Mécano-biologie de cellules cancéreuses sur surfaces à topographie et chimie contrôlées

Texte intégral

(1)Mécano-biologie de cellules cancéreuses sur surfaces à topographie et chimie contrôlées Florent Badique. To cite this version: Florent Badique. Mécano-biologie de cellules cancéreuses sur surfaces à topographie et chimie contrôlées. Biologie cellulaire. Université de Haute Alsace - Mulhouse, 2013. Français. �NNT : 2013MULH8315�. �tel-01207011�. HAL Id: tel-01207011 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01207011 Submitted on 30 Sep 2015. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) THESE Pour obtenir le grade de Docteur de l'Université de Haute Alsace, Spécialité Biologie Cellulaire. Florent BADIQUE. Mécano-biologie de cellules cancéreuses. Institut de Sciences des Matériaux de Mulhouse, CNRS UMR 7361, Mulhouse Unité INSERM U1113, Strasbourg Thèse soutenue le 16 Décembre 2013 Rapporteur:. Pr Benoit LADOUX. Rapporteur:. Dr Daniel ISABEY. Institut Jacques Monod, Paris. Institut Mondor de Recherche Biomédicale, Créteil Membre du jury: Dr Michelina PLATEROTI Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaire et Cellulaire, Villeurbanne Directeur de thèse: Dr Karine ANSELME Institut des Sciences des Matériaux de Mulhouse Co-directeur de thèse: Dr Jean-Noël FREUND INSERM, Strasbourg.

(3) Résumé: Le travail présenté dans cette thèse est le résultat d'une collaboration fructueuse entre la chimie, la physique et la biologie. En effet, des matériaux avec des propriétés physico-chimiques très contrôlées ont été mis à profit dans le but de caractériser des fonctions cellulaires complexes. Nous présentons tout d'abord la création d'un outil permettant l'étude de la mécanotransduction cellulaire. L'originalité de cet outil est basé sur son activation par étirement permettant de lier réversiblement les cellules à la surface. Nous avons ensuite étudié des comportements de cellules souches et cancéreuses en réponse à des microtopographies sous forme de piliers. Cette approche a permis de définir un comportement cancéreux caractérisé par une déformation prononcée des corps et noyaux cellulaires. Nous montrons aussi que l'utilisation de cette surface couverte de micro-piliers permet de décrire la mécano-biologie de cellules cancéreuses. En effet, ce substrat à topographie contrôlée a permis de montrer que la chimie et la rigidité du substrat n'ont que peu d'incidence sur la déformation des cellules cancéreuses, alors que les éléments du cytosquelette sont primordiaux et que sans eux, la déformation n'est pas possible. Nous avons ensuite inhibé une à une des protéines de l'enveloppe et de la lamina nucléaire afin d'évaluer leur implication dans ces mécanismes de déformation. En parallèle, un séquençage total des ARN (Acides RiboNucléiques) de cellules déformées et non déformées a été réalisé dans le but de visualiser d'éventuelles modifications dans l'expression génique. Ces déformations des cellules cancéreuses entre les micro-piliers ont été comparées à celles que subissent les cellules lors de la traversée de membranes poreuses (Chambres de Boyden). Ces comparaisons nous ont permis d'identifier que plusieurs mécanismes peuvent aboutir à la déformation de cellules cancéreuses et en particulier de leurs noyaux. Nous montrons dans une dernière partie que la mitose cellulaire s'effectue sur les surfaces microstructurées. Nous décrivons une ségrégation des chromosomes qui semble être non parallèle. Toutefois, ces divisions atypiques ne causent pas davantage d'accidents mitotiques. Mots clés: Micro-piliers, cancer, déformation cellulaire, déformation nucléaire, mécanique cellulaire, mécanotransduction, cytosquelette, chambre de Boyden. 2.

(4) Abstract:. The work shown in this thesis is the outcome of a successful collaboration between chemistry, physics and biology. Indeed, materials with well controlled parameters have been used in order to characterize complex cellular functions. We first introduce the creation of one tool which allow the study of cells mechanotransduction. The originality of this tool is based on its activation by stretching which allow a reversible adhesion of cells to the surface. Then, we studied the behavior of stem cells and cancerous cells on micropillared surfaces. This approach allowed us to describe a cancerous behavior of cells characterized by strong deformations of cells bodies and nuclei. We also showed that the use of such micropillared surfaces allowed us to describe cancerous cells mecanobiology. Indeed, this substrate with a well controlled topography allowed us to show that substrates chemistry and stiffness have only little effects on cancerous cells deformation while cytoskeleton components are necessary. More specifically, the deformation is impossible without the cytoskeleton. We also inhibited the nuclear envelope proteins and nuclear lamina proteins in order to evaluate their involvement in cells deformation mechanism. In the same time, a total RNA (RiboNucleic Acids) sequencing of deformed and non deformed cells have been done in order to identify an eventual modification in gene expression. These deformations of cancerous cells between micropillars have been compared to the deformation of cells during the transmigration through porous membranes (Boyden chambers). These comparisons allowed us to identify several mechanisms which lead to cells deformation and more specifically to nuclei deformation. We showed in a last part that cells can divide on micropillared surfaces. We described a non parallel like segregation of chromosomes. However, these unusual mitosis didn't lead to supernumerary troubles in cell division.. Key words: Micropillars, cancer, cellular deformation, nuclear deformation, cellular mechanic, mechanotransduction, cytoskeleton, Boyden chambers.. 3.

(5) Remerciements: Dans un premier temps je souhaite remercier Karine Anselme et Jean-Noël Freund qui m'ont recruté à un moment difficile de ma formation. Ils ont su me guider et me conseiller tout au long de mon travail de thèse. Je me considère vraiment chanceux d'avoir eu l'occasion d'être formé au côté de brillantes personnes comme eux. J'ai pu ainsi m'intégrer à la communauté scientifique et profiter d'un environnement pluridisciplinaire propice à un travail de qualité. Je remercie aussi notre directrice de l'établissement Cathie Vix qui entretient dans l'institut un climat de travail très agréable et une qualité scientifique reconnue. Je remercie toutes les personnes qui m'ont permis au quotidien de travailler dans d'excellentes conditions. Je pense à Joelle Dangy, Sylvie Forget, Fabienne Sorgato, Eric Ehrhard, Louisa Idiri et Natalina Muller qui ont toujours répondu présents quand j'avais des questions d'ordre administratif. Pour les aspects techniques je veux saluer Luc Delmotte, Cyril Geney, Stephane Knopf, Fernand Wieder, Philippe Fioux, Simon Gree et Patrick Lamielle qui ont toujours été prompts à trouver des solutions efficaces là où le biologiste perdait pied. Je tiens aussi à remercier mes nombreux collaborateurs grâce auxquels j'ai appris énormément. Dimitar Stamov et Clemens Franz de Karlsruhe grâce à qui notre travail sur la mécanique cellulaire a pu être sublimé. Vincent Roucoules, Pierre Schaaf et surtout Jalal Bacharouche avec qui nous avons montré que l'adhésion cellulaire peut être contrôlée par étirement d'un substrat. Je veux aussi dire merci à Sylvain Gabriele, Marie Versaevel et Thomas Grevesse pour leur accueil chaleureux en Belgique et pour les discussions que nous avons eu. Merci à Mélanie Eichhorn, Eleonora Grespan, Gunter Reiter et Nicolas Elvassore pour leurs discussions et le travail effectué ensemble. Je tiens aussi à remercier nos collaborateurs de Copenhague, Trine Berthing, Sara Bonde, Kristian Andersen et Karen Martinez qui font un travail remarquable sur les nanofils. Merci à Gladys Pozza et Pierre Lutz pour leur collaboration. Je veux aussi remercier Olivier Soppera, Fabrice Stehlin et Arnaud Spangenberg pour nos nombreuses discussions qui m'ont permis d'apprendre énormément. Merci aussi à Lili Wolfrom qui m'a aidé à évoluer au sein de l'Inserm à Strasbourg. Je remercie aussi Maël Le Berre et Matthieu Piel pour les discussions que nous avons eu et pour le matériel cellulaire qu'ils ont mis à notre disposition. L'enseignement est une tâche difficile et je tiens à remercier Karine Mougin et Laurent Vonna qui m'ont guidé quand j'en avais besoin. Je veux aussi saluer tous les membres de l'équipe parmi lesquels je me suis fais de nombreux amis. Merci à Félix Sima, Victor Prévost, Doris Campos, Paolo Sima, Debora Tavares, Liliane Païva, William Querido, Emilia Kulaga, Judith Bohmler, Janina Moller, Lydie Ploux et Arnaud Ponche. Un mot en particulier pour Tatiana Bourgade avec qui j'ai beaucoup travaillé pour améliorer notre travail quotidien et ce. 4.

(6) n'était pas toujours gagné d'avance! Merci enfin à Jules Valentin, mon ami, mon témoin, c'est agréable de pouvoir compter sur quelqu'un les yeux fermés. Je remercie aussi les stagiaires que j'ai encadré, Thierry Bringard, Marine Boulangé, Lise Badiqué et Mathieu Veuillet qui ont effectué un travail de qualité au sein de notre groupe. Et en particulier Mathieu qui est aujourd'hui un membre de notre équipe. Je ne veux pas oublier ma famille, merci à tous d'avoir toujours cru en moi pendant ces années. Merci surtout à mes parents qui m'ont toujours soutenu moralement et financièrement. Je n'en serais pas là sans eux. Merci à mon frère et à ma sœur pour leur soutien. Un salut tout particulier à mon grand père paternel qui est quelqu'un de brillant et qui n'a malheureusement pas eu les mêmes moyens que moi dans sa vie. Cette thèse est aussi pour toi grand père, tu l'as vécu à travers moi mais je sais très bien que tu aurais pu faire plus fort si tu en avais eu l'occasion. Enfin, je souhaite remercier ma femme. La thèse reste un parcours semé d'embuches et elle a su m'encourager et me supporter les jours où le moral n'était pas au plus haut. Je peux dire aujourd'hui que je ne ressens un sentiment de plénitude que depuis que tu es entrée dans ma vie.. 5.

(7) Sommaire:. I. Introduction:......................................................................................................................................... 9 I.1 La cellule: ........................................................................................................................................ 9 I.2 Adhésion cellulaire: ...................................................................................................................... 10 I.3 Cytosquelette: .............................................................................................................................. 12 I.4 Noyau cellulaire: ........................................................................................................................... 15 I.5 Complexe LINC: ............................................................................................................................ 17 I.6 Mécanotransduction: ................................................................................................................... 18 I.7 Matériaux dédiés à la biologie cellulaire: ..................................................................................... 20 I.8 De la cellule saine à la métastase: ................................................................................................ 24 I.9 Propriétés mécaniques des cellules cancéreuses: ....................................................................... 27 II. Matériels, méthodes et mises au point:............................................................................................ 28 II.1. Fabrication de surfaces constituées de micro-piliers en PLLA et en PDMS: .............................. 28 II.1.2 Moules de PDMS: ................................................................................................................. 29 II.1.3 Supports micro-structurés de PLLA: ..................................................................................... 29 II.1.4 Supports micro-structurés de PDMS: ................................................................................... 29 II.2. Cultures cellulaires: .................................................................................................................... 31 II.2.1. Cellules hMSC: ..................................................................................................................... 31 II.2.2. Cellules F/STRO-1+ A: .......................................................................................................... 31 II.2.3. Ostéosarcomes (SaOs-2, MG-63, OHS-4): ........................................................................... 31 II.2.4. Cellules TC7: ........................................................................................................................ 31 II.3. Marquages Cellulaires: ............................................................................................................... 32 II.3.1. Marquages de cellules fixées: ............................................................................................. 32 II.3.2. Marquage des cellules en vivant: ........................................................................................ 32 II.3.3. Marquages spécifiques en vivant: ....................................................................................... 33 II.3.4. Marquages non spécifiques en vivant: ................................................................................ 33 II.4. Imagerie des substrats et des cellules: ....................................................................................... 34 II.4.1. Microscopies à épifluorescence et confocale: .................................................................... 34 II.4.2. Microscopie électronique à balayage (MEB): ...................................................................... 34 II.4.3. Analyses des images: ........................................................................................................... 36 II.4.4. Logiciels d'analyse d'images: ............................................................................................... 36 II.4.5. Quantification de la déformation: ....................................................................................... 37 6.

(8) II.4.6. Quantification de la transmigration: ................................................................................... 37 II.5. Inhibitions moléculaires de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire:...................... 38 II.5.1. Inhibition par les drogues: ................................................................................................... 39 II.5.2. Tests de cytotoxicité des drogues: ...................................................................................... 41 II.5.3. Mise en place des expériences d'inhibition par les drogues: .............................................. 42 II.5.4. Inhibition de protéines impliquées dans la mécanique cellulaire par les siRNA:................ 48 II.6. Tests de transmigration dans des chambres de Boyden:........................................................... 48 II.6.1. Mise au point des conditions de transmigration sur cellules SaOs-2: ................................ 48 II.6.2. Comparaison des capacités de transmigration des cellules MG-63, OHS-4 SaOs-2 et TC7: 50 II.7. Etude de l'expression génique des cellules déformées: ............................................................ 50 II.7.1. Extraction d'ARN:................................................................................................................. 50 II.7.2. PCR et séquençage d'ARN: .................................................................................................. 51 II.8. Synchronisation cellulaire: ......................................................................................................... 51 II.9. Ascension et déformation des cellules SaOs-2:.......................................................................... 52 II.10. Culture des cellules sur support activable par étirement: ....................................................... 52 II.11. Statistiques: .............................................................................................................................. 53 III. Résultats et Discussion: .................................................................................................................... 53 III.1 Développement d'une surface dont l'étirement active l'adhésion cellulaire: ........................... 53 III.2 Déformations cellulaires sur micro-piliers: ................................................................................ 82 III.2.1 Observation en dynamique de cellules hMSC cultivées sur micro-piliers: ......................... 84 III.2.2 Comportements des cellules cancéreuses sur micro-piliers ............................................... 85 III.2.3 Cinétiques de déformation des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: ........................... 87 III.3 Origine du comportement de déformation cellulaire: ............................................................... 89 III.4 Comparaison des comportements de cellules mésenchymateuses et épithéliales cancéreuses sur micro-piliers:.............................................................................................................................. 108 III.4.1 Organisation du cytosquelette et adhésion des cellules SaOs-2 et TC7 sur micro-piliers: 108 III.4.2 Implication de chaque composant du cytosquelette: ....................................................... 113 III.5 Evaluation du rôle du complexe LINC dans le mécanisme de déformation:............................ 124 III.6 Etude de l'expression génique des cellules déformées et non déformées: ............................. 129 III.6.1 Analyse de l'expression de gènes impliqués dans le cancer: ............................................ 129 III.6.2 Analyse de l’expression génique globale des cellules SaOs-2 et TC7 déformées: ............ 131 III.7 Nature et déroulement du mécanisme de déformation des cellules: ..................................... 133 III.8 Comparaison de la déformation entre micro-piliers aux chambres de Boyden: ..................... 139 III.8.1 Mise au point des conditions de transmigration avec les cellules SaOs-2: ....................... 140. 7.

(9) III.8.2 Comparaison des capacités à transmigrer des cellules SaOs-2, MG-63, OHS-4 et TC7: ... 146 III.9 Divisions cellulaires sur micro-piliers: ...................................................................................... 150 IV. Conclusions et perspectives: .......................................................................................................... 154 Abréviations: ....................................................................................................................................... 161 Bibliographie: ...................................................................................................................................... 162. 8.

(10) I. Introduction: Le travail présenté dans cette thèse est le résultat d'une collaboration fructueuse entre la chimie, la physique et la biologie. En effet, des matériaux avec des propriétés physico-chimiques très contrôlés ont été mis à profit dans le but de caractériser des fonctions cellulaires complexes et en particulier la sensibilité des cellules à leur environnement. Les techniques biologiques classiques permettent de comprendre l'effet de la chimie sur les cellules. Toutefois, la sensibilité des cellules aux paramètres physiques est peu abordable avec les outils conventionnels de la biologie. C'est pourquoi des collaborations interdisciplinaires sont nécessaires à une compréhension plus globale. La cellule est parmi les éléments biologiques les plus étudiés depuis plus d'un siècle, toutefois sa diversité et sa complexité permettent encore de lui découvrir chaque jour de nouvelles propriétés et caractéristiques. I . La cellule:. La cellule est connue comme l'unité du vivant depuis 1839 avec "la théorie de la cellule" établie par Theodor Schwann. Il avait en effet décrit la cellule comme constituant de base des végétaux et des animaux. Ces cellules décrites par T. Schwann ont été nommées eucaryotes en opposition aux cellules procaryotes. Les cellules procaryotes sont des organismes unicellulaires ne présentant pas de noyau. Les cellules eucaryotes quant à elles, sont pourvues d'un noyau qui renferme l'ADN (Acide Désoxyribo Nucléique). Les cellules eucaryotes peuvent être unicellulaires comme les levures, mais le plus souvent elles sont organisées en organismes pluricellulaires. Ainsi, les végétaux et les animaux sont constitués de cellules eucaryotes. Ces cellules contiennent différents organites comme les réticulum endoplasmiques lisses et granuleux, l'appareil de Golgi, la mitochondrie et le noyau. Ce dernier organite est considéré comme le plus important. En effet, l'ADN qu'il contient est la clé de la constitution et du fonctionnement de chaque organisme. La quantité et la nature de l'ADN sont les mêmes dans chaque noyau cellulaire d'un même organisme. Un être humain adulte est formé 10 14 cellules. Pourtant, toutes les cellules n'ont pas la même fonction. En effet, l'information génétique n'est pas utilisée, exprimée, de la même manière dans toutes les cellules. L'expression génique est adaptée pour la fonction de chaque cellule. L'acquisition d'une fonction par une cellule est nommée différenciation. Cette dernière dépend en grande partie. 9.

(11) de l'environnement dans lequel évolue la cellule (Swift J., et al., 2013). La cellule est donc une unité de base pour tous les organismes pluricellulaires douée d'une sensibilité particulière pour son environnement. En effet, la cellule est capable d'évaluer les propriétés mécaniques et chimiques de son environnement afin de s'y adapter (Vogel V. and Sheetz M., et al., 2006; Geiger B., et al., 2009). Cette sensibilité à l'environnement provient de différents acteurs situés sur la membrane plasmique des cellules incarnés par les protéines. Ces protéines représentent le produit final de l'expression des gènes. Elles sont le plus souvent organisées en complexes et assurent la plupart des fonctions cellulaires. Des complexes protéiques localisés à la surface membranaire assurent les rôles d'adhésion cellulaire ainsi que de reconnaissance des propriétés chimiques ou physiques de l'environnement. I.2 Adhésion cellulaire: L'adhésion de la cellule dépend de sa capacité à trouver des sites d'ancrage dans son environnement extracellulaire. Pour la majorité des cellules (sauf cellules circulantes et cancéreuses), l'adhésion est nécessaire sous peine d'entrer en apoptose (mort cellulaire) (Hirschfeld-Warneken V.C., et al., 2008). De plus, l'adhésion est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme l'étalement, la migration, la progression dans le cycle cellulaire, la prolifération et la différenciation (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995; Garcia A.J., 2005; Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006; Zemel A., et al., 2010). Les sites d'ancrage pour les cellules se situent dans des matrices extracellulaires ou à la surface d'autres cellules (Tseng Q., et al., 2011). La membrane cellulaire est pourvue de différents récepteurs, le choix de l'utilisation d'un récepteur plutôt que d'un autre s'effectue spécifiquement en fonction de la nature des ligands ciblés dans l'environnement (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). Ces récepteurs membranaires peuvent être constitués de cadhérines dans le cas des liaisons intercellulaires ou d'intégrines pour les liens à la matrice extracellulaire. Les cadhérines sont le plus souvent impliquées dans des liaisons homophiliques, ce qui signifie qu'elles se lient à d'autres cadhérines sur une membrane cellulaire adjacente (Yamada S. et Nelson W.J., 2007). Les intégrines, quant à elles, peuvent adhérer à différents ligands de la matrice extracellulaire comme la vitronectine, la laminine, le collagène ou la fibronectine (sous-unité RGD (Arginine-Guanine-Aspartate)) (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995; Mooney D.J., et al.,. 1.

(12) F:. Schématisation d'un complexe d'adhésion cellulaire:. D.

(13) . . .

(14) . . représentée en terme structural avec l'organisation des principales protéines permettant la fixation du cytosquelette sur les intégrines. D

(15)

(16) . les protéines impliquées dans la signalisation intracellulaire se fixant aux intégrines. S

(17)

(18) C

(19) . E.A. et Brugge J.S., 1995.. 1995; Garcia A.J., 2005). Les intégrines sont constituées d'une sous-unité α qui donne la spécificité et d'une sous-unité β qui est impliquée dans le recrutement de protéines (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995). En fonction du ligand ciblé, différentes intégrines sont sollicitées, par exemple, α5 β1 pour la fibronectine, αv β3 pour la vitronectine (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). La fixation d'un ligand sur un hétérodimère. d'intégrine. initie. le. recrutement. d'intégrines et. de. protéines. intracellulaires pour former un complexe protéique nommé point focal. Ce point focal est connu pour permettre l'adhésion cellulaire mais pas seulement. Les intégrines sont des protéines transmembranaires qui lient spécifiquement des ligands extracellulaires. et. qui. permettent. la. formation. de. complexes. protéiques. intracellulaires (FigI.1). Leur petit domaine intracellulaire n'a pas d'activité enzymatique mais il permet le recrutement de protéines sur la face cytosolique de la membrane plasmique. Ces dernières sont soit impliquées dans la fixation du .

(20) cytosquelette (α-actinine, taline, tensine, vinculine) soit dans la signalisation intracellulaire (FAK (Focal Adhesion Kinase), paxilline) (FigI.1) (Clark E.A. et Brugge J.S., 1995; Schwartz V.S. et Gardel M.L., 2012). La construction du point focal est spécifique des ligands extracellulaires. La cellule peut donc adapter son comportement à son environnement grâce à ces reconnaissances. Ainsi, la signalisation en provenance des points focaux est toujours spécifique et conditionne le comportement cellulaire (Cuvelier D., et al., 2007). Geiger B., et al., décrivent que les points focaux permettent aux cellules d'évaluer la topographie, la rigidité et la biodiversité chimique de leur environnement (Geiger B., et al., 2009). Par ailleurs, la fixation du cytosquelette aux points focaux permet à la cellule d'élaborer une architecture interne sur la base d'adhésions solides. Ces constructions aboutissent à l'acquisition de la forme cellulaire qui est très souvent liée à sa fonction. De plus, le réseau de cytosquelette contient des protéines sensibles aux stress mécaniques (zyxine, p130cas, taline, vinculine et filamine A). Ces protéines permettent donc à la cellule d'évaluer les forces provenant du milieu extracellulaire afin de s'y adapter (Schwartz V.S. et Gardel M.L., 2012). Enfin, ces liens physiques entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule permettent à cette dernière d'organiser sa matrice extracellulaire si cela est nécessaire. En effet, HirschfeldWarneken V.C., et al., ont par exemple montré que l'espace entre deux ligands permettant la construction d'un point focal ne doit pas excéder 58nm (Cavalcanti Adam E.A., et al., 2006). Pour s'affranchir de ce type de problème, la cellule a la capacité de construire des réseaux de fibronectine à partir de molécules en suspension. En effet, l'adhésion à la fibronectine est possible via les points focaux et le cytosquelette sous-jacent permet d'organiser les fibres néoformées (Pankov R., et al., 2000). Le réseau de cytosquelette est donc essentiel dans la mécanique cellulaire. I.3 Cytosquelette: Le cytosquelette est constitué de 3 composants majeurs classés en fonction de leur taille, les microfilaments d'actine (7 à 8nm), les filaments intermédiaires (10nm) et les microtubules (25nm). Le cytosquelette donne sa forme à la cellule et lui confère les capacités de se mouvoir, se déformer, se contracter et déplacer des organites ou de la matière dans son cytoplasme. C'est aussi ce réseau tridimensionnel qui confère à .

(21) la cellule ses propriétés mécaniques (Trickey W.R., et al., 2004; Ofek G., et al., 2009). Chaque partie du cytosquelette a un rôle propre. Ces rôles sont toutefois complémentaires et confèrent différentes fonctions à la cellule. Ainsi Sakai H., et al., ont par exemple montré que l'actine et les filaments intermédiaires sont tous deux impliqués dans la contraction de muscles lisses chez le rat (Sakai H., et al., 2009). Chaque constituant du cytosquelette a donc une constitution et des propriétés particulières. L'actine existe sous deux formes, actine G (globulaire) et actine F (Filamenteuse). L'actine F est le résultat de la polymérisation en hélice gauche de l'actine G. L'organisation intracellulaire de ces microfilaments dépend en grande partie du type cellulaire. L'actine peut être organisée en fibres de stress qui traversent la cellule de part en part. Si ces fibres de stress passent au dessus du noyau cellulaire, elles sont nommées "actin cap" (Khatau S.B., et al., 2010). L'actine peut aussi être organisée de façon périphérique à la cellule sous forme de fibres ou de gels (FigI.2). L'actine est très souvent décrite comme le moteur cellulaire principal, en particulier grâce à sa liaison avec la myosine. En effet, le complexe acto-myosine est connu pour être à l'origine des contractions musculaires et de la plupart des mouvements cellulaires. Les mouvements acto-myosine-dépendants résultent d'un glissement entre les filaments d'actine et de myosine (Hawkins R.J., et al., 2011). L'actine est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme la division, la motilité, l'endocytose, l'acquisition du phénotype et la contraction musculaire (Janmey P.A., et al., 1991; Bathe M., et al., 2008; Coffman V.C., et al., 2009; Verkhovsky A.B., 2010). Myosine. Integrines. Actine. ,-./0::. Schéma de l'organisation intracellulaire du cytosquelette cellulaire. Microtubules. Filaments intermédiaires de types I à IV L&'()*+. N"#$%. Membrane plasmique. !.

(22) Les filaments intermédiaires sont moins conservés d'un type cellulaire à un autre que les microfilaments. Cinq types de filaments intermédiaires existent. Les kératines trouvées essentiellement dans les cellules épithéliales constituent les types I et II. Leur particularité est qu'ils sont hétéropolymériques. La vimentine (cellules mésenchymateuses), la desmine, la GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) et la périphérine sont homopolymériques et constituent le type III. Le type IV des filaments intermédiaires inclut les neurofilaments, la nestine, la syncoiline et l'α-internexine. Et enfin le type V est spécifique des filaments intermédiaires nucléaires avec les lamines A, C et B (Chang L. et Goldman R.D., 2004; Eriksson J.E., et al., 2009; Polychronidou M. et Groβhans J., 2011). Tous les filaments intermédiaires ont une structure centrale identique sous forme d'hélice α. Leur spécificité provient des chaînes latérales qui sont très variables (Chang L. et Goldman R.D., 2004). La lamine B est essentielle dans la viabilité cellulaire, elle est donc retrouvée à un taux fixe dans la majorité des types cellulaires (constitutive) alors que les lamines A/C varient énormément et peuvent être absentes dans certains types cellulaires (Lee J.S.H., et al., 2007; Dahl K.N., et al., 2008). La polymérisation et l'arrangement spatial des filaments intermédiaires sont le plus souvent régulés par phosphorylation (Busch T., et al., 2012). L'organisation intracellulaire des filaments intermédiaires est périnucléaire et s'étend jusqu'à la périphérie de la cellule (FigI.2) (Busch T., et al., 2012). Les filaments intermédiaires sont reconnus comme les garants de l'intégrité cellulaire. Ils ont en effet des propriétés mécaniques qui leurs permettent de préserver la cellule d'un stress mécanique brisant les microfilaments et les microtubules. Ils ont aussi des rôles dans la maintenance de la forme et du positionnement du noyau, l'expression génique, la réplication, la liaison aux autres parties du cytosquelette, la motilité, la polarisation et l'adhésion cellulaire (Janmey P.A., et al., 1991; Chang L. et Goldman R.D., 2004; Nieminen M., et al., 2006; Lee J.S.H., et al., 2007; Kumar N., et al., 2007; Dahl K.N., et al., 2008; Shimi T., et al., 2008; Lund N., et al., 2010). Les microtubules sont constitués des sous-unités de tubuline α et β arrangées en protofilaments puis en filaments de 25 nm de diamètre. La nucléation des microtubules s'effectue à partir du MTOC (MicroTubule Organizing Center) et notamment grâce à la tubuline γ (Piel M. et Tran P.T., 2009). Leur organisation intracellulaire est relativement conservée d'un type cellulaire à un autre, les microtubules émanent du MTOC ou centrosome et s'étendent jusqu'à la périphérie ;<.

(23) cellulaire (FigI.2) (Screpanti E., et al., 2010). Ces filaments peu flexibles et cassants ont un rôle primordial en association avec la dynéine et la kinésine dans le transport intracellulaire des organites, protéines et ARN (Hawkins R.J., et al., 2011). Ils interviennent aussi dans le positionnement du noyau au milieu de la cellule, les propriétés viscoélastiques du cytoplasme, la mitose, l'orientation et le phénotype cellulaire (Janmey P.A., et al., 1991; Piel M. et Tran P.T., 2009; Goldyn A.M., et al., 2010; Dupin I., et al., 2011). Les propriétés mécaniques conférées par les éléments du cytosquelette sont essentielles pour la cellule et en particulier pour protéger l'élément central, le noyau. I.4 Noyau cellulaire: Le noyau est l'organite principal, il contient la presque totalité de l'ADN cellulaire. Sa forme ovoïde ou sphéroïde est le plus souvent invariable, il existe des cas particuliers notamment pour des cellules du système immunitaire où les noyaux peuvent être plurilobés. Le noyau est délimité par deux membranes lipidiques nommées externes et internes. La membrane externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique. La membrane interne est caractérisée par la présence de nombreuses protéines intégrales (enchâssées dans la membrane) (Polychronidou M. et Groβhans J., 2011). De plus elle est soulignée par la lamina nucléaire qui est essentiellement constituée de lamines. Les membranes lipidiques du noyau sont ponctuées par des pores nucléaires (Rowat A.C., et al., 2008). Ces pores nucléaires permettent le passage de macromolécules entre le cytoplasme et le nucléoplasme (FigI.3) (Tzur Y.B., et al., 2006). Le noyau est mécaniquement rigide comparé au reste de la cellule. Cette propriété provient en grande partie de la lamina nucléaire qui maintient l'intégrité du noyau (Rowat A.C., et al., 2008). Le noyau contient ainsi l'ADN mais aussi des protéines et des ARN (Acide RiboNucléique) afin d'assurer différentes fonctions comme compaction, réplication, transcription de l'ADN et épissage des préARN (Cremer T. et Cremer C., 2001). L'intérieur du noyau est organisé en différents compartiments liés à la fonction qu'ils assurent. Ainsi on décrit le nucléole pour la production des ribosomes; les "PML bodies" ou "Nuclear bodies" enrichis en protéine impliqués dans la régulation de la transcription, la réparation de l'ADN et l'apoptose; les corps de Cajal assurant la maturation des ARN et les régions riches en chromatines. Les régions riches en chromatine sont séparées en euchromatine et hétérochromatine (Lanctôt C., et al., =>.

(24) 2007). En effet, au sein de l'euchromatine la compaction de l'ADN est faible et les gènes sont actifs alors que l'hétérochromatine est très compactée et inactive (Hameed F.M., et al., 2012).. ABEGHJ:. Schéma du noyau selon Tzur Y.B., et al., 2006. Des chercheurs tentent de cartographier la structure interne du noyau, il semblerait que l'expression génique soit liée à l'emplacement des chromosomes au sein du noyau (Cremer T. et Cremer C., 2001; Lanctôt C., et al., 2007). Des modifications dans l'emplacement et la conformation des chromosomes ont déjà été identifiés lors de différenciations cellulaires (Cremer T. et Cremer C., 2001; Rowat A.C., et al., 2008). De plus, il semblerait que l'application de forces sur le noyau puisse provoquer une déformation locale influant sur l'expression génique (Rowat A.C., et al., 2008). Les forces mécaniques appliquées sur l'enveloppe nucléaire proviennent de l'environnement cellulaire. Elles sont transmises au noyau via les points focaux, le cytosquelette et le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) (Lombardi M.L., et al., 2011).. ?@.

(25) I.5 Complexe LINC: Le complexe LINC constitue le lien physique entre le cytosquelette et le nucléosquelette (Starr D.A., 2007). Il est composé de plusieurs protéines dont les nesprines et les SUN. Les nesprines sont localisées dans la membrane externe du noyau alors que les protéines SUN sont dans la membrane interne (Schirmer E.C. et Foisner R., 2007; Lombardi M.L., et al., 2011). Les nesprines ont toutes un domaine transmembranaire KASH (Klarsicht ANC-1 and SYNE1 homology) de 30 acides aminés dédié à la liaison aux protéines SUN. L'extremité N-terminale des nesprines leur permet de se fixer directement ou indirectement à chaque composant du cytosquelette. Ainsi les nesprines 1 et 2 peuvent lier les microfilaments d'actine. La nesprine 3 lie les filaments intermédiaires via la plectine et la nesprine 4 lie les microtubules par l'intermédiaire de la kinésine (Crisp M. ., et al., 2005; Haque F., et al., 2006, Wang N., et al., 2009; Ostlund C., et al., 2009). Les microtubules peuvent aussi être liés à la membrane externe du noyau en passant par la dynéine et une autre protéine comportant le domaine KASH, Zyg12b (FigI.4) (Burke B., et al., 2009).. OPQRTU:. Schéma du complexe LINC: repris et simplifié de l'article de Burke B., et al., 2009.. Les protéines SUN sont intégrales à la membrane interne du noyau. Elles sont liées au domaine KASH du côté de la membrane externe du noyau et à la lamina nucléaire (via la lamine A) du côté interne (Ostlund C., et al., 2009). La torsine A aurait aussi un rôle à jouer dans la liaison du cytosquelette au nucléosquelette grâce à son affinité avec le domaine KASH (Nery F.C., et al., 2008).Ces protéines jouent un KM.

(26) rôle dans le positionnement du noyau, la localisation du centromère, la position des télomères et l'apoptose (Hodzic D.M., et al., 2004; Tzur Y.B., et al., 2006). Le complexe LINC, de part sa liaison physique avec le cytosquelette constitue un acteur essentiel dans la mécanotransduction. I.6 Mécanotransduction: La mécanotransduction cellulaire correspond à la capacité de la cellule à identifier des propriétés physiques de son environnement, à les intégrer et à y répondre. Ces propriétés physiques peuvent être incarnées par la rigidité du substrat, la topographie mais aussi par des stress mécaniques. La mécanotransduction est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme le changement de forme, la différenciation, la croissance, la prolifération et l'apoptose (Vogel V. et Sheetz M., 2006; Dahl K.N., et al., 2008; Jaalouk D.E. et Lammerding J., 2009; Schwartz U.S. et Gardel M.L., 2012). Cette mécanotransduction est caractérisée la plupart du temps par la conversion d'informations physiques en signaux chimiques qui en général influencent l'expression génique (Wang N., et al., 2009). Trois types de mécanotransduction sont actuellement décrites en fonction de la transduction qu'emploie la cellule pour adapter sa réponse aux facteurs environnementaux. La première est l'ouverture de canaux ioniques suite au stress mécanique, la seconde est l'initiation d'une cascade de signalisation et la troisième emprunte un pont physique entre les points focaux et la chromatine. La mécanotransduction impliquant les canaux ioniques a déjà été décrites dans de nombreux travaux. Dans ce cas, un stress mécanique entraine l'ouverture de canaux ioniques situés sur les membranes nucléaires (Tamada M., et al., 2004). Cette ouverture provoque l'entrée et ou la sortie d'ions qui est suivie d'une réponse cellulaire. L'exemple le plus connu implique l'entrée de calcium dans les cellules musculaires, ce qui constitue un signal pour la contraction cellulaire (Hall M.T., et al., 1977). Ce type de mécanotransduction existe aussi dans le cartilage et les cellules des vaisseaux sanguins (Jaalouk D.E. et Lammerding J., 2009). De très nombreuses mécanotransductions initiant des cascades de signalisation ont déjà été décrites (Vogel V. et Sheetz M., 2006; Na S., et al., 2008; Jaalouk D.E. et Lammerding J., 2009). Ce type de transduction nécessite la formation d'un point focal. En fonction des intégrines ou cadhérines qui sont sollicitées, un complexe protéinique est recruté à la membrane (zyxine, Src, taline, vinculine) et initie une VW.

(27) cascade de réaction (FigI.4) (Schwartz U.S. et Gardel M.L., 2012). Diverses enzymes sont impliquées dans ces transductions du signal telles que des protéines G et des kinases (Wang N., et al., 2009). Récemment, de nouveaux acteurs impliqués dans les cascades de réactions des mécanotransductions ont été identifiés. En effet YAP et TAZ semblent interagir en réponse à un stress physique (rigidité ou topographie) avec Hippo, TGFβ et Wnt qui sont impliquées dans diverses fonctions cellulaires (Morgan J.T., et al., 2013). Dans ce type de mécanotransduction, la transcription du signal mécanique ou physique en signal chimique s'effectue au niveau de la membrane plasmique (Tamada M., et al., 2004). Le modèle de mécanotransduction le plus récemment décrit est basé sur un lien physique entre la matrice extracellulaire et la chromatine. En effet, la matrice extracellulaire est liée à la cellule via les points focaux. Le cytosquelette est fixé d'une part sur les points focaux et d'autre part à l'enveloppe nucléaire par l'intermédiaire du complexe LINC. Et enfin ce complexe LINC est lié à la lamina nucléaire et à la chromatine (FigI.5). Ce lien physique entre l'extérieur de la cellule et. Z[\]^_:. Mécanotransduction cellulaire: A gauche, un exemple de mécanotransduction par lien physique du noyau à la matrice extracellulaire. A droite un exemple de mécanotransduction par cascades de réactions. Repris dans l'article de Jaalouk D.E. et Lammerding J., 2009.. l'intérieur du noyau permet la transduction très rapide de signaux et donc des réponses cellulaires presque instantanées à des stimuli mécaniques externes (Na S., et al., 2008; Dahl K.N., et al., 2008; Wang N., et al., 2009; Starr D.A., 2009; Venkatesan Lyer K., et al., 2012). Ce type de transduction du signal, même émanant XY.

(28) de faibles stress mécaniques peut aussi influencer rapidement la signalisation au pôle opposé de la cellule (Wang N., et al., 2009). L'actine et la myosine sont décrits comme impliqués dans ce type de mécanotransduction. En effet, leur inhibition provoque des mouvements chromosomiques (Wang N., et al., 2009; Chancellor T.J., et al., 2010; Nagayama K., et al., 2011). Les filaments intermédiaires semblent aussi impliqués dans ce type de mécanotransduction car leur inhibition bloque le couplage mécanique entre le milieu extracellulaire et le noyau (Wang N., et al., 2009). L'activation de la kinase Src est un exemple de l'intérêt de ce type de mécanotransduction au sein de la cellule. Ainsi, cette kinase peut être activée à des distances de plus de 50µm en moins de 300ms alors que l'activation de cette même kinase nécessite 40 fois plus de temps par l'intermédiaire de facteurs de croissance et donc de cascades de réactions (Wang N., et al., 2009). La mécanotransduction est impliquée dans la majorité des fonctions cellulaires. Son étude est donc primordiale. L'utilisation de matériaux avec des propriétés chimiques et physiques contrôlées est une approche efficace permettant de mieux décrire la mécanotransduction cellulaire. I.7 Matériaux dédiés à la biologie cellulaire: L'emploi de matériaux avec des propriétés physiques et chimiques contrôlées représente actuellement un moyen unique permettant à de nombreuses équipes de recherche de répondre à des questions biologiques jusque là insoluble. L'environnement d'une cellule conditionne la quasi totalité de ses fonctions. C'est pourquoi des chercheurs fabriquent des supports avec des chimies, géométries (2D), rigidités et topographies contrôlées, ils souhaitent par ce biais, caractériser, initier ou contrôler les fonctions cellulaires. Le contrôle de la chimie du milieu extracellulaire contribue à l'identification de molécules avec lesquelles la cellule a de l'affinité et donc auxquelles elle peut se lier (Anselme K., et al., 2010). Hersel U., et al., ont par exemple utilisé le peptide RGD qui stimule l'adhésion cellulaire (Hersel U., et al., 2003). L'utilisation de substrats avec des chimies contrôlées facilite la caractérisation de l'adhésion et de l'étalement cellulaire (Diener A., et al., 2005). Cavalcanti-Adam E.A., et al., et HirschfeldWarneken V.C., et al., ont prouvé que l'organisation et l'espacement à l'échelle moléculaire des sites d'ancrage de la cellule avaient un rôle primordial dans l'adhésion. Ils ont pu définir la distance maximale (58nm) entre deux ligands. `a.

(29) permettant la construction d'un point focal (Cavalcanti-Adam E.A., et al., 2007; Hirschfeld-Warneken V.C., et al., 2008). La géométrie des zones d'adhésion cellulaire détermine en partie les comportements cellulaires. En effet, différentes équipes de recherche ont pu, grâce à la création de motifs à géométrie contrôlée, prédire des phénotypes cellulaires, orienter des mitoses ou encore caractériser des déformations cellulaires (FigI.6) (Théry M., et al., 2006; Théry M., et al., 2007; Pitaval A., et al., 2010; Versaevel M., et al., 2012; Vignaud T., et al., 2012; Grevesse T., et al., 2012). Jiang X., et al., ont montré qu'ils arrivent à contrôler la direction de la migration de fibroblastes grâce à la culture de cellules sur une géométrie en forme de goutte d'eau (Jiang X., et al., 2005). McBeath R., et al., ont prouvé, grâce à des motifs à géométrie contrôlée, que la forme de la cellule souche mésenchymateuse est un facteur décisif à leur différenciation. Ainsi, les cellules rondes s'orientent vers un phénotype adipeux alors que les cellules étalées acquièrent des propriétés de cellules osseuses (McBeath R., et al., 2004).. defghi:. Motifs géométriques permettant de contrôler l'orientation de la mitose: Schéma repris et simplifié de l'article de jklmn o., et al., 2007.. La rigidité de l'environnement cellulaire est actuellement définie comme un facteur clé dans le devenir cellulaire (Swift J., et al., 2013). En effet, différentes équipes de recherche ont utilisé des matériaux à rigidité contrôlée pour montrer que ce paramètre physique est impliqué dans l'adhésion, l'étalement, la migration mais aussi la différenciation cellulaire (Pelham R.J. et Wang Y.L., 1997; Lo C.M., et al., 2000; Engler A.J., et al., 2004; Discher D., et al., 2005; Yeung T., et al., 2005; Engler A.J., bc.

(30) et al., 2006; Levental I., et al., 2007; Kocgozlu L., et al., 2010). La fabrication de substrats souples dédiés à la culture cellulaire a aussi permis l'évaluation des forces qu'applique la cellule sur son environnement. Par exemple, Hersen P. et Ladoux B. ont inséré des particules fluorescentes au sein de substrats souples et ont observé le déplacement de ces particules provoqué par les cellules. Cette approche a permis de montrer la nature et la direction des forces appliquées par les cellules sur le substrat lors de leur adhésion (Hersen P. et Ladoux B., 2011). La topographie représente aussi un paramètre physique très important dans l'environnement cellulaire. De nombreuses équipes de recherche ayant créé des matériaux à topographie bien définie ont montré que les cellules sont sensibles à la structure tridimensionnelle (pics, piliers, trous, lignes, tubes, etc...) de leur environnement, de l'échelle du nanomètre jusqu'au micromètre. La topographie est primordiale pour définir la forme, l'adhésion, l'orientation, la migration et la différenciation de la cellule (FigI.7) (Lauer G., et al., 2001; Su W.T., et al., 2006; Steinberg T., et al., 2007; Rebollar G., et al., 2007; Chalut K.J., et al., 2010; Poellmann M.J., et al., 2010; Matschegewski C., et al., 2010; Berthing T., et al., 2012; Sjöström T. ., et al., 2013). Certaines équipes utilisent des surfaces à topographie contrôlée comme outil pour caractériser des propriétés ou des fonctions cellulaires (Velve-Casquillas G., et al., 2009). Les micro-canaux ou systèmes micro-fluidiques sont un exemple de structures tridimensionnelles utilisées pour caractériser des propriétés cellulaires. Scianna M et Preziosi L., et Beta C. et Bodenschatz E. les ont utilisés respectivement pour caractériser l'implication du noyau cellulaire dans l'invasion cancéreuse et pour étudier la chimiotaxie (Scianna M et Preziosi L., 2012; Beta C. et Bodenschatz E., 2011). Sniadecki N.J., et al., ont utilisé une microtopographie sous forme de piliers contenant du cobalt. Ces micro-piliers ont la particularité de pouvoir se fléchir sous stimulation magnétique. Ces mouvements de piliers exercent localement des pressions sur la membrane plasmique permettant l'étude de la méchanotransduction cellulaire (Sniadecki N.J., et al., 2007). Les surfaces couvertes de micro-piliers ont aussi été utilisées dans le but d'évaluer les forces appliquées par les cellules sur leur environnement (Tan J.L., et al., 2003). Pour cela, Roure O., et al., observent et mesurent les mouvements des piliers provoqués par les cellules au cours de leur migration (Roure O., et al., 2004).. pp.

(31) stuvwx:. Observation par microscopie électronique à balayage et à différents temps de culture de l'effet de micro-ytzt{|} sur les comportements cellulaires: Les auteurs concluent que les piliers affectent la forme, l'orientation et la migration cellulaire (Su W.~., et al., 2006).. Des matériaux de nature activable ont aussi été développés pour la biologie cellulaire. Ainsi, Goldyn A.M., et al., ont fabriqué un support étirable permettant l'étude de l'alignement de cellules soumises à un étirement uni-axial (Goldyn A.M., et al., 2010). Dans un autre registre, Da Silva R.M.P., et al., ont développé un substrat pour décrocher des cellules en culture. En effet, les auteurs ont mis à profit le polymère poly(N-isopropylacrylamide) qui, par augmentation de la température, précipite, devient hydrophobe et provoque le détachement cellulaire (Da Silva R.M.P., et al., 2007). L'utilisation de matériaux pour des études en biologie n'est pas nouvelle. En effet, Boyden S. en 1962 a décrit l'utilisation d'une membrane poreuse délimitant verticalement deux compartiments. Son objectif premier a été l'étude de la chimiotaxie. Pour cela il a placé des cellules dans le compartiment supérieur, ajouté un chimioattractant dans le compartiment inférieur et après incubation a compté les cellules ayant migré (Boyden S., 1962). Ce principe de membrane poreuse a été mis à profit par de nombreux chercheurs en biologie et son appellation a évolué pour chambre de Boyden ou test de transmigration. En effet, la chambre de Boyden est toujours utilisée pour étudier la chimiotaxie et son utilisation a été étendue pour caractériser ou quantifier des migrations cellulaires (Lund N., et al., 2010; Kramer N., et al., 2012). Ces migrations à travers la membrane poreuse sont aussi nommées transmigrations (Leroy-Dudal J., et al., 2005). Les mécanismes engagés par les qr.

(32) cellules pour traverser la membrane poreuse (déformations, migrations) ont beaucoup de similarités avec ceux utilisés par les cellules cancéreuses lors de l'invasion. C'est pourquoi des chercheurs l'utilisent dans le but d'évaluer l'agressivité des cellules cancéreuses (Wang F.S., et al., 2011). L'utilisation de matériaux avec des propriétés chimiques et physiques contrôlées est donc aussi une approche importante permettant de mieux comprendre le cancer. I.8 De la cellule saine à la métastase: Le cancer est actuellement un problème de santé publique important. Selon le rapport "La situation du cancer en France en 2012" édité par l'Institut National du Cancer, 365000 nouveaux cas de cancers et 147500 décès ont été estimés en France en 2011. Le cancer n'est pas nouveau, il a déjà été observé 1500 ans avant JC par les Egyptiens. Il est caractérisé par la transformation d'une cellule saine en une cellule maligne. Cette transformation pluri-étapes est basée sur une instabilité génétique (NGuyen D.X. et Massagué J., 2007). Cette instabilité aboutit, par accumulation de mutations, à l'activation d'oncogènes et au blocage de gènes suppresseurs de tumeur. Ces modifications conduisent à des gains et pertes de fonctions cellulaires (Hanahan D. et Weinberg R.A., 2000). L'avancement du cancer rappelle la théorie de l'évolution selon Darwin. En effet, le cancer provient de modifications génétiques successives conférant des avantages aux cellules modifiées. Ces avantages permettent aux cellules devenues cancéreuses de prendre le pas sur les cellules voisines (Hanahan D. et Weinberg R.A., 2000). Les cellules en cours de cancérisation subissent donc de multiples mutations aléatoires à divers endroits de leur ADN pouvant aboutir à un phénotype malin (NGuyen D.X. et Massagué J., 2007). Les multiples mutations aboutissent à l'acquisition et à la perte de fonctions qui définissent un comportement cancéreux. Hanahan D. et Weinberg R.A. ont réunis ces fonctions sous 6 altérations physiologiques: l'auto-suffisance en facteurs de croissance, l'insensibilité aux facteurs d'inhibition de la croissance cellulaire, l'échappement au mécanisme de mort cellulaire (apoptose), un potentiel réplicatif illimité, une sollicitation de l'angiogenèse et la possibilité d'envahir des tissus et de créer des métastases (FigI.8) (Hanahan D. et Weinberg R.A., 2000). Plus. .

(33) :. Fonctions touchées dans les cellules cancéreuses: Hanahan D. et Weinberg R.A., 2000. explicitement, des cellules normales sont soumises à la signalisation extracellulaire. C'est à dire que sans signaux de croissance une cellule normale ne prolifère pas alors que les cellules cancéreuses s'en affranchissent et prolifèrent de façon accrue. De plus, une cellule saine soumise à des signaux d'inhibition de croissance ou d'apoptose réagit en conséquence alors que la cellule cancéreuse y est insensible (NGuyen D.X. et Massagué J., 2007). Par ailleurs, la prolifération intense des cellules cancéreuses associé à leur insensibilité à l'apoptose conduit à la formation de tumeurs (amas cellulaire). Les tumeurs ne sont pas un amas homogène de cellule cancéreuses. En effet, elles contiennent de multiples sous-populations résultant des différentes mutations (origine clonale) et de cellules souches cancéreuses (Visvader J.E. et Lindeman G.J., 2008; Mayol J.F., et al., 2009). Cette hétérogénéité constitue une barrière importante au traitement du cancer (Fidler I.J., 2002). Les cellules cancéreuses au sein des tumeurs sont soumises à des stress acides et hypoxiques causé par le grand nombre de cellules qui la compose (NGuyen D.X. et Massagué J., 2007). Pour y pallier, elles stimulent la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Ce processus est nommé angiogenèse (Goodwin A.M., 2007). Ce mécanisme permet d'apporter de l'oxygène en plus grande quantité et potentialise encore la progression du cancer. La cancérisation peut aussi mener à l'acquisition de propriétés métastatiques par les cellules tumorales (Thierry J.P., 2002).. .

(34) La métastase représente le stade ultime de la cancérisation. Elle correspond à une cellule cancéreuse issue d'une tumeur primaire qui s'est échappée et qui a réussi à s'installer dans un autre tissu de l'organisme (Gupta G.P. et Massagué J., 2006).. :. Cheminement des cellules métastatiques: Schéma repris de l'article de NGuyen D.X. et Massagué J., 2007. L'échappement des cellules cancéreuses dans le cas d'un carcinome est souvent initié par une transition épithélio-mésenchymateuse. Cette transition cellulaire correspond à la perte des propriétés des cellules épithéliales au profit des caractéristiques des cellules mésenchymales. Parmi ces caractéristiques, les cellules cancéreuses acquièrent la capacité de migrer. (Christofori G., 2006; Nguyen D.X. et Massagué J., 2007). La métastase est rare au sein de l'organisme. En effet, la majorité des cellules s'échappant de la tumeur primaire meurent rapidement, ne supportant pas les changements d'environnement. Pourtant la métastase est la cause de la mort dans 90% des cas de tumeurs solides (Nguyen D.X. et Massagué J., 2007). La caractérisation de ces cellules est donc primordiale. La cellule métastatique s'échappant de la tumeur primaire emprunte les voies lymphatiques, la .

(35) circulation sanguine ou suit les nerfs dans le but d'envahir d'autres tissus au sein de l'organisme. Elle doit donc franchir les étapes d'intravasation, de survie dans la circulation, de diffusion dans un tissu distal, d'extravasation, et de colonisation de l'organe cible pour être considérée comme métastatique (FigI.9) (Steeg P.S., 2006; NGuyen D.X. et Massagué J., 2007). Plusieurs théories existent sur la façon dont une cellule métastatique cible un organe hôte. Il semblerait que les propriétés de la tumeur primaire soient décisives. Toutefois elles ne permettent pas actuellement de prédire où se logeraient d'éventuelles métastases. Les multiples mutations aboutissant au phénotype cancéreux ne modifient pas que les fonctions cellulaires. Les propriétés mécaniques sont aussi affectées. I.9 Propriétés mécaniques des cellules cancéreuses: Les propriétés mécaniques d'une cellule proviennent essentiellement de son noyau et du cytosquelette. Ces propriétés sont essentielles dans de nombreuses fonctions cellulaires comme l'homéostasie, la croissance, la division et la motilité (Fuhrmann A., et al., 2011; Swift J., et al., 2013). Lors de la cancérisation, les lamines à l'origine de la rigidité du noyau et le cytosquelette sont touchés directement (Suresh S., 2007; Willis N.D., et al., 2008). Les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses sont donc modifiées. Toutefois les différents travaux tentant de caractériser ces modifications donnent des informations contradictoires (Suresh S., 2007). En effet, certains travaux insistent sur l'augmentation de la rigidité des cellules cancéreuses. Ces augmentations de rigidité seraient dues à une tension intracellulaire plus grande (Zhang G., et al., 2002; Paszek M.J., et al., 2005). D'autres études montrent que les cellules lors de la cancérisation deviendraient plus souples. Ces baisses de rigidités seraient imputables entre autre à la diminution de la quantité d'actine dans les cellules cancéreuses (Ochalek., et al., 1988; Lekka M., et al., 1999; Rosenbluth M.J., et al., 2006). Toutefois, de nombreux travaux s'accordent sur le fait que les cellules cancéreuses acquerraient des propriétés élastiques particulières leur permettant de pouvoir se déformer de façon beaucoup plus importante que les cellules saines (Yao W., et al., 2003; Beil M., et al., 2003; Guck J., et al., 2005; Rolli C.G., et al., 2010). Les divergences d'opinion sur les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses peuvent avoir plusieurs explications. En effet, le cancer est par définition très divergent. Les différentes mutations pourraient donc être à l'origine de ces différences de propriétés. Par ailleurs, les cellules sont sensibles à leur ¡.

(36) environnement extracellulaire et en particulier à sa rigidité. La matrice extracellulaire entourant chaque tumeur est donc un facteur clé à prendre en compte dans la caractérisation des propriétés mécaniques des cellules cancéreuses (Beil M., et al., 2003). Enfin, il semblerait que les noyaux des cellules cancéreuses deviendraient plus souples alors que le cytosquelette s'organiserait afin de créer une tension intracellulaire forte (Paszek M.J., et al., 2005; Suresh S., 2007; Fuhrmann A., et al., 2011). Dans ce cas, la cellule cancéreuse est identifiée comme plus ou moins souple en fonction de la technique d'analyse privilégiée (Suresh S., 2007). Différentes hypothèses pouvant expliquer la capacité des cellules cancéreuses à s'échapper d'une tumeur primaire émergent donc de ces différentes observations. Certains chercheurs prétendent que les cellules cancéreuses deviennent plus souples et peuvent donc mieux se déformer pour envahir tout l'organisme (Rolli C.G., et al., 2010). D'autres privilégient la thèse de l'effondrement cellulaire qui permettrait aussi d'aboutir à l'invasion (Fuhrmann A., et al., 2011). II. Matériels, méthodes et mises au point: ¤¤¥¦¥ §¨©ª«¬¨«®¯ °± ²³ª. faces constituées de micro-piliers en PLLA et en PDMS:. La fabrication des substrats à la base de ce travail nécessite trois étapes. La première est la micro-fabrication de supports de silicium, la seconde est l'utilisation de ce silicium pour mouler des répliques en PDMS (polydiméthyl siloxane). La troisième étape s'effectue à partir du moule de PDMS et est soit un gaufrage de film de PLLA (Poly-L-Lactic Acid) soit le coulage d'une formulation de PDMS pour la fabrication des piliers en élastomère. II.1.1 Supports de silicium: Les topographies des échantillons ont été imaginées et dessinées au sein de notre équipe par Patricia Davidson. Les différents reliefs consistent essentiellement en des piliers carrés mesurant 2 à 20µm et espacés de 2 à 20µm. La hauteur des piliers est toujours la même et se situe entre 5 et 6µm. La fabrication a été effectuée dans le cadre d'une collaboration avec l'IMTEK à Freiburg au sein du groupe du Dr Jürgen Rühe.. ¢£.

(37) II.1.2 Moules de PDMS: Les substrats de silicium étant recouverts d'une couche protectrice, un traitement avec une solution d'acétone/isopropanol/eau a été nécessaire afin de la retirer. Après avoir été séchés à l'air libre, les supports ont été déposés dans une coupe en aluminium. Le PDMS provenant d'un kit fourni par Dow Corning (Sylgard 184 Midland USA) est ensuite formulé par ajout d'agent réticulant et de polymère dans des proportions variant entre 1/5 à 1/20 selon les besoins. Cette formulation a été ensuite déposée sur le substrat de silicium et après 30min, le temps que toutes les bulles s'échappent de l'élastomère, la coupe en aluminium a été déposée sur une plaque chauffée à 150°C pendant 1h. Le moule de PDMS complètement réticulé est ensuite facilement démoulé après refroidissement à température ambiante (figII.1) II.1.3 Supports micro-structurés de PLLA: Le PLLA (Resomer L 210, Boehringer Ingelheim) se présente sous forme de granules. Ces grains sont dissous dans une solution de dichlorométhane à raison de 2mg/cm2, puis une évaporation pendant 24h permet l'obtention de films fins de PLLA. Les films de PLLA sont découpés en carrés de 1cm 2 et placés entre le moule de PDMS et un morceau de silicium recouvert de PDMS. Le sandwich ainsi obtenu est déposé sur une plaque chauffée à 220°C et pressé manuellement pendant 10sec avant d'être plongé dans un bain d'eau froide. Le PLLA devient vitreux, il peut alors être détaché du moule de PDMS (figII.1). Les substrats de PLLA plats (sans piliers) ont été préparés de la même manière avec des supports en PDMS plats. II.1.4 Supports micro-structurés de PDMS: La fabrication des répliques de PDMS à partir du moule de PDMS a nécessité la préparation d'un système permettant un démoulage vertical. Pour cela, une coupelle d'aluminium a subi un découpage dont la taille a été ajustée à la zone d'intérêt. Le récipient troué a ensuite été couvert de parafilm sur sa base extérieure afin de faire un joint qui empêche le PDMS non réticulé de couler dans les zones non désirées. La coupelle découpée ainsi préparée a été déposée sur le moule PDMS en mettant en regard l'orifice et la zone à répliquer. Une formulation de PDMS, préparée comme décrit précédemment a pu alors être ajoutée sur le système. Le montage a été incubé 24h à température ambiante puis chauffé 1h à 250°C sur une plaque chauffante. Après refroidissement à température ambiante, le support de PDMS ´µ.

(38) néoformé a été démoulé de façon verticale afin qu'aucun pilier ne soit brisé sous une contrainte mécanique transversale (figII.1).. ÄÅÆÇÇÈÉ:. Fabrication des micropiliers en PLLA et en PDMS: Les premières étapes (a) à e)) sont commÊËÌÍ ÎÏ ÐÑÒÓÔ ÕÊ ÍÖ×ÖØÖÊÙ ÙÖØÚÛ -ÜÎÝÚÖÞÊÑÌ dans une coupelle d'aluminium. b) Ajout d'une formulation de PDMS. c) Chauffage 1h à 150°C. d) Récupération du PDMS avec le silicium. e) Démoulage du silicium. Ensuite pour le PLLA, f) Mise en place du sandwich moule PDMS/PLLA/Silicium. g) Pression du sandwich sur plaque chauffante. h) Refroidissement rapide dans l'eau froide. i) Retrait du silicium. j) Démoulage du PLLA. Enfin pour la réplique PDMS: après l'étape e), k) Dépôt du moule de PDMS dans une coupelle. l) Ajustement d'une autre coupelle découpée à sa base. m) Ajout de la formulation de PDMS, attente de 24h à température ambiante puis 1h à 250°C. n) Démoulage vertical. o) Retrait de la coupelle. ß). ¸¹. Silice º»¼½¾ ¿À¼ÁÂÃÂ¼Á. b). PDMS Plaque chauffante PLLA. c). d) e). àá. l). g). m). h) n). i). o). j). ¶·.