IV. Conclusions et perspectives:
La caractérisation de la sensibilité des cellules eucaryotes à leur environnement est un enjeu important. En effet, le comportement et le devenir d'une cellule dépend en grande partie des paramètres physicochimiques de son milieu. Il a déjà été montré que ces paramètres peuvent conditionner l'adhésion, l'étalement, la migration et la différenciation cellulaire. L'assimilation des facteurs externes par la cellule requière les étapes de reconnaissance et de transduction du signal. Suite à ces étapes, la cellule est capable de répondre et de s'adapter spécifiquement à son environnement. L'identification par la cellule de paramètres physiques de son entourage est nommée mécanotransduction. Dans ce cas, la cellule convertit des paramètres physiques extracellulaires en signaux chimiques intracellulaires. L'étude et la compréhension de la mécanotransduction nécessite un contrôle précis des chimie, rigidité et topographie de l'environnement cellulaire. Pour cela, des collaborations interdisciplinaires (Physique, Chimie, Biologie) sont essentielles afin de créer des surfaces ou matériaux bien définis. Le développement de tels substrats avec des propriétés physicochimiques très contrôlées peut entre autres, faciliter la caractérisation cellulaire.
Ainsi, nous avons montré dans un premier temps l'intérêt de surfaces activables par étirement pour l'étude de la mécanotransduction cellulaire. En effet, des supports fonctionnalisés avec du PEG et du RGD ont été fabriqués. Leur particularité est que les peptides RGD ne sont visibles que sous étirement du substrat. A l'état relâché, l'encombrement stérique du PEG masque les RGD. Ainsi, la culture de cellules sur un substrat non étiré ne permet pas aux cellules d'adhérer, ces dernières restent arrondies même après 24h de culture. Sur un substrat étiré à 60%, nous avons montré que les cellules sont capables d'adhérer sur les peptides RGD apparents. Dans ce cas, les cellules adoptent une morphologie étalée. Le relâchement du substrat provoque le décrochement des cellules sans les endommager. En effet, un simple étirement permet aux cellules d'adhérer à nouveau. Enfin, nous avons montré que l'adhésion et le décrochement des cellules sont totalement réversibles et peuvent être répétés plusieurs fois.
A l'avenir, ce support activable par étirement pourrait être utilisé comme outil pour étudier la dynamique de formation et de décrochement des points focaux. En effet, un étirement lent du substrat permettrait d'observer chaque étape de la formation
d'un point focal. De même, un relâchement progressif permettrait de comprendre la dynamique de détachement du point focal. Par ailleurs, cet outil est idéal pour étudier la transduction du signal après formation du point focal. En effet, il est possible de contrôler l'adhésion simultanée de plusieurs cellules et donc d'observer les signaux intracellulaires découlant de la formation des points focaux. Ce support étirable permettrait aussi de contrôler la quantité et la surface des points d'adhésion pour les cellules. Nous avons effectivement montré que la disponibilité des points d'ancrage à la surface est proportionnelle à l'étirement du substrat.
Dans un second temps, nous avons décrit la capacité de cellules cancéreuses à se déformer sur des surfaces micro-structurées sous forme de piliers. Nous avons montré que ces déformations dépendent davantage des propriétés intrinsèques des cellules que de la chimie et de la rigidité du substrat. Ces dernières observations ont permis d'identifier un comportement cancéreux. En effet, seules les cellules cancéreuses restent déformées même après plusieurs jours de culture alors que des cellules souches ou saines remontent au dessus des piliers.
De plus, la quantification de la déformation des cellules cancéreuses au cours du temps permet de les discriminer les unes des autres. En effet, les cellules cancéreuses ne se déforment pas toutes dans les mêmes proportions et n'ont pas toutes des cinétiques de déformation identiques. La déformation cellulaire sur micro-piliers pourrait donc être un nouveau paramètre caractérisant chaque type de cellule cancéreuse.
Par ailleurs, les acteurs de la déformation cellulaire entre les micro-piliers ont pu être identifiés. En effet, nous avons pu montrer l'importance des filaments intermédiaires et de l'actine dans les cellules SaOs-2 qui ont un comportement autonome. Par contre, les cellules TC7 qui présentent un comportement collectif nécessitent les microtubules en plus de l'actine et des filaments intermédiaires pour se déformer. De plus, nous avons montré que la déformation des noyaux cellulaires perturbe l'organisation continue et périphérique à l'enveloppe nucléaire de la lamine A. Nous avons observé que la myosine II, connue pour interagir avec l'actine, facilite la déformation cellulaire. En effet, son absence freine le mécanisme de déformation entre les piliers. Toutefois, la myosine II n'est pas indispensable aux mécanismes de déformation des cellules entre les micro-piliers. Nous avons aussi dévoilé un rôle mineur des protéines du complexe LINC dans la déformation nucléaire. L'inhibition
des protéines SUN1, SUN2 et Nesprine2 freine la déformation des cellules entre les piliers. Toutefois, après 24h, les cellules dépourvues de ces constituants du complexe LINC se déforment dans les mêmes proportions que les cellules témoin. Enfin, nous avons montré que la déformation nucléaire n'est pas conditionnée par une expression génique particulière.
En parallèle, nous avons comparé les dynamiques de déformation des cellules cancéreuses (SaOs-2, MG-63, OHS-4, TC7) à travers des chambres de Boyden à la déformation entre les micro-piliers. Nous avons pu montrer que le lien entre déformation dans le but de transmigrer et déformation entre les piliers n'est pas direct. En effet, les cellules SaOs-2 transmigrent proportionnellement moins que les cellules MG-63 à travers les membranes poreuses. Pourtant les cellules SaOs-2 se déforment plus entre les micro-piliers que les cellules MG-63. De plus, les cellules TC7 qui se déforment entre les piliers sont incapables de traverser les membranes poreuses. Ces observations peuvent s'expliquer par l'emploi de mécanismes différents par les cellules pour se déformer entre les piliers et pour transmigrer. En effet, dans le cas des piliers, les adhésions focales sont utilisées mais elles sont moins primordiales que dans la transmigration. La déformation est majoritairement effectuée par une poussée vers le bas. Dans le cas de la transmigration, les cellules adhèrent fortement à la face inférieure et tire le reste du corps cellulaire pour lui faire franchir le pore. De plus, durant la transmigration le noyau apparait comme un obstacle, les cellules franchissent le pore par à-coups. La déformation entre les micro-piliers quant à elle, parait plus fluide, le noyau ne semble pas bloquer la dynamique de descente entre les piliers.
La considération de tous ces résultats mène à la description de nouveaux mécanismes de déformation cellulaire, différents de ceux empruntés par les cellules pour traverser les chambres de Boyden. De plus, le rôle mineur de la myosine II et l'importance des filaments intermédiaires sont des paramètres jusqu'à présent peu ou pas décrits dans la mécanique cellulaire.
Les supports sous forme de micro-piliers nous ont aussi permis d'observer des divisions cellulaires atypiques. En effet, la division des cellules SaOs-2 et TC7 entre les piliers présente dans un premier temps des disques métaphasiques verticaux entre les piliers. Puis, la ségrégation des chromosomes sous la contrainte topographique semble s'effectuer de façon non parallèle. En effet, au lieu de ségréger sur un seul plan, les chromosomes en cours de migration à chaque pôle
cellulaire adoptent des formes de ponts ou de parapluies. Cependant la ségrégation sur piliers semble s'effectuer normalement car nous n'observons ni davantage de cellules en apoptose ni un nombre plus important de cellules comportant des micronoyaux quand nous les comparons à des cellules cultivées sur des supports plats.
Pour aller plus loin dans la compréhension de la déformation cellulaire entre les micro-piliers, il serait intéressant de tester d'autres cellules et en particulier des cellules à différentes étapes de la cancérisation. Nous avons décrit un comportement cancéreux basé sur la capacité des cellules à rester déformées entre les piliers. Toutefois, il serait intéressant d'expliquer à partir de quel moment une cellule en cours de cancérisation ne perçoit plus la déformation nucléaire comme un stress. La surface de PLLA couverte de micro-piliers permettrait ainsi d'identifier une étape clé de la cancérisation, une étape décisive dans l'acquisition du comportement cancéreux.
La compréhension de la déformation nécessite la quantification de ce phénomène. Jusqu'à présent, la déformation a été essentiellement basée sur les volumes des noyaux au dessus et entre les piliers. Pour définir plus précisément la déformation, il serait avantageux de définir d'autres paramètres. Ces nouvelles approches de quantification de la déformation pourraient être basées sur des quantités ou organisations du cytosquelette. Mais aussi sur la caractérisation des formes plus ou moins angulaires des noyaux.
Une meilleure définition des rôles de chaque composant du cytosquelette pourrait être envisagée. En effet, l'observation en dynamique de chaque composant du cytosquelette des cellules serait un bon moyen de caractériser les forces intrinsèques cellulaires permettant la déformation.
Par ailleurs, nous avons vu que l'inhibition de l'actine et des filaments intermédiaires dans les cellules SaOs-2 empêche leur déformation entre les piliers et que l'inhibition des microtubules n'a pas d'effet. Toutefois, ces observations ont été effectuées après un temps donné et nous pourrions passer à côté d'une information. En effet, nous avons vu que dans le cas de l'inhibition des composants du complexe LINC et de la myosine II, leur rôle n'est identifié que par observation des cellules en dynamique. Il serait donc intéressant d'observer en dynamique des cellules SaOs-2 dont les
microtubules sont inhibés afin d'identifier un éventuel ralentissement de la déformation.
Nous n'avons identifié qu'un rôle mineur du complexe LINC dans la déformation nucléaire. Toutefois les protéines de ce complexe n'ont été bloquées qu'une à une. Il serait donc intéressant de bloquer simultanément plusieurs protéines du complexe LINC afin d'identifier un éventuel rôle plus important.
Les cellules cancéreuses déformées entre les piliers sont capable de migrer. Il serait intéressant de quantifier cette migration. En effet, toutes les cellules ne migrent pas entre les piliers, seules certaines d'entre elles le font. L'étude de ces migrations pourrait permettre d'identifier des sous-populations cellulaires. Il est actuellement très difficile d'identifier des cellules souches cancéreuses. Peut-être que l'analyse des migrations aiderait cette identification.
Une perspective importante serait de quantifier le volume des noyaux de cellules déformées et non déformées. En effet, la modification du volume nucléaire serait un stress important pour les cellules qui pourrait expliquer la remontée des cellules non-cancéreuses.
En effet, nous avons observé que les cellules non-cancéreuses remontent au dessus des piliers. Ces remontées adviennent après une déformation précoce des cellules. Il serait possible de comprendre quels mécano-senseurs (taline, zyxine?) permettent d'identifier ces déformations. Pour cela il suffirait de bloquer ces protéines et d'observer si les cellules remontent toujours.
L'expression génique ne semble pas beaucoup modifiée dans les cellules déformées et non déformées. Ces observations ont été effectuées une fois les cellules bien déformées entre les piliers. Il serait intéressant de caractériser l'expression génique à d'autres temps, et plus précisément lors de la descente des cellules entre les piliers. Toutefois, comme l'expression génique ne semble pas beaucoup affectée, il serait intéressant d'évaluer l'importance des phosphorylations sur différentes protéines. En effet, de nombreux processus liés à la mécanique cellulaire dépendent des phosphorylations.
La division cellulaire sur les micro-piliers reste peu décrite. Nous avons pu observer des mitoses atypiques avec des ségrégations chromosomiques non parallèles, mais nous n'avons pas identifié comment celles-ci se déroulent exactement. Il serait très intéressant de caractériser plus amplement ces divisions (dynamique, ségrégation, redéformation des noyaux, reformation de l'enveloppe nucléaire).
Nous avons montré que la déformation des cellules cancéreuses entre les piliers est différente de la déformation à travers une membrane poreuse. Nous avons pu caractériser la déformation entre les piliers et en particulier en définir les acteurs. Une autre perspective serait donc de comparer encore plus précisément ces deux types de déformation en bloquant chaque composant du cytosquelette et en observant si les cellules sont toujours capables de franchir les membranes poreuses. Enfin, les surfaces micro-structurées sous forme de piliers peuvent être utilisées comme outil. Il s'avère que l'utilisation de ces surfaces permet de caractériser des propriétés cellulaires et de décrire de nouveaux mécanismes de migration, déformation et division cellulaire. Ces surfaces pourraient donc être utilisées en complémentarité d'autres outils tels que les chambres de Boyden afin de mieux définir certaines propriétés cellulaires. Ainsi la chambre de Boyden (transmigration
assay) est utilisée pour tester du chimiotactisme et de l'agressivité cellulaire. Les
substrats avec micro-piliers quant à eux pourraient être utilisés pour décrire de nombreuses caractéristiques cellulaires (deformation assay?). Nous avons vu que la simple culture de cellules sur ces micro-piliers permet de décrire un comportement cancéreux matérialisé par une déformation prononcée des cellules entre les piliers. Ces déformations entre les piliers sont aussi vraies pour des cellules cancéreuses ayant un comportement collectif (TC7). Ceci est nouveau, en effet des cellules à comportement collectif ne se déforment pas, notamment lors de leur culture sur membrane poreuse (chambre de Boyden). L'utilisation des substrats avec micro-piliers permet de déformer le noyau cellulaire sans stress particulier. En effet, les cellules se déforment de façon autonome entre les piliers, elles ne sont pas contrainte de le faire. C'est donc un outil simple qui permet entre autre de visualiser l'effet de la déformation nucléaire sur l'expression génique ou la mort cellulaire. Par ailleurs, les substrats micro-structurés sous forme de micro-piliers permettent la culture d'un grand nombre de cellules déformées favorisant aussi des approches de biologie moléculaire. Plus explicitement, un nombre important de cellules ayant leurs noyaux déformés peuvent être récupérées pour effectuer des PCR ou tout autre test nécessitant un grand nombre de cellule. Enfin, nous avons montré que ce substrat peut aussi être utilisé dans le but de mieux comprendre la mécanique de division cellulaire et plus précisément une ségrégation chromosomique non parallèle.
Le travail présenté dans cette thèse illustre l'importance des collaborations interdisciplinaires. En effet, ces collaborations permettent d'aborder des sujets communs mais de répondre à des questions par différentes approches. Ces approches peuvent permettre la création de nouveaux outils ou de nouvelles méthodes de caractérisation. Dans notre cas, ces collaborations nous ont permis de caractériser différentes lignées cancéreuses et en particulier leur capacité à se déformer grâce à l'utilisation d'une nouvelle approche expérimentale.
Abréviations:
2D / 3D: 2 Dimensions / 3 Dimensions ADN: Acide Desoxyribo Nucléique ARN: Acide RiboNucléique
CFDA,SE: Carboxy Fluorescéine
Diacétate Succinimidyl Ester
DAPI: 4',6-Diamidino-2-Phenylindole,
Dihydrochloride
ESEM: Environmental Scanning
Electronic Microscopy
FAK: Focal Adhesion Kinase
GFAP: Glial Fibrillary Acidic Protein GFP: Green Fluorescent Protein HMDS: HexaMethylDiSilazane hMSC: Cellule souche
mésenchymateuse humaine
HNF: Hepatocyte Nuclear Factor IGBMC: Institut de Génétique et de
Biologie Moléculaire et Cellulaire
KASH: Klarsicht ANC-1 and SYNE-1
Homology
LINC: Linker of Nucleoskeleton and
Cytoskeleton
MEB: Microscopie Electronique à
Balayage
MTOC: MicroTubule-Organizing
Center
PCR: Polymerase Chain Reaction PDMS: PolyDyMéthylSiloxane PLGA: Poly(Lactic-co-Glycolic Acid) PLLA: Poly-L-Lactide Acid
PML: Promyelotic Leukemia PPC: Particules Par Cellules qRTPCR: quantitative Real Time
Polymerase Chain Reaction
RFP: Red Fluorescent Protein
SEM: Scanning Electronic Microscopy siRNA: small interfering RiboNucleic
Acid
SVF: Sérum de Veau Fœtal TBP: TATA Binding Protein VASP: VAsodilator Stimulated
¡
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