3.1. Préparation des échantillons protéiques
Les cellules sont cultivées en normoxie en flasques de 25 cm2 ou plaques 6 puits et irradiées à 10 Gy puis placées à 37°C en conditions normoxiques ou hypoxiques pendant différents temps allant de 30 minutes à 24 heures.
o Pour la cinétique HIF-1α, les 4 sous-populations SQ20B CD44Low, SQ20B-CSCs, FaDu CD44Low et FaDu-CSCs, ont été irradiées ou non à 10 Gy avec des photons ou des ions carbone puis placées de 30 minutes à 24 heures en conditions normoxiques ou hypoxiques.
o Pour la cinétique des marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse (E-Cadhérine, N-Cadhérine, Vimentine) et des marqueurs du caractère souche (Snail et Twist), les cellules des 4 sous-populations SQ20B CD44Low, SQ20B-CSCs, FaDu CD44Low et FaDu-CSCs ont été incubées pendant 0, 6, 12 et 24 heures en hypoxie aiguë.
Les cellules sont ensuite lavées au PBS puis lysées pendant 30 minutes sur glace dans un tampon contenant 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 8, 1 % de Triton X-100, des anti-protéases 1X (Complete Mini, Roche) et des anti-phosphatases 1X (PhosphaSTOP, Roche). Après grattage de la monocouche cellulaire, l’homogénat est récupéré puis lysé mécaniquement après de multiples aspirations à travers une aiguille de calibre 21 G1/2. Le lysat est ensuite incubé 30 minutes supplémentaires sur glace avant d’être centrifugé à 15 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Les culots de lysats protéiques ainsi que leur surnageant sont séparés en deux tubes eppendorfs de 1,5 mL et conservés à -80°C jusqu’à l’analyse. Un aliquote de 10 μL de lysat protéique est prélevé afin de doser les protéines totales.
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3.2. Dosage des protéines
Les protéines sont dosées par la méthode à l’acide bicinchoninique (BCA). Pour chaque condition, le dosage est réalisé en duplicat, à partir de 3 μL de lysat protéique et d’un mélange constitué de 800 μL d’une solution d’acide bicinchoninique/CuSO4 (Sigma), 100 μL de SDS 0,5 % et 97 μL d’eau distillée. Parallèlement, une gamme étalon composée de quantités croissantes allant de 0 μg.μL-1 à 80 μg.μL-1 de BSA (Bovin Serum Albumin, Sigma) est établie. Après une incubation à 37°C pendant 30 minutes, l’intensité de la coloration est mesurée à une longueur d’onde de 562 nm par spectrophotométrie (Multiskan Spectrum, Thermo, plateforme CERVO). Une courbe de dosage a ainsi été établie à partir des échantillons de la gamme de calibration.
3.3. Western-blot
Les lysats protéiques sont dilués dans un tampon dénaturant (125 mM de Tris pH 6,8, 2 % de SDS, 5 % de mercapto-éthanol et 0,05 % de bleu de bromophénol). Les protéines sont ensuite dénaturées à 100°C pendant 5 minutes et conservées sur glace avant d’être déposées sur un gel de polyacrylamide. Les gels de polyacrylamide sont composés d’un gel de concentration et d’un gel de séparation des protéines dont la concentration en acrylamide/bisacrylamide (Sigma) est fonction du poids moléculaire des protéines à séparer. Les protéines de poids moléculaire inférieur à 20 kDa ont été séparées avec un gel à 14 %, de 20 à 40 kDa avec un gel à 12 % et les protéines dont le poids moléculaire est supérieur à 40 kDa avec un gel à 10 %.
Trente microgrammes de protéines ainsi que le marqueur de poids moléculaire Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards (BD), qui permet d’étudier la migration des protéines de 10 à 250 kDa sont déposés dans les puits de chaque gel. La migration s’effectue ensuite à 130 Volts pendant 90 minutes dans du tampon d’électrophorèse (25 mM de Tris, 192 mM de glycine et 0,1 % de SDS). Les protéines du gel sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose pendant 7 à 10 minutes à 2,5 ampères, à l’aide d’un Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (BioRad).
La membrane de nitrocellulose est incubée pendant 1 heure dans une solution de blocage (5 % de lait écrémé et 0,05 % de Tween 20 dans du TBS ou du PBS en fonction de la protéine à marquer) à température ambiante et sous agitation modérée. La membrane est ensuite incubée avec l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage correspondante, pendant une nuit à 4°C (Tableau 11).
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Tableau 11 : Anticorps primaires utilisés pour les analyses par Western-Blot
Anticorps Poids moléculaire Espèce Dilution
E-Cadhérine
(BD Transduction) 120 kDa Souris 1 :10 000
GAPDH
(BD Transduction) 32 kDa Souris 1 :100 000
HIF-1α
(BD Transduction) 120 kDa Souris 1 :500
N-Cadhérine
(BD Transduction) 130 kDa Souris 1 :3 000
Snail
(Novus Biologicals) 45 kDa Lapin 1 :500
Twist 1
(Abcam) 21 kDa Souris 1 :50
Vimentine
(Santa-Cruz Biotechnologies) 55 kDa Souris 1 :200
La membrane est ensuite lavée à 3 reprises pendant 5 minutes dans la solution de lavage dédiée puis incubée avec l’anticorps secondaire de l’espèce correspondante pendant 90 minutes à température ambiante. L’anticorps secondaire (anti-Ig G de souris ou de lapin) conjugué à la peroxydase (Santa Cruz) est dilué au 1:7 000 dans la solution de blocage précédemment utilisée. La membrane est à nouveau lavée 3 fois dans la solution de lavage pendant 5 minutes à température ambiante.
La membrane de nitrocellulose est incubée pendant 3 minutes à l’obscurité avec un révélateur standard (Supersignal® West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo) pour la GAPDH ou un révélateur de haute sensibilité (Clarity™ Western ECL Substrate, Bio-Rad) pour les autres protéines. Les signaux chimioluminescents révélant la présence de protéines spécifiques ont été mesurés par balayage densitométrique de la membrane dans une boîte noire Azure C300 (Biosystems Inc.) ou à l’aide du LAS-3000 Intelligent Dark Box (Fujifilm), pendant un temps variable selon la protéine à révéler (de quelques secondes pour la GAPDH à une dizaine de minutes pour HIF-1α). Les expressions protéiques ont été quantifiées avec le logiciel MultiGauge (FujiFilm) et normalisées par rapport à la GAPDH.
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3.4. Quantification des métalloprotéases (MMP) de type 2 et 9
Les lysats protéiques ont été obtenus et dosés comme décrit dans le paragraphe 3.1. Les lysats ont été réalisés en conditions normoxiques pour les 4 sous-populations SQ20B CD44Low, SQ20B-CSCs, FaDu CD44Low et FaDu-CSCs. Pour les 2 sous-populations de CSCs, des lysats ont été réalisés 2 et 6 heures après irradiation de 10 Gy avec des photons ou des ions carbone en conditions normoxiques et hypoxiques. Les concentrations de MMP2 et MMP9 ont été déterminées par technique Elisa avec les kits Quantikine Total MMP-2 et MMP9 Immunoassay® (R & D Systems), au sein du Service de Biochimie et Biologie Moléculaire du Centre de Biologie et d’Anatomo-Pathologie de Lyon-Sud. Dans une plaque 96 puits du kit, 50 μL du diluant dédié ont été ajoutés dans chaque puits ainsi que 50 μL d’échantillon, de contrôle ou de calibrant fournis. La plaque est ensuite incubée pendant 2 heures sous agitation à température ambiante. Les puits sont lavés 4 fois avec la solution de lavage fournie. L’étape suivante a consisté en une incubation de chaque puits avec 200 μL de solution d’un réactif conjugué pendant 2 heures à température ambiante, suivie de 4 lavages. Enfin, 200 μL de substrat ont été incubés pendant 30 minutes à l’abri de la lumière, sous agitation et à température ambiante. La réaction est stoppée par 50 μL de STOP Solution du kit et le signal est ensuite lu à 450 nm sur un spectrophotomètre. Les concentrations de MMP2 ont ensuite été normalisées en fonction des concentrations protéiques totales de chaque échantillon. Chaque condition a été répétée au minimum deux fois en triplicat.
3.5. Profil de phosphorylation des kinases impliquées dans la transition épithélio-mésenchymateuse
Les lysats protéiques ont été obtenus comme décrit précédemment en conditions normoxiques ou hypoxiques et 6 heures après une irradiation photonique ou par ions carbone de 10 Gy dans les deux conditions d’oxygénation. Les protéines totales ont été dosées sur un aliquote. Le kit Human-Phospho-Kinase Array (R & D Systems) a été utilisé pour comparer les profils de phosphorylation de 43 kinases dans les populations SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en réponse aux irradiations photoniques et par ions carbone en conditions normoxiques et hypoxiques (Tableau 12).
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Tableau 12 : Principales phospho-kinases étudiées avec le kit Human Phospho Kinase et leurs principaux sites de phosphorylation
Phospho-kinases étudiées et principaux sites de phosphorylation
Akt (S473) Hck (Y411) PRAS40 (T246)
Akt (T308) HSP27 (S78/S82) PYK2 (Y402)
AMPK α1 (T174) HSP60 RSK1/2/3 (S380/S386/S377)
AMPK α2 (T172) JNK pan (T183/Y185, T221/Y223) Src (Y419)
β-Caténine Lck (Y394) STAT2 (Y689)
Chk2 (T68) Lyn (Y397) STAT3 (S727)
c-Jun (S63) MSK1/2 (S376/S360) STAT3 (Y705)
CREB (S133) p27 (T198) STAT5a (Y694)
EGF R (Y1068) p38 α (T180/Y182) STAT5a/b (Y694/Y699)
eNOS (S1177) p53 (S15) STAT5b (Y699)
ERK1/2 (T202/Y204, T185/Y187) p53 (S46) STAT6 (Y641)
FAK (Y397) p53 (S392) TOR (S2448)
Fgr (Y412) p70 S6 Kinase (T421/S424) WNK-1(T60)
Fyn (Y420) PDGF R β(Y751) Yes (Y426)
GSK-3 α/β (S21/S9) PLC gamma-1 (Y783)
Le protocole expérimental a été utilisé tel que recommandé par le fabricant. Les 2 membranes d’intérêt pour chaque échantillon, A et B, ont été incubées pendant 1 heure à température ambiante sous agitation dans une solution de blocage (Array Buffer 1). Cinq cent microgrammes de protéines ont été mis en suspension dans 2 mL d’Array Buffer 1 et 1 mL déposé sur chaque membrane, puis incubé une nuit à 4°C sous agitation. Les membranes ont ensuite été lavées 3 fois pendant 10 minutes sous agitation avec 10 mL de tampon de lavage 1X. Les membranes ont été incubées pendant 2 heures à température ambiante sous agitation avec 20 μL d’anticorps primaire fourni dans le kit et repris dans 980 μL d’Array Buffer 2/3 1X. Trois nouveaux lavages de 10 minutes ont été effectués avec la solution de lavage 1X et les membranes ont été incubées avec l’anticorps secondaire (streptavidine HRP) pendant 30 minutes, à température ambiante, sous agitation. Trois lavages de 10 minutes ont été finalement réalisés. Les signaux chimio-luminescents ont été mesurés par balayage densitométrique en utilisant une boîte noire intelligente Azure C300 (Biosystems Inc), après une incubation d’une minute avec un mélange de réactifs chimio-luminescents (0,5 mL Chemi 1 et 0,5 mL de chemi 2). Chaque kinase a été quantifiée en double (Figure 66).
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Figure 66 : Exemple de révélation des membranes du kit Human-Phospho Kinase
Après révélation, les signaux des spots obtenus en duplicat pour chaque kinase ont été quantifiés et chaque spot a été identifié au moyen d’un calque du plan des puits. Des témoins positifs et négatifs sont également présents sur chaque membrane.
Les niveaux relatifs de phosphorylation des protéines ont ensuite été quantifiés en utilisant le logiciel MultiGauge (FujiFilm) résultant en un signal exprimé en pixels/mm2 et normalisé aux témoins de la membrane. Un ratio a ensuite été établi à partir des valeurs d’intérêt et des valeurs obtenues en conditions basales en normoxie sans irradiation pour chaque lignée cellulaire.
3.6. Quantification du glutathion intracellulaire
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits à une densité de 200 000 cellules par puits et placées en normoxie pendant une nuit à 37°C. Elles ont ensuite été irradiées à une dose de 10 Gy photons ou par ions carbone puis immédiatement incubées en normoxie ou hypoxie pendant 1, 2 et 6 heures après irradiation, ce qui correspond au pic d’expression des RLO en fonction de chaque sous-population. Chaque condition a été ensemencée en triplicat afin de quantifier le glutathion et un puits supplémentaire a été réalisé afin de doser les protéines totales correspondantes. A chaque temps de cinétique, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées pendant 5 minutes avec du PBS. Les cellules ont ensuite été traitées 30 minutes à température ambiante avec 200 μL d'une solution contenant du N-éthylmaléimide 20 mM, de l’EDTA 2 mM, de l'acide L-glutamyl-L-glutamique 250 μM en tant qu’étalon interne et 1,5 % d'acide sulfo-salicylique. Le tapis cellulaire a ensuite été gratté dans chaque puits et la suspension cellulaire transférée dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL. L’échantillon a été centrifugé à 4°C pendant 10 minutes à 15 000 g et le surnageant transféré dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 mL. L’ensemble des surnageants ont été congelés immédiatement après obtention.
186 Le glutathion réduit (GSH) a été quantifié par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-SM, Agilent technologies) au sein de la plate-forme de chromatographie du Service de Biochimie et Biologie Moléculaire du CHLS. Les chromatogrammes ont ensuite été intégrés à l'aide du logiciel Chemstation (Agilent Technologies) et les concentrations en glutathion réduit (GSH) et oxydé (GSSG) déterminées. Les concentrations en GSH obtenues ont été normalisées aux quantités de protéines totales déterminées pour chaque condition afin de s’affranchir du biais induit par la quantité de cellules ensemencées.