Mise au point des conditions de transmigration avec les cellules SaOs-2:

mêmes types cellulaires que ceux observés sur micro-piliers ont été cultivés sur chambres de Boyden.

Les expériences ont été réalisées en deux parties, une première de mise au point sur les cellules SaOs-2 et une seconde de comparaison des capacités de transmigration des cellules SaOS-2, MG-63, OHS-4 et TC7.

III.8.1 Mise au point des conditions de transmigration avec les cellules SaOs-2:

Les chambres de Boyden ont été testées dans six conditions dépendant de deux paramètres principaux qui sont la fonctionnalisation par la fibronectine et la présence de chimioattractant (FigII.11). Les cellules SaOs-2 ont été transfectées avec de l'actine-RFP et de l'histone-GFP. Puis les cellules ont été cultivées sur chambres de

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-ADN Actine

¢£¤¥ ¥¥¦§ ¨¦ ©: Comportement des cellules SaOª-§ ª« ¬ ­ ® ¯° ± ¬ ² ³ ² Boyden non fonctionnalisée sans chimioattractant. Les images observées ici correspondent au dessus de la membrane poreuse. Les flèches blanches montrent ici les extensions membranaires des cellules SaOs-2 leur permettant

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Boyden fonctionnalisées ou non et avec ou sans chimioattractant (FigIII.20.A à F). Le comportement des cellules a été observé par microscopie confocale avec une acquisition toutes les 5min pendant 6h.

Sans fonctionnalisation ni chimioattractant, les cellules SaOs-2 sont capables d'identifier les orifices. En effet, la cellule se déplace jusqu'au pore et y déploie des extensions membranaires. Toutefois elle ne traverse pas la membrane (FigIII.20.A).

Sans fonctionnalisation et avec chimioattractant, les cellules SaOs-2 détectent les pores et émettent de longues extensions membranaires jusqu'à l'autre côté de la membrane. La cellule semble tenter de s'agripper sur la partie inférieure de la membrane pour s'insérer et traverser le pore. Toutefois, après 6h, la cellule ne pouvant s'attacher pour se tracter, la cellule ne traverse pas la membrane. En effet,

FN -/- Chemo +

ADN Actine

¶·¸¹¹ ¹º» ¼º½: Comportement des cellules SaOs¾» ¿À Á chambre de Boyden non fonctionnalisée avec chimioattractant. ÂÃÄ

images observées ici correspondent au dessous de la membrane poreuse. Les flèches blanches montrent des extensions membranaires riches en actine permettant d'explorer la face inférieure de la membrane poreuse.

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le noyau cellulaire apparait comme un obstacle rigide à la transmigration (FigIII.20.B).

Les chambres de Boyden fonctionnalisées de part et d'autre permettent aux cellules SaOs-2 d'adhérer sur la partie supérieure. Certaines cellules traversent. Toutefois la

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Chemo

Chemo +

observées ici correspondent au dessus de la membrane poreuse. La flèche blanche montre une cellule bien adhérée sur la face supérieure de la membrane poreuse

ÐÑÒÓ ÓÓÔÕ ÖÔê: Comportement des cellules SaOsØÕ Ù ÚÛ chambre de Boyden fonctionnalisée de part et d'autre avec chimioattractant.

Les images ë ìä ãíî ïã ä åðå

correspondent au dessous de la membrane poreuse. Les flèches blanches pointent ici des extensions membranaires permettant aux cellules SaOsñ ò

d'explorer le compartiment inférieur.

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majorité se comporte comme celle présentée ici, elles s'étalent à la surface supérieure de la membrane et ne cherchent pas à traverser les pores (FigIII.20.C). L'ajout de chimioattractant à la membrane doublement fonctionnalisée permet toujours aux cellules d'adhérer et de s'étaler sur la face supérieure de la membrane. Toutefois, l'attraction est à présent plus forte et davantage d'extensions membranaires et de cellules traversent les pores (FigIII.20.D).

La fonctionnalisation des membranes poreuses uniquement sur la face inférieure ne permet pas aux cellules d'adhérer sur la face supérieure. En revanche, les cellules trouvent des sites d'ancrages sur la face inférieure qui leur permettent de traverser les orifices en moins de 6h. Le franchissement du pore s'effectue toutefois par à-coups comme le montre la FigIII.20.E. Effectivement, le noyau commence à traverser puis revient en arrière. Une condensation d'actine se place alors à l'arrière du noyau

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/+ Chemo

-ADN Actine

øùúû ûûüýþ üÿ: Comportement des cellules SaOs-2 sur chambre de Boyden fonctionnalisée en dessous sans chimioattractant. Les images observées ici correspondent au dessous de la membrane poreuse. Les flèches blanches montrent ici que le noyau ne franchit pas facilement et de façon fluide le pore membranaire. En

1

formant comme un "bouchon" actif lui permettant de complètement passer du côté inférieur.

La présence de chimioattractant dans le compartiment inférieur en plus de la fonctionnalisation de la face inférieure de la membrane poreuse permet au cellules SaOs-2 de traverser rapidement les pores. La cellule présentée transmigre sans à-coups à travers le pore (FigIII.20.F).

Il apparait donc que la transmigration des cellules à travers les pores nécessite la possibilité pour les cellules de s'agripper sur la partie inférieure des membranes. Cependant la possibilité pour les cellules d'adhérer sur la face supérieure diminue leur taux de transmigration à travers les pores. De plus, la présence de chimioattractant n'est pas obligatoire pour permettre aux cellules de traverser les membranes poreuses.

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Chemo +

ADN Actine

  : Comportement des cellules SaOs- 2 chambre de Boyden fonctionnalisée en dessous avec chimioattractant. L 

images observées ici correspondent au dessous de la membrane poreuse. Les flèches blanches montrent la progression du noyau traversant le pore.



La transmigration dans les différentes conditions présentées précédemment en dynamique a aussi été quantifiée après 6h sur des membranes poreuses après fixation des cellules. Les cellules de part et d'autre de la membrane ont été imagées par microscopie confocale et le pourcentage de cellules sur la membrane inférieure a été calculé (FigIII.21).

Les résultats montrent dans un premier temps que le chimioattractant a un effet sur la transmigration. Pour les conditions sans fibronectine et avec une double fonctionnalisation, la transmigration est significativement plus grande avec chimioattractant. Pour les membranes fonctionnalisées uniquement dessous, l'effet du chimioattractant est moins marqué. Les résultats montrent une différence avec un léger avantage sans chimioattractant. Toutefois la différence est moins marquée que l'effet positif du chimioattractant dans les autres conditions (FigIII.21).

Par ailleurs, la comparaison des capacité de transmigration entre des membranes non fonctionnalisées et doublement fonctionnalisées montre que l'ajout de fibronectine augmente significativement la transmigration. Cette migration à travers

0 4 7   0 4   0 40 60 80  -c  -C  c  - c  c    c  p !"#"$% "& -6 p=0,011 p=0,045 p=0,0016 p=0,0033 Pourcentage de cellules SaOs-2 ayant transmigré

'()* **+, .: Quantification de la transmigration des cellules SaOs-2 dans les différentes conditions de préparation des chambres de Boyden: /es chambres de Boyden ont été prépa 356 89a :89;<<536:= 68

conditions présentées dans la partie II.6. Les cellules SaOs> ? @ := aA@38 5= 5 6:8 6B 6:D56 8 9a :8 A 6

compartiment supérieur et cultivées 6h. Après ce temps d'incubation, les cellules ont été fixées, marquées au DAPI et à la phalloïdine>TREGH a Ia := 9J K= 36 ;Ba M 5 68 N a 3 B; D 3@8D@ N ; 6 D@ : <@ Da A6O /6

pourcentage de cellules ayant migré sur la partie inférieure de la membrane dans chaque condition a été calculé et rapporté dans l'histogramme. P6 8= 6 8=8QS TUQ@ :=5= 56<< 6D= V 58N @V 3 D@ BN a 3 63A 68

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les pores est encore augmentée d'une manière significative dans la condition n'ayant que la face inférieure fonctionnalisée (FigIII.21).

Il apparait nettement que le chimioattractant a un effet mais que celui-ci est mineur comparé à la fonctionnalisation. Ceci est peut-être dû au fait que le chimioattractant diffuse à travers la membrane avec le temps. Il perdrait ainsi de son efficacité (Entschladen F., et al., 2005). Nous avons, à la vue des résultats précédents, décidé de privilégier l'utilisation de chambres de Boyden fonctionnalisées uniquement sur la face inférieure de la membrane en présence de chimioattractant pour la comparaison des comportements de différents types de cellules. De plus, cette configuration a déjà fait ses preuves pour la comparaison des capacités de transmigration de différentes cellules (Carreiras F., et al., 1999; Kramer N., et al., 2013).

III.8.2 Comparaison des capacités à transmigrer des cellules SaOs-2, MG-63,