Processus de migration, invasion et motilité cellulaires

2.3.1. Migration et invasion

2.3.1.1. Préparation des cellules

Les cellules ont été cultivées dans des flasques de 25 cm² pendant 24 heures à 37°C à une densité de 1.10⁶ cellules en normoxie ou hypoxie. Les cellules ont ensuite été incubées à 37°C pendant 20 à 24 heures dans leur milieu privé en sérum de veau fœtal et supplémenté à 0,1 % en BSA (Bovin Serum Albumin). A l’exception des flasques témoins, les flasques ont ensuite été irradiées à 2 Gy puis immédiatement trypsinées afin de quantifier les propriétés de migration et d’invasion.

2.3.1.2. Chambres de Boyden

Les chambres de Boyden (Corning^®) permettent de quantifier les capacités de chimiotactisme (migration) et d’invasion d’une lignée cellulaire. Il s’agit d’inserts dont la membrane est percée de pores de 8 μm de diamètre (Becton Dickinson®). Le processus d’invasion est quantifié lorsque l’insert est coaté avec du Matrigel BD, BioCoat™ qui mime la matrice extracellulaire. Avant l’ajout des

176 cellules, les inserts coatés avec le Matrigel sont équilibrés avec 500 μL de milieu appauvri en SVF et supplémenté à 0,1 % en BSA pendant 6 heures à 37 ° C. Ensuite, 450 μL de milieu sont retirés de l'insert (Figure 65).

Après irradiation et trypsination, 30 000 cellules sont remises en suspension dans 500 μL de milieu appauvri en SVF et supplémenté en BSA, puis transférés dans la chambre supérieure. La chambre inférieure est remplie du milieu classique. Les chambres de Boyden sont ensuite incubées à 37°C en conditions normoxiques ou hypoxiques pendant 18 heures pour les SQ20B CD44^Low et SQ20B-CSC, et 15 heures pour FaDu CD44^Low et FaDu-CSC, ce qui correspond à un temps inférieur à leur premier temps de doublement. Les cellules des inserts ont ensuite été fixées et colorées à l'aide du kit RAL 555 (VWR). La fixation se fait à l’aide du Fix-RAL 555 ; le cytoplasme est coloré par l’Eosine-RAL 555 et les noyaux sont colorés par le Bleu-l’Eosine-RAL 555. Les cellules situées sur la face supérieure de la chambre et correspondant aux cellules n’ayant pas migré sont retirées à l’aide d’un coton-tige. Le nombre de cellules ayant traversé la membrane et retrouvé sur la face inférieure de la chambre a été compté à l’aide d’un microscope optique inversé (Leica Microsystems, Axio Imager) au grossissement X20.

Figure 65 : Représentation schématique des processus de migration et d'invasion des cellules quantifiés avec les chambres de Boyden

Le pourcentage de cellules ayant migré a été calculé à partir des cellules comptées sur la face inférieure de la chambre et rapportées au nombre de cellules déposées initialement dans la chambre. Chaque expérience a été réalisée au minimum trois fois en triplicat pour chaque condition.

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2.3.1.3. X-CELLigence®

Les expériences de migration et d'invasion cellulaires en temps réel ont été réalisées à l'aide du X-CELLigence® (Roche). Chaque puits des plaques 16 puits dédiées à l’appareil est constitué d'une chambre supérieure et d'une chambre inférieure, séparées par une membrane contenant des pores de 8 μm répartis aléatoirement et dont le fond est recouvert de micro-électrodes d'or. En utilisant le logiciel RTCA v2.0 (Roche Diagnostics), les variations d'impédance ont été analysées pendant 20 heures, ce qui a permis l’extrapolation d’une courbe représentative des cellules ayant traversé la membrane, proportionnelle aux processus de migration et d’invasion. Avant l’ensemencement des puits avec la suspension cellulaire obtenue selon le même protocole que celui décrit précédemment avec les chambres de Boyden, les plaques sont placées pendant 1 heure dans le X-CELLigence® en conditions normoxiques ou hypoxiques à 37°C et équilibrées avec 165 μL de milieu dans le fond du puits et 50 μL de milieu sans sérum de veau et supplémenté à 0,1 % en BSA dans la partie supérieure du puits. Après une heure, le signal correspondant au bruit de fond en l’absence de cellules a été mesuré. Une suspension de 100 μL contenant 30 000 cellules a été ensemencée en quadruplicat pour chaque condition dans la partie supérieure de la chambre. Avant incubation, la plaque est conservée 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de sédimenter au fond de la chambre. Les plaques ont ensuite été placées dans l'incubateur à 21 % ou 1 % d’O2 et l'impédance a été mesurée toutes les 15 minutes pendant 20 heures.

Concernant le test d’invasion, le Matrigel (BD Biosciences) a été dilué au 1/25^ème dans du milieu privé en SVF à l’aide de cônes placés à 4°C la veille de l’expérimentation. Une fine couche a été déposée sur la face supérieure du puits et les chambres ont ensuite été incubées au moins 4 heures à 37°C. Toutes les étapes suivantes ont ensuite été réalisées comme cela a été décrit pour le test de migration. Les expériences ont été répétées 3 fois en quadruplicat.

2.3.2. Motilité cellulaire

La motilité cellulaire a été quantifiée en réalisant une blessure mécanique grâce à un dispositif semi-automatisé et analysée par vidéo-microscopie au moyen de l’Incucyte® (Essen Bioscience) (Guy et al. 2017). Les conditions optimales d’ensemencement cellulaire dépendent de la lignée cellulaire et doivent être testées avec différentes dilutions pour obtenir une confluence cellulaire de 90 % dans les puits. Trente-cinq mille cellules ont été ensemencées en triplicats pour chaque condition dans des plaques Image Lock 96 puits (Essen Bioscience). Les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37 °C afin d'obtenir une confluence de 90 à 100 %. Le jour de l'expérience, une blessure a été réalisée sur la monocouche cellulaire en utilisant un dispositif

96-178 WoundMaker™ (Essen Bioscience). Les puits ont ensuite été lavés deux fois avec du PBS et 100 μL de milieu ont été ajoutés dans chaque puits. Une image par puits a été scannée toutes les deux heures pendant 24 heures et la proportion de cellules suturant la blessure initiale a été quantifiée pour chaque condition en fonction du temps, grâce au logiciel Incucyte ZOOM (Essen Bioscience). L'analyse vidéo-microscopique peut être utilisée pour générer des données quantitatives précises pour la suture des blessures et la confluence cellulaire en temps réel. Cette analyse intègre la prolifération cellulaire au cours du test et prend en compte le temps de doublement cellulaire. Cette technique n’a pu être réalisée en conditions d’hypoxie gazeuse, du fait de contraintes techniques. Les cellules ont été traitées comme décrit précédemment par des sels de cobalt afin d’établir des conditions d’hypoxie chimique.