Imagerie des substrats et des cellules:

Trois techniques d'imagerie ont été mises à profit dans ce travail: d'une part deux types de microscopies optiques, à épifluorescence et confocale et d'autre part la microscopie électronique à balayage (MEB).

II.4.1. Microscopies à épifluorescence et confocale:

Les cellules cultivées sur supports plats ou micro-structurés, comme expliqué précédemment ont été imagées dans deux conditions, d'une part fixées, d'autre part en vivant.

Les cellules fixées et immunomarquées ont été observées par microscope à épifluorescence (Olympus BX-51) avec des objectifs 10X UplanFI et 40X Uplan Apo Oil (Olympus) grâce aux fluorochromes ou par microscopie confocale droite (Zeiss LSM 700) avec des objectifs 20X/0,8 Plan-Apo et 63X/1,4 Plan-Apo Oil (Zeiss) grâce aux fluorochromes et/ou par réflexion.

Les cellules vivantes ont été marquées de façon spécifique ou non et observées par microscopie confocale droite grâce à un objectif à immersion à eau 63X/1 Plan Apo W (Zeiss). Le microscope confocal droit est recommandé pour ce type de travail car il permet d'observer en vivant des cellules en culture sur des supports opaques. De plus pour conserver des conditions optimales de culture, une chambre d'incubation développée par Okolab (Italie) a été utilisée. Elle a permis de maintenir des températures de 37°C adaptées aux cellules ainsi que des atmosphères à 5% de CO2 et saturées en eau.

II.4.2. Microscopie électronique à balayage (MEB):

La microscopie électronique à balayage a été réalisée en conditions déshydratées (SEM: Scanning Electron Microscopy) et hydratées (ESEM: Environnemental Scanning Electron Microscopy).

En condition déshydratée, les supports avec cellules ont été incubés 30min dans une solution de glutaraldéhyde à 1% (v/v), paraformaldéhyde 0,5% (v/v) et tampon NaK2P 0,1% (v/v) à température ambiante. Puis les cellules ont été rincées 2h dans du tampon NaK2P à 0,175% (v/v). La déshydratation a été réalisée par des bains successifs dans l'éthanol à 50°, 70°, 80°, 95° et enfin 100° avec à chaque fois 2 bains de 5min pour chaque solution. Le retrait de toute eau de l'échantillon a été achevé par une incubation de 10min avec un mélange à 50/50 d'HMDS

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(HexaMéthylDiSilazane) et d'éthanol 100% et enfin par immersion 10min dans une solution à 100% d'HMDS. Le support avec les cellules a alors été séché à l'air libre puis recouvert d'une couche d'or avant d'être imagé. Pour les supports de PLLA et PDMS sans cellule, l'unique étape de recouvrement avec l'or a été effectuée. Cependant les différentes étapes de déshydratation ont d'une part modifié de façon très importante les phénotypes cellulaires mais aussi la forme de l'élastomère (figII.2). C'est pourquoi des études en conditions environnementales (sans déshydratation et dans l'eau) ont été réalisées.

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õö÷ø øùú: Observation par MEB des échantillons de PDMS microstructurés avec des cellules SaOs-2 après déshydratation: Le support de PDMS est très affecté par la déshydratation avec notamment la

facilitation de l'arrachage de piliers (A). Les cellules sont aussi touchées et paraissent détachées de leurs points d'ancrage initiaux à leurs extrémités (B). Les piliers non arrachés perdent leur rigidité et sont déformés (C) et pliés sous la contrainte des cellules déshydratées (D).

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En conditions hydratées, les supports couverts de cellules ont été incubés dans une solution de glutaraldéhyde à 1% (v/v), paraformaldéhyde à 0,5% (v/v) dans un tampon NaK2P pendant 30min à température ambiante. Sans autre traitement les substrats ont été imagés dans l'eau.

Le microscope à balayage (Quanta 400, FEI) a été utilisé à des puissances de 15kV.

II.4.3. Analyses des images:

L'analyse des acquisitions issues des microscopes est un travail difficile car elle consiste à résumer objectivement toute une surface étudiées en seulement quelques images. De plus, chaque personne aborde les observations avec son propre regard et sa propre idée. Et même quand l'idée est claire pour l'expérimentateur qui a observé des milliers de cellules, il faut encore transcrire ces informations de façon claire et persuasive à la communauté scientifique avec des analyses qualitatives et quantitatives. C'est pourquoi, ici l'analyse des images a été adaptées à chaque observation (Images 2D, 2D associées à des coupes transversales, 3D ou séquences d'images).

II.4.4. Logiciels d'analyse d'images:

Les images effectuées par microscopie à épifluorescence ont été exportées sous format "tif", une image a été effectuée pour chaque fluorochrome.

Pour les acquisitions réalisées par microscopie confocale, une première analyse a été effectuée avec le logiciel ZEN^® qui est aussi le logiciel pilote du LSM 700. Cette première analyse a permis d'exporter des images en 2D ou en 3D sous format "tif". Ces images ont été ensuite mises en forme ou quantifiées selon les besoins grâce aux logiciels ImageJ (version 1.43u), PowerPoint^® ou Windows live movie maker^®. Différentes analyses ont été accomplies, des analyses qualitatives, quantitatives et des montages de films.

Les analyses qualitatives ont été réalisées sur ZEN^® et/ou ImageJ selon les besoins sous forme d'images en 2D, en 3D ou avec une image 2D associée à des coupes transversales.

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II.4.5. Quantification de la déformation:

Afin de quantifier les déformations cellulaires sur les micro-piliers nous nous sommes basés sur le fait que les noyaux cellulaires ont un diamètre supérieur à l'espace entre deux piliers. En considérant ce paramètre, les parties des noyaux qui apparaissent entre les piliers sont donc considérées comme déformées. Pour cela, ZEN a été

utilisé pour séparer les parties des noyaux qui étaient au dessus, des parties en dessous du haut des piliers. Le haut des piliers est facilement identifiable grâce à l'acquisition des échantillons par réflexion (figII.3).

L'image en 3D analysée avec ZEN^® est en fait la reconstitution de plusieurs images 2D. Ces images 2D ont été partagées en deux groupes: partie du noyau déformée et partie du noyau non déformée (figII.3). La quantification des volumes de chaque groupe a alors été effectuée avec le logiciel ImageJ en mesurant l'aire correspondant au noyau dans chaque image. Cette quantification a permis entre autre de comparer les comportements de différentes lignées cellulaires sur micro-piliers.

II.4.6. Quantification de la transmigration:

D'autres analyses quantitatives ont été effectuées, notamment pour évaluer la quantité de cellule qui transmigrait dans les chambres de Boyden. A nouveau les logiciels ZEN^® et ImageJ ont été mis à profit. ZEN^® a permis de séparer les cellules qui étaient en dessous de la membrane poreuse des cellules qui étaient au dessus

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  P    

Partie du noyau déformée

ADN

   

1   F : Explication de la découpe du

noyau pour la quantification de la déformation des cellules cultivées sur micro-piliers.

3 

grâce à des marqueurs fluorescents et à l'imagerie par réflexion (figII.4). ImageJ a permis ensuite de dénombrer les cellules dans chaque groupe en se basant à nouveau sur le marquage des noyaux. Cette expérience a permis ainsi de quantifier la quantité de cellules qui ont été capables de traverser par rapport à celles qui sont restées dans la partie supérieure de la chambre.

II.5. Inhibitions moléculaires de protéines impliquées dans la mécanique