher pour rejoindre le compartiment inférieur. En effet, Vedula S.R.K., et al., ont expliqué l'importance des liaisons intercellulaires dans les migrations des cellules avec un comportement collectif (Vedula S.R.K., et
al., 2012). En revanche les cellules OHS-4, SaOs-2 et MG-63 traversent dans
différentes proportions les membranes poreuses en moins de 6h (FigIII.23). Il apparait que les cellules OHS-4 et SaOs-2 transmigrent sensiblement dans les mêmes proportions (environ 40%) alors que les cellules MG-63 traversent les pores dans des proportions significativement plus importantes (environ 60%). Des études de capacité de transmigration avaient déjà été réalisées pour comparer les cellules MG-63 et SaOs-2 et les auteurs avaient trouvé exactement les mêmes taux de transmigration (Wang F.S., et al., 2011). Ces résultats permettent de conclure que les comportements cellulaires sur micro-piliers et membranes poreuses sont différents. En effet, sur les micro-piliers, les cellules SaOs-2 étaient les plus à même de se déformer comparées aux cellules OHS-4 et MG-63. Par contre, sur les membranes poreuses les cellules MG-63 transmigrent significativement de façon plus importante que les cellules SaOs-2. De plus, les cellules TC7 qui étaient à même de se déformer sur les micro-piliers, ne sont pas du tout capables de traverser les membranes poreuses des chambres de Boyden.
Nous avons vu précédemment que la déformation entre les piliers était pluri-étapes avec principalement au départ, la formation d'un lamellipode suivi d'une poussée de l'actine vers le bas. Ensuite, avec la participation des filaments intermédiaires et selon les cas des microtubules, l'actine adapte sa pression pour déformer le noyau entre les piliers.
Dans les cas des migrations à travers les pores, nous avons visualisé tout d'abord l'évolution en dynamique d'extensions membranaires jusqu'à la face inférieure. Ces observations ont aussi été réalisées par Schoumacher M., et al. sur des cellules fixées en cours de transmigration (Schoumacher M., et al., 2011). Ces extensions membranaires riches en actine permettraient aux cellules de construire suffisamment de points focaux sur la face inférieure pour tracter la cellule à travers le pore. Toutefois, nous avons vu que le noyau peut être un obstacle rigide à la transmigration. C'est pourquoi les cellules condensent un amas d'actine à l'arrière du noyau afin de créer une poussée rendant possible la migration du noyau à travers le pore. Le même type d'observation de condensation d'actine à l'arrière du noyau pour permettre son avancée a déjà été décrit. En effet, lors de la migration de cellules dans des microtubes, ces dernières adoptent aussi le positionnement de l'actine à l'arrière du noyau (Tong Z., et al., 2012; Rolli C.G., et al., 2010). Toutefois, malgré cet amas d'actine nous avons observé que le passage du noyau à travers le pore reste la phase critique de la transmigration. Le noyau apparait rigide et sa traversée est pluri-étapes comme nous l'avons observé dans la FigIII.20.E. Ce mécanisme rappelle celui décrit par Friedl P. et al., où le noyau franchissait un pore en plusieurs étapes et dont la traversée se déroulait par à-coups (Friedl P., et al., 2011).
La chambre de Boyden est couramment utilisée dans le but de comparer et d'évaluer des capacités d'invasion cellulaire (Brandt B., et al., 2005; Kramer N., et al., 2013; Goodwin A.M., 2007; Valster A., et al., 2005). Ceci signifie que dans notre cas les cellules TC7 seraient identifiées comme incapables de migrer à travers une membrane basale, et les cellules MG-63 seraient identifiées comme plus agressives que les cellules SaOs-2 et OHS-4. Toutefois comme le précisent Zhong J., et al., les cellules cancéreuses peuvent adopter des modes de migration très différents (Zhong J., et al., 2010). D'autres tests ont déjà été développés afin de mieux caractériser les cellules cancéreuses mais aucun n'est comparable à la déformation des cellules entre les micro-piliers (Kramer N., et al., 2013; Goodwin A.M., 2007; Valster A., et al., 2005).
Le modèle de déformation des cellules entre micro-piliers constitue donc un nouvel outil. Ce dernier ne permet pas d'identifier la capacité de cellules à s'échapper de tumeurs primaires tout comme le test de transmigration. Toutefois, comme nous l'avons déjà décrit, seules les cellules cancéreuses se déforment entre les micro-piliers. Ces derniers pourraient donc constituer un nouvel outil d'analyse et de
caractérisation de cellules cancéreuses et en particulier pour les cellules cancéreuses ayant un comportement collectif. En effet, comme nous l'avons vu, les cellules TC7 se déforment entre les piliers et sont donc identifiables comme cancéreuses alors qu'elles ne transmigrent pas à travers les membranes poreuses. Par ailleurs, ce matériel micro-structuré permettrait d'identifier un comportement cancéreux. En effet, les cellules cancéreuses subissent de très nombreuses et très différentes mutations convergentes vers un comportement presque unique. Ce comportement acquis au cours des différentes mutations leur confèrent des propriétés comme l'immortalité, des capacités accrues à proliférer, la perte d'inhibition de contact et bien d'autres encore (Boehm J.S. et Hahn W.C., 2004; Münger K., et al., 2004; Sherwood A.L., et al., 2008). Apparemment, ce comportement cancéreux permettrait aussi aux cellules de se déformer et de déformer leurs noyaux de façon importante sans modification de leur viabilité. Grâce aux micro-piliers, l'identification des cellules cancéreuses serait possible à des stades encore précoces de la cancérisation, c'est à dire bien avant que les cellules atteignent le stade ultime de la métastase qui est actuellement considéré comme fatal (Zijl F., et al., 2011). Ce dernier point est sans doute le plus intéressant dans l'utilisation de substrats constitués de micro-piliers pour la caractérisation de cellules cancéreuses.