Mise en place des expériences d'inhibition par les drogues:

Les cellules SaOs-2 et TC7 ont été traitées avec les différentes drogues décrites dans le tableau II.1 avant ou après déformation cellulaire et ont été observées en conditions fixées et vivantes.

II.5.3.1. Analyse de l'effet des drogues dirigées contre le cytosquelette ajoutées après déformation cellulaire sur cellules fixées:

Cinquante mille cellules SaOs-2/cm² ont été ensemencées sur des substrats de PLLA micro-structurés sous forme de piliers carrés de 7µm, espacés de 7µm et hauts de 5 à 6µm. Après 8h, certaines drogues décrites précédemment ont été ajoutées à deux doses différentes (faibles et fortes) sur les cellules et après 16h supplémentaires, les cellules ont été fixées et immunomarquées pour observer l'actine, les microtubules et les noyaux avec un microscope à épifluorescence (figII.7). Les cellules SaOs-2 traitées avec les drogues ne présentent aucun changement de comportement comparées aux témoins sans drogues. Tous les corps cellulaires et les noyaux observés sont nettement déformés entre les piliers. Ceci nous montre que les cellules une fois déformées ne se "dé-déforment" pas, c'est à dire ne remontent pas au dessus des piliers. La mise en place de l'expérience n'a donc pas permis d'identifier une partie du cytosquelette impliquée plus qu'une autre dans ces déformations. C'est pourquoi une nouvelle approche a été envisagée avec ajout des drogues avant déformation cellulaire.

3 6

II.5.3.2. Analyse de l'effet des drogues dirigées contre le cytosquelette ajoutées avant déformation cellulaire sur cellules fixées:

Les cellules SaOs-2 ont été ensemencées dans les mêmes conditions que précédemment à la différence que les drogues ont été ajoutées en même temps que les cellules sur les micro-piliers. Les cellules avec les drogues bloquant chaque partie du cytosquelette ont été incubées 4, 6, 8, 12 et 24h avant d'être fixées et immunomarquées comme décrit dans le paragraphe précédent et observées par microscopie à épifluorescence. Ici seuls les résultats à 24h sont présentés car sur les temps précédents, trop de conditions n'étaient pas analysables à cause de la faible quantité de cellules à la surface. Les cellules SaOs-2, malgré une quantité de cellules ensemencée identique à celle effectuée lors de l'ajout des drogues après déformation sont beaucoup moins nombreuses sur les surfaces de micro-piliers même à 24h (figII.8). Sachant que les drogues utilisées ne sont pas cytotoxiques comme montré précédemment (figII.6), ceci signifie que les cellules sont perdues F789 9:;: Analyse par microscopie à épifluorescence des cellules traitées avec différentes drogues dirigées contre le cytosquelette après déformation.

ADN

Actine

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autrement que par mort cellulaire et très certainement durant l'immunomarquage. Les cellules ne pouvant plus se déformer et n'adhérant pas suffisamment à la surface ont été sans doute retirées de la surface à cause des lavages effectués au cours de l'immunomarquage. De plus les quelques cellules qui restent à la surface apparaissent moins déformées que dans l'expérience avec traitement après déformation des cellules. En effet, elles paraissent plus arrondis, bien qu'elles soient toujours identifiables comme déformées.

La conclusion de cette expérience pourrait être à nouveau que les drogues dirigées contre le cytosquelette n'ont pas d'effet sur la déformation cellulaire. Cependant, comme la majeure partie des cellules semble perdue pendant l'immunomarquage, des expériences de cellules traitées avec drogues et observées en vivant ont été mises en place. =>?@DEGHEJ ?K @GHM l’ensemencement cellulaire ADN Actine Microtubules

OQRS SUV: Analyse par microscopie à épifluorescence à 24h de culture des cellules SaOsW X YZ[Q Y\ ] ^ [_] ` différentes drogues dirigées contre le cytosquelette avant déformation.

a b

cdef fgh: Suivi en dynamique pendant 24h de la capacité des cellules SaOs-2 à se déformer sur des microipiliers en présence ou non de drogues dirigées contre le cytosquelette.

j k

II.5.3.3. Suivi en temps réel de l'effet des drogues dirigées contre le cytosquelette sur la déformation cellulaire:

Les cellules SaOs-2 cultivées dans des flacons de cultures ont été dans un premier temps marquées au Hoechst (2µM) puis décrochées de la surface et resuspendues dans du milieu incomplet pour être marquées au CFDA,SE (5µM). Cinquante mille cellules par cm² ont été ensemencées sur les micro-piliers et instantanément traitées avec les drogues décrites dans le tableau II.1. L'analyse du comportement des cellules a été réalisé en dynamique avec une acquisition toutes les 30min pendant 24h sous microscope confocal équipé d'une chambre thermostatée à 37°C avec une atmosphère à 5% de CO2 et saturée en eau.

Les résultats montrent que les cellules non traitées avec des drogues se déforment en moins de 8h entre les piliers (figII.9). Les acquisitions par microscopie confocale montrent aussi que les cellules traitées avec la latrunculine A et la cytochalasine D qui bloquent l'actine ne se déforment plus sur les piliers. L'utilisation de la colchicine et du nocodazole qui perturbent le réseau de microtubules bloquent aussi la déformation des cellules SaOs-2. Et enfin, les inhibiteurs des filaments intermédiaires (acrylamide et IDPN) bloquent aussi le mécanisme de déformation. A ce stade, la conclusion est que la déformation des cellules SaOs-2 sur micro-piliers est active et qu'elle nécessite tous les éléments connus du cytosquelette, c'est à dire que la conclusion est l'inverse des résultats obtenus sur les cellules obervées en condition fixées.

Toutefois une observation inattendue a bousculé ces résultats. En effet, les cellules SaOs-2 traitées au nocodazole et observées 24h sous confocal restent rondes au dessus des piliers et ne présentent aucune déformation. Cependant, les mêmes cellules dans les mêmes conditions mais dans un autre champ que celui dans lequel l'acquisition au confocal a été effectuée sont toutes déformées.

Il apparait très nettement qu'une synergie négative existe entre les effets des lasers du microscope confocal, les marquages cellulaires et le traitement au nocodazole. En effet, les cellules observées pendant 24h et non traitées se déforment (comme montré précédemment (figII.9) et les cellules traitées au nocodazole et non observées pendant 24h se déforment aussi (figII.10). Le blocage de la déformation cellulaire qui n'est apparemment pas de l'apoptose (pas de condensation de l'actine

l m

ni de fractionnement cellulaire) est donc le résultat de l'illumination par les lasers et associé au traitement au nocodazole.

Ces résultats mènent donc à la conclusion que l'observation de la dynamique des cellules sur les micro-piliers modifie le comportement cellulaire en présence d'inhibiteurs du cytosquelette. C'est pourquoi une nouvelle approche permettant

l'appréciation de l'effet des drogues bloquant chaque partie du cytosquelette a été mise en place. En effet, les cellules ont été traitées avec les drogues et observées en vivant seulement après 24h d'incubation.

II.5.3.4. Observation de l'effet de drogues dirigées contre le cytosquelette sur la déformation de cellules cultivées sur des micro-piliers:

Les cellules SaOs-2 et TC7 ont été marquées au Hoechst et CFDA,SE, traitées ou non avec les différentes drogues bloquant chaque partie du cytosquelette et observées après 24h pour SaOs-2 et 48h pour TC7 par microscopie confocale. Les cellules SaOs-2 ont été aussi transfectées avec de l'actine-GFP, de la tubuline-RFP et marquées au Hoechst avant d'être traitées ou non avec les inhibiteurs du

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avec le microscope confocal

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images après 24h

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nocodazole Hoechst CFDA,SE

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–—˜™ ™š›œ: Cellules SaOs-2 marquées au Hoechst et CFDA,SE traitées au nocodazole et observées pendant 24h (A) et après 24h (B) de culture sur mi ž Ÿ-piliers.

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cytosquelette et observées après 24h de culture sur les substrats micro-structurés. Dans ces conditions les résultats observés reflètent réellement l'effet des drogues sur la déformation et sont présentés dans la partie résultat (III.4.2).

II.5.4. Inhibition de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire par les