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souches) des cancers des Voies Aéro-Digestives
Supérieures
Anne-Sophie Wozny
To cite this version:
N°d’ordre NNT : 2018LYSE1120
THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON
Opérée au sein deL’Université Claude Bernard Lyon 1
Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences Santé N°205
(EDISS)
Spécialité de doctorat
:Biochimie et Biologie Moléculaire
Discipline
:Radiobiologie
Soutenue publiquement le 05/07/2018, par :
Anne-Sophie WOZNY
Mécanismes moléculaires spécifiques
de la réponse aux ions carbone
dans les cellules tumorales (souches et
non souches) des cancers des Voies
Aéro-Digestives Supérieures
Devant le jury composé de :Professeur Philippe GONZALO – Université de Saint-Etienne Président
Docteur Catherine TOMASETTO – Université de Strasbourg Rapporteur
Professeur Jacques BALOSSO – Université Grenoble-Alpes Rapporteur
Docteur Christophe GINESTIER – Université Aix-Marseille Examinateur
Docteur Michèle MARTIN – CEA Examinatrice
Professeur Lea PAYEN-GAY – Université Lyon 1 Examinatrice
Docteur Tetsuo NAKAJIMA – NIRS, Chiba, Japon Invité
1
Président de l’Université
Président du Conseil Académique
Vice-président du Conseil d’Administration
Vice-président du Conseil Formation et Vie Universitaire Vice-président de la Commission Recherche
Directrice Générale des Services
M. le Professeur Frédéric FLEURY M. le Professeur Hamda BEN HADID M. le Professeur Didier REVEL
M. le Professeur Philippe CHEVALIER M. Fabrice VALLÉE
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COMPOSANTES SANTE
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Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation
Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine
Directeur : M. le Professeur G.RODE
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COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Faculté des Sciences et TechnologiesDépartement Biologie
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UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon
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Directeur : M. B. GUIDERDONI Directeur : M. le Professeur E.PERRIN Directeur : M. G. PIGNAULT
Directeur : M. le Professeur C. VITON
3 A ma directrice de thèse, Madame le Professeur Claire Rodriguez-Lafrasse pour m’avoir accueillie au sein de votre Laboratoire. Vous m’avez permis de découvrir la discipline de la Radiobiologie. Votre encadrement, votre confiance et votre rigueur m’ont permis de progresser dans ce domaine et bien d’autres. Soyez en remerciée.
A Madame le Docteur Catherine Tomasetto et Monsieur le Professeur Jacques Balosso pour avoir accepté la fonction de rapporteur et de juger ce travail.
A Monsieur le Docteur Christophe Ginestier pour avoir accepté d’examiner ce travail et d’apporter son expertise dans le domaine des cellules souches cancéreuses.
A Monsieur le Professeur Philippe Gonzalo de contribuer à l’évaluation de ce travail et particulièrement dans le domaine de l’hypoxie.
A Madame le Docteur Michèle Martin pour avoir accepté de participer à ce jury et de représenter la communauté des radiobiologistes.
4 ses qualités humaines sans lesquelles j’aurais sans doute abandonné depuis longtemps), Marie-Thérèse (pour votre soutien amical, bien des fois réconfortant et votre passion de la science), Philippe pour son aide précieuse au laboratoire et lors des manips japonaises, Céline pour toute l’aide technique et logistique surtout cette dernière année, Dominique pour la relecture soignée de ce manuscrit, Alexandra pour avoir survécu au rythme stakhanoviste de ma première année d’encadrement, JB, Audrey et les autres.
A mes collègues biologistes et amis pour certains, du centre de Biologie Sud pour leur soutien et leurs précieux conseils.
A l’équipe de techniciennes du secteur de Génétique Métabolique et Pharmacogénétique de Lyon Sud avec lesquelles on se sert les coudes depuis 4 ans.
A mes amis pour m’avoir soutenue depuis de nombreuses années, particulièrement lors de ces années d’assistanat et de me pardonner mon manque de disponibilité (Delphine, Carine, Antoine, Salvo, Yvan, Gautier, mes petits Guilaume, Maelle et Anne-Ga).
5
Table des Figures ... 13
Table des Tableaux ... 17
Abréviations ... 19
Résumé/Abstract ... 23
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ... 25
1. Les cancers des voies aéro-digestives supérieures (VADS) ... 27
1.1. Les VADS ... 27
1.2. Définition des cancers des VADS ... 27
1.3. Epidémiologie ... 28
1.4. Facteurs de risque ... 29
1.5. Symptomatologie ... 32
1.6. Diagnostic ... 32
1.7. Prise en charge thérapeutique ... 33
2. Radiothérapie conventionnelle et hadronthérapie... 41
2.1. La radiothérapie conventionnelle ... 41
2.2.1. La radiothérapie photonique... 41
2.2.2. Techniques de radiothérapie... 41
2.2.2.1. Radiothérapie externe ... 41
2.2.2.2. Radiothérapie conformationnelle 3D ... 41
2.2.2.3. Radiothérapie par modulation d’intensité (IMRT) ... 42
2.2.2.4. Arc thérapie ... 42
2.2.2.5. Radiothérapie guidée par l’image ... 43
2.2.2.6. Radiothérapie stéréotaxique ... 43
2.2.2.7. Tomothérapie ... 43
2.2.2.8. Curiethérapie ... 44
2.2. L’hadronthérapie ... 44
2.2.1. Développement ... 44
2.2.2. Avantage balistique des hadrons ... 45
2.2.3. Avantage biologique des hadrons ... 47
2.2.4. Oxygen Enhancement Ratio ... 49
2.2.5. Indications des hadrons en clinique ... 51
2.2.5.1. Protonthérapie ... 51
2.2.5.2. Ions carbone ... 51
6
3.2. Etape physique ... 59
3.2.1. Interactions physiques induites par les photons ... 59
3.2.2. Interactions physiques induites par les hadrons ... 61
3.3. Etape physico-chimique ... 62
3.3.1. Effets directs et indirects ... 62
3.3.2. Dommages radio-induits ... 65
3.3.2.1 Dommages radio-induits de l’ADN ... 65
3.3.2.2 Dommages radio-induits des lipides ... 68
3.3.2.3 Dommages radio-induits des protéines ... 68
3.3.3. Les défenses anti-oxydantes ... 69
3.4. Etape biologique ... 70
3.4.1. Généralités ... 70
3.4.2. Mécanismes de détection des cassures de l’ADN ... 70
3.4.3. Réparation des lésions de l’ADN ... 75
3.4.3.1. Système d’Excision de Bases (BER ou Base Excision Repair) ... 76
3.4.3.2. Système d’Excision de Nucléotides (NER ou Nucleotide Excision Repair) ... 77
3.4.3.3. Système MMR ou Mismatch Repair ... 78
3.4.3.4. Recombinaison Homologue (RH) ... 79
3.4.3.5. Suture non Homologue (NHEJ) ... 79
3.4.3.6. Autres voies mineures ... 81
3.4.3.7. Réparation des dommages complexes ... 82
3.4.4. Irradiation et mécanismes de mort cellulaire ... 84
3.4.4.1. La mort immédiate ... 84 3.4.4.2. La catastrophe mitotique ... 84 3.4.4.3. L’apoptose ... 85 3.4.4.4. La nécrose ou l’oncose ... 87 3.4.4.5. La sénescence prématurée ... 87 3.4.4.6. L’autophagie ... 88 3.5. Radiosensibilité et radiorésistance... 90
3.5.1. Lésions de l’ADN et Radiosensibilité ... 90
3.5.2. Facteurs influençant la réparation des lésions de l’ADN ... 90
3.5.2.1. Facteurs physiques ... 90
3.5.2.2. Facteurs cellulaires ... 91
7
4.2. Les cellules souches cancéreuses ... 97
4.2.1. Découverte des cellules présentant des propriétés de CSCs ... 97
4.2.2. Définition et caractéristiques des CSCs ... 98
4.2.3. Concept des CSCs ... 99
4.2.4. Isolement et caractérisation des CSCs ... 101
4.2.4.1. Méthodologie ... 101
4.2.4.2. Marqueurs de surface ... 102
4.2.4.3. Activité ALDH ... 103
4.2.4.4. Exclusion des colorants vitaux ... 104
4.2.4.5. Oncosphères in vitro... 104
4.2.4.6. Tumorigénèse ... 105
4.2.5. Niches cellulaires des CSCs ... 105
4.2.6. CSCs et EMT ... 107
4.2.7. Résistance aux traitements ... 107
4.2.7.1. Mécanismes généraux ... 107
4.2.7.2. CSCs et radioresistance ... 109
4.2.7.3. CSCs et chimioresistance ... 111
4.2.8. Voies de signalisation de l’auto-renouvellement et ciblage moléculaire des CSCs ... 112
4.2.8.1. Voies de signalisation de l’hypoxie ... 112
4.2.8.2. Sox2/Oct4/Nanog ... 114 4.2.8.3. Notch ... 115 4.2.8.4. Hedgehog ... 118 4.2.8.5. Bmi-1 ... 120 4.2.8.6. Wnt/β-caténine ... 121 4.2.8.7. TGF-β ... 123 4.2.8.8. PI3K ... 126 4.2.8.9. Hippo ... 127 4.2.8.10. NF-kB ... 128
4.2.9. Régulation des CSCs par les miRNAs ... 129
5. Protéine HIF-1α et réponse à l’hypoxie ... 131
5.1. Découverte du complexe HIF ... 131
5.2. Structure du complexe HIF-1 (HIF-1α et HIF-1β) ... 132
5.3. Isoformes d’HIF-1α ... 134
8
5.4.1.2. Régulation par les PHDs ... 137
5.4.1.3. Rôle des pVHL ... 137
5.4.1.4. Rôle des RLO ... 138
5.4.2. Régulations transcriptionnelle et post-traductionnelle de la protéine HIF-1α ... 141
5.4.2.1. Régulation transcriptionnelle ... 141
5.4.2.2. Régulation post-traductionnelle ... 142
5.5. Principales propriétés physiologiques et pathologiques dépendantes d’HIF-1α... 142
5.5.1. Rôle dans le développement embryonnaire ... 142
5.5.2. Rôle dans l’inflammation ... 143
5.5.3. Rôle dans le processus tumoral ... 143
5.6. Inhibition d’HIF-1α... 146
6. Transition épithélio-mésenchymateuse ... 149
6.1. Mécanisme de la transition épithélio-mésenchymateuse ... 149
6.2. Activation de la transition épithélio-mésenchymateuse ... 150
6.3. Détachement, migration et invasion des cellules ... 152
6.4. Extravasation et transition mésenchymo-épithéliale ... 155
6.5. Régulation de l’EMT ... 156
6.6. EMT et réponses aux radio-et chimio- thérapies ... 157
6.7. EMT et Cellules Souches Cancéreuses ... 158
6.8. EMT et Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) ... 159
OBJECTIFS ... 161
MATERIELS ET METHODES ... 165
1. Lignées cellulaires et traitements ... 167
1.1. Culture cellulaire ... 167
1.2. Culture en conditions hypoxiques ... 167
1.3. Isolement des sous-populations de CSCs ... 168
1.3.1. Tri Hoechst... 168
1.3.2. Marquage CD44+ ... 169
1.3.3. Marquage de l’activité ALDH ... 169
1.4. Formation d’« oncosphères »... 170
1.5. Irradiations ... 170
1.5.1. Irradiations photoniques ... 170
9
1.6.2. Diméthylsulfoxyde (DMSO) ... 172
1.7. Transfections cellulaires ... 173
2. Techniques de biologie cellulaire ... 174
2.1. Courbes de survie cellulaire ... 174
2.2. Quantification des Radicaux Libres Oxygénés (RLO) ... 175
2.3. Processus de migration, invasion et motilité cellulaires ... 175
2.3.1. Migration et invasion ... 175
2.3.1.1. Préparation des cellules ... 175
2.3.1.2. Chambres de Boyden ... 175
2.3.1.3. X-CELLigence® ... 177
2.3.2. Motilité cellulaire ... 177
2.4. Analyses immuno-histochimiques ... 178
3. Techniques biochimiques réalisées à partir de lysats cellulaires ... 180
3.1. Préparation des échantillons protéiques ... 180
3.2. Dosage des protéines ... 181
3.3. Western-blot ... 181
3.4. Quantification des métalloprotéases (MMP) de type 2 et 9 ... 183
3.5. Profil de phosphorylation des kinases impliquées dans la transition épithélio-mésenchymateuse ... 183
3.6. Quantification du glutathion intracellulaire ... 185
4. Analyse transcriptionnelle ... 186
5. Analyses statistiques ... 187
6. Simulation de Monte-Carlo ... 187
RESULTATS ... 189
Listes des travaux et communications……….………191
Chapitre 1: Isolement et caractérisation de la sous-population de CSCs de la lignée tumorale FaDu 1. Isolement des différentes sous-populations de la lignée FaDu ... 195
1.1. Intérêt du tri Hoechst ... 195
1.2. Activité ALDH ... 196
2. Caractérisation de deux sous-populations de la lignée FaDu : FaDu CD44Low et FaDu CD44High .. 199
2.1. Morphologie des cellules ... 199
2.2. Phénotypes des cellules FaDu CD44Low et FaDu CD44High ... 199
2.2.1. Expression de la N-Cadhérine et de l’E-Cadhérine ... 199
10
2.5. Conséquences de l’irradiation photonique sur l’expression de CD44 ... 202
2.6. Réponse à l’irradiation photonique dans la lignée FaDu et les sous-populations FaDu CD44Low et FaDu CD44High ... 203
Discussion ... 204
Chapitre 2: Rôle de la protéine HIF-1α dans les mécanismes de radiorésistance 1. Impact de l'hypoxie sur la survie cellulaire en réponse à une irradiation photonique ou par ions carbone... 217
2. Influence des irradiations photoniques et par ions carbone sur l'expression de la protéine HIF-1α ... 220
3. Conséquences de l'inhibition d’HIF-1α sur la réponse des populations non-CSCs et CSCs à l’irradiation photonique et par ions carbone ... 221
4. Rôle des radicaux libres oxygénés dans le mécanisme d’activation d’HIF-1α ... 224
4.1. Quantification des RLO dans les cellules FaDu CD44Low, FaDu-CSCs, SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en fonction du type d’irradiation et de la tension en oxygène ... 224
4.2. Quantification du glutathion dans les populations FaDu CD44Low, FaDu-CSCs, SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en fonction du type d’irradiation et de la concentration en oxygène ... 225
4.3. Conséquences de l’inhibition des RLO sur l'expression d’HIF-1α... 226
4.4. Impact de l'inhibition de l'expression d’HIF-1α sur la production de RLO ... 228
Discussion ... 230
Chapitre 3 : Impact de la distribution spatiale des RLO dans le processus métastatique 1. Effet de l’hypoxie sur la motilité cellulaire, la migration et l’invasion des CSCs par rapport aux non-CSCs ... 247
1.1. Quantification de la motilité cellulaire par test de blessure (2D) en réponse à l’hypoxie ... 247
1.2. Quantification de la migration et de l’invasion cellulaires par technique X-CELLigence® ... 248
2. Influence des conditions d'oxygénation sur l'expression des marqueurs de l’EMT et du caractère souche dans les populations CSCs et non-CSCs ... 249
3. Conséquences de l'irradiation par photons ou par ions carbone sur la migration et l'invasion cellulaires en conditions normoxiques et hypoxiques ... 250
4. Conséquences de l'irradiation par photons ou par ions carbone sur les concentrations cellulaires de MMP2 et MMP9 ... 251
5. Implication de la protéine HIF-1α dans les capacités de migration et d’invasion des CSCs ... 252
6. Voies de signalisation impliquées dans les processus de migration et d’invasion ... 254
7. Conséquences de l’inhibition des RLO sur l’activation des voies de signalisation impliquées dans les processus de migration et d’invasion ... 258
8. Distribution spatiale des RLO en fonction du type d’irradiation ... 263
11 1. Transfert d’HIF-1α du cytoplasme vers le noyau en fonction du type de rayonnement et de la
concentration en oxygène ... 297
2. Rôle d’HIF-1α sur la cinétique de recrutement de la protéine γH2AX ... 299
3. Cinétique d’expression de la protéine ATM ... 305
4. Interaction d’HIF-1α et des voies de réparation des dommages de l’ADN en réponse aux rayonnements ... 309
4.1. HIF-1α et voie NHEJ ... 309
4.2. HIF-1α et voie de la recombinaison homologue (RH) ... 311
Discussion ... 313
CONCLUSION - PERSPECTIVES ... 319
13
Figure 2 : Distribution géographique des centres de particules-thérapie de traitement du cancer au
niveau mondial en fonctionnement en mars 2018 ... 45
Figure 3 : Comparaison de la distribution de dose dans les tissus selon le rayonnement ... 45
Figure 4 : Représentation du pic de Bragg étalé en réponse à une irradiation par protons et ions carbone ... 46
Figure 5 : Simulation illustrative des profils de dépôts de dose pour le traitement d'une tumeur cérébrale respectivement par des rayons X (à gauche), par des protons (au centre) et par des ions carbone (à droite). ... 47
Figure 6 : Calcul de l’EBR (Efficacité Biologique Relative) ... 47
Figure 7 : Schématisation des critères radiobiologiques discriminants pour le choix d'une radiothérapie à haut ou faible transfert d'énergie linéique ... 48
Figure 8 : Représentation schématique de la radiorésistance observée en conditions hypoxiques en réponse à une irradiation photonique ... 49
Figure 9 : Variation de l'OER en fonction du TEL ... 50
Figure 10 : Indications consolidées pour la thérapie par ions carbone ... 52
Figure 11 : Schéma du centre japonais d'irradiation par ions lourds de Chiba, Heavy Ion Medical Accelerator of Chiba (HIMAC) ... 52
Figure 12 : Echelle de temps des effets des rayonnements ionisants ... 57
Figure 13 : Phénomène de diffusion Compton ... 59
Figure 14 : Effet photo-électrique ... 60
Figure 15 : Production de paires ... 60
Figure 16 : Importance relative des trois effets en fonction de l'énergie du photon incident et du numéro atomique de la cible ... 61
Figure 17 : Echelle de temps des principales étapes de la radiolyse de l’eau en réponse à une irradiation de bas TEL ... 63
Figure 18 : Représentation schématique des principaux dommages de l’ADN produits par des effets directs et indirects ... 65
Figure 19 : Complexe MRN fixé à une cassure double-brin ... 71
Figure 20 : Représentation schématique de la détection des cassures double-brin et de l'activation de la cascade de signalisation médiée par pATM ... 72
Figure 21 : Exemple représentatif de la cinétique des foci γH2AX et pATM et des courbes de survie des 3 groupes de radiosensibilité en réponse aux rayonnements ionisants ... 73
Figure 22 : Passage de la protéine ATM du cytoplasme au noyau en réponse à l'irradiation photonique ... 74
Figure 23 : Différents types de lésions de l’ADN selon la source du dommage et principaux mécanismes de réparation correspondants... 75
Figure 24 : Schéma de la réparation par excision de bases ... 76
Figure 25 : Schéma hypothétique de la réparation par excision de nucléotides ... 77
Figure 26 : Principales étapes du système de réparation des mésappariements de bases... 78
Figure 27 : Mécanismes de réparation des cassures double-brin de l’ADN ... 80
Figure 28 : Schéma représentant les différents dommages de l’ADN, les systèmes de réparation et les cibles thérapeutiques potentielles ... 81
Figure 29 : Principaux dommages de l’ADN et voies de réparation actives ... 83
Figure 30 : Voies de signalisation conduisant à l’apoptose. ... 86
14
Figure 34 : Modèles d'hétérogénéité tumorale ... 100
Figure 35 : Représentation schématique d'une niche cellulaire tumorale ... 106
Figure 36 : Schéma simplifié des mécanismes de résistance des CSCs à la chimiothérapie ... 111
Figure 37 : Interaction des principales voies de signalisation des CSCs ... 112
Figure 38 : Induction du pouvoir métastatique par l’hypoxie dans la tumeur primaire ... 113
Figure 39 : Représentation schématique des effets de l’hypoxie à court et long terme ... 113
Figure 40 : Régulation de la pluripotence par Sox-2, Oct4 et Nanog ... 114
Figure 41 : Schéma de la voie de signalisation Notch ... 116
Figure 42 : Voie de signalisation Notch et agents en développement clinique ... 117
Figure 43 : Voie de signalisation de Sonic Hedgehog (Shh) ... 119
Figure 44 : Voies de signalisation en amont et en aval de Bmi-1 ... 120
Figure 45 : Signalisation moléculaire d'ensemble de la voie Wnt/β-caténine ... 122
Figure 46 : Voie du Transforming Growth Factor β (TGF-β)... 125
Figure 47 : Voie de la phosphatidyl-inositol 3-kinase ... 126
Figure 48 : Voie Hippo ... 128
Figure 49 : Chronologie de la découverte d'HIF-1 et de sa caractérisation ... 131
Figure 50 : Structure des sous-unités du complexe HIF-1, HIF-1α et HIF-1β ... 133
Figure 51 : Régulation de l’activité du complexe HIF-1 ... 136
Figure 52 : Proposition des différents mécanismes conduisant à la stabilisation d'HIF-1α ... 138
Figure 53 : Implication du complexe HIF-1 dans le processus tumoral ... 144
Figure 54 : Principales étapes du développement d’une tumeur d’origine épithéliale et de la cascade métastatique ... 149
Figure 55: Vue simplifiée des signaux responsables de l'activation et de la régulation de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). ... 150
Figure 56 : Transition épithélio-mésenchymateuse et dissémination métastatique ... 153
Figure 57 : Déclenchement de l’EMT et transduction du signal ... 154
Figure 58 : Concergence des cellules stromales pour soutenir une niche primaire tumorigène ... 155
Figure 59 : Identification de la Side Population (SP) par FACS après marquage au Hoechst 33342 .. 168
Figure 60 : Cellules marquées par l’anticorps CD44 couplé au fluorophore FITC permettant d’isoler une sous-population CD44Low et CD44High ... 169
Figure 61 : Système d’irradiation photonique au sein du laboratoire (X-Rad 320) ... 170
Figure 62 : A : Représentation schématique du système d’irradiation IRRABAT par ions carbone en salle D1 (a. Système d’aimants, b. Système de rotation, c. Fentes H et V, d. Détecteur de rayons X, e. Passeur d’échantillons). B Ligne IRRABAT C : Passeur d’échantillons. ... 171
Figure 63 : Porte plombée permettant l'accès à la salle d'irradiation (A), Passeur vertical d’échantillons (B), Infrastructure de l’accélérateur d’ions lourds (HIMAC) (C) et salle de traitement des patients sur le site du NIRS, à Chiba, Japon. ... 172
Figure 64 : Taux de transfection mesuré par FACS des cellules FaDu CD44Low transfectées avec le SiRNA ciblant HIF-1α et couplé à un fluorophore FITC ... 173
Figure 65 : Représentation schématique des processus de migration et d'invasion des cellules quantifiés avec les chambres de Boyden ... 176
Figure 66 : Exemple de révélation des membranes du kit Human-Phospho Kinase ... 185
Figure 67 : Analyse par FACS de la lignée FaDu après marquage CD44 ... 195
Figure 68 : Analyse par FACS de la lignée FaDu et de la population FaDu SP après marquage CD44 196 Figure 69 : Analyse par FACS de la population FaDu CD44High après marquage CD44 et/ou ALDH .... 197
15
Figure 72 : Caractéristiques morphologiques des sous-populations FaDu CD44 et FaDu CD44
observées en microscopie optique (x10) ... 199
Figure 73 : Etude des marqueurs épithéliaux (E-Cadhérine) et mésenchymateux (N-Cadhérine) par Western-blot dans les populations FaDu CD44Low et FaDu CD44High. ... 200
Figure 74 : Quantification des expressions géniques relatives de la β-caténine et de Bmi-1 par PCR quantitative dans la lignée FaDu et les sous-populations FaDu CD44High et CD44Low . ... 200
Figure 75 : Observation en microscopie optique (G X20) de la formation de sphères tumorigéniques à 48 heures à partir de cellules FaDu CD44High ... 201
Figure 76 : Evolution de l'expression CD44 en conditions normoxiques et hypoxiques dans la population FaDu CD44High ... 202
Figure 77 : Quantification de l'expression CD44 en réponse à une irradiation photonique dans la population FaDu CD44High ... 202
Figure 78 : Courbes de survie clonogénique de la lignée FaDu et des sous-populations FaDu CD44High et FaDu CD44Low en réponse à une irradiation photonique de 1 à 5 Gy (250 kV) ... 203
Figure 79 : Courbes de survie clonogénique ... 217
Figure 80 : Courbes de survie clonogénique ... 218
Figure 81 : Etudes cinétiques de l'expression de la protéine HIF-1α ... 220
Figure 82 : Etudes cinétiques de l'expression d’HIF-1α après une irradiation par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) de 5 Gy en conditions normoxiques. ... 221
Figure 83 : Courbes de survie clonogénique après transfection cellulaire avec un siRNA contrôle négatif ou dirigé contre HIF-1α en réponse à une irradiation photonique (250 kV) ou par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) ... 222
Figure 84 : Quantification des Radicaux Libres Oxygénés en réponse à une irradiation photonique (250 kV) ou par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) de 10 Gy en conditions normoxiques et hypoxiques, ou en réponse à l’hypoxie seule. ... 224
Figure 85 : Quantification de la production de glutathion réduit en réponse à une irradiation de 10 Gy photonique ou par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) en conditions normoxiques et hypoxiques, ou en réponse à l’hypoxie aiguë seule. ... 226
Figure 86 : Conséquences de l'inhibition de la production de RLO sur l'activation d’HIF-1α en réponse à une irradiation photonique (250 kV). ... 227
Figure 87 : Conséquences de l'inhibition de la production de RLO sur l'activation d’HIF-1α en réponse à une irradiation par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) dans les deux sous-populations FaDu-CSC et SQ20B-CSCs. ... 228
Figure 88 : Influence de l’inhibition de l’expression d’HIF-1α sur la production de RLO dans les populations FaDu-CSCs et SQ20B-CSCs, en conditions d’hypoxie aiguë ou en réponse à une irradiation photonique (250 kV) en conditions normoxiques et hypoxiques. ... 229
Figure 89 : Proposition de mécanismes conduisant à l’expression d’HIF-1α et conséquences sur la réponse aux rayonnements de bas et hauts TEL en conditions normoxiques et hypoxiques. ... 233
Figure 90 : Rôle de l'hypoxie sur la motilité des cellules SQ20B-CSCs et des FaDu-CSCs et de leurs sous-populations non-CSC SQ20B CD44Low et FaDu CD44Low. ... 247
Figure 91 : Rôle de l'hypoxie sur la migration et l'invasion des cellules SQ20B-CSCs et des FaDu-CSCs et de leurs sous-populations non-CSCs SQ20B CD44Low et FaDu CD44Low ... 248
16 normoxiques et hypoxiques ... 250
Figure 94 : Concentrations en MMP2 dans les populations SQ20B CD44Low, SQ20B-CSCs, FaDu
CD44Low et FaDu-CSCs en conditions normoxiques ... 251
Figure 95 : Concentrations en MMP2 en réponse aux irradiations photoniques (250 kV) et par ions
carbone (290 MeV/n, NIRS) en conditions normoxiques et hypoxiques dans les populations SQ20B-CSCs et FaDu-SQ20B-CSCs ... 252
Figure 96 : Conséquences de l’inhibition d’HIF-1α sur les processus de migration et d’invasion en
réponse à une irradiation photonique et par ions carbone en conditions normoxiques ou hypoxiques dans les populations SQ20B-CSCs et FaDu-CSCs ... 253
Figure 97 : Voies de signalisation impliquées dans les processus de migration et d’invasion des
cellules SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en réponse à une irradiation photonique ou par ions carbone en conditions normoxiques et hypoxiques ... 255
Figure 98 : Représentation schématique des voies MEK/p38/JNK, STAT3 et Akt/mTOR impliquées
dans la migration et l’invasion ... 258
Figure 99 : Impact des RLO sur la phosphorylation des kinases impliquées dans l’EMT en réponse à
une irradiation photonique en conditions normoxiques dans la population SQ20B-CSC. ... 259
Figure 100 : Impact des RLO sur la migration et l’invasion des CSCs en réponse à une irradiation
photonique (250 kV) ou par ions carbone (290 MeV/n, NIRS) en conditions normoxiques et hypoxiques ... 262
Figure 101 : Distribution de radicaux OH● en réponse à une irradiation de 1 Gy avec des rayons X (250 kV) et des ions carbone (75 MeV/n) ... 263
Figure 102 : Représentation schématique des mécanismes impliqués dans l'EMT en réponse à des
irradiations photoniques ou par ions carbone en conditions normoxiques et hypoxiques ... 264
Figure 103 : Transfert de la protéine HIF-1α du cytoplasme vers le noyau dans la population SQ20B
CD44Low ... 297
Figure 104 : Quantification de l’expression nucléaire d’HIF-1α dans les sous-populations SQ20B
CD44Low, FaDu CD44Low, SQ20B-CSCs et FaDu-CSCs ... 298
Figure 105 : Conséquences de l’inhibition de la protéine HIF-1α sur la formation et la décroissance
des foci γH2AX, reflets des CDBs, en réponse aux rayonnements ... 300
Figure 106 : Focus sur les courbes de foci γH2Ax entre 0 et 6 heures des 4 sous-populations ... 301 Figure 107 : Conséquences de l’inhibition de la protéine HIF-1α sur les foci résiduels γH2AX ... 304 Figure 108 : Conséquences de l’inhibition de la protéine HIF-1α sur la capacité de réparation des
CDBs des cellules, en réponse à une irradiation par ions carbone dans les populations FaDu CD44Low et FaDu-CSCs... 304
Figure 109 : Phosphorylation d'ATM en fonction du type d'irradiation et de la tension en oxygène 305 Figure 110 : Phosphorylation d'ATM en fonction du type d'irradiation et de la tension en oxygène 306 Figure 111 : Quantification de la phosphorylation d’ATM en fonction de l’expression d’HIF-1α ... 307 Figure 112 : Impact des RLO sur la phosphorylation d'ATM ... 308 Figure 113 : Conséquences de l'inhibition d'HIF-1α sur la voie de réparation NHEJ en réponse aux
rayonnements et en fonction de la concentration en oxygène ... 310
Figure 114 : Conséquences de l'inhibition d'HIF-1α sur la voie RH en réponse à une irradiation
photonique (250 kV) en fonction de la concentration en oxygène ... 311
Figure 115 : Conséquences de l'inhibition d'HIF-1α sur la voie RH en réponse à une irradiation par
ions carbone (290 MeV/n, NIRS) en fonction de la concentration en oxygène ... 312
Figure 116 : Proposition d’un mécanisme de détection et de réparation des CDBs en réponse à une
17
Tableau 2 : Principaux facteurs de risque en fonction des répartitions par localisation et par type
tissulaire des cancers des VADS ... 30
Tableau 3 : Principaux signes cliniques selon la localisation tumorale. ... 32
Tableau 4 : Sélection d’essais cliniques en cours incluant l’immunothérapie ... 38
Tableau 5 : Centres d’hadronthérapie par ions carbone dans le monde ... 54
Tableau 6 : Quantification des dommages induits par un rayonnement photonique de 1 Gy par cellule ... 66
Tableau 7 : Principaux marqueurs caractéristiques des CSCs compilés à partir des données de la littérature ... 103
Tableau 8 : Régulateurs d'HIF-1α ... 140
Tableau 9 : Principaux mécanismes d'inhibition de l'activité HIF-1α ... 147
Tableau 10 : Composition des solutions et anticorps utilisés pour les marquages par immuno-fluorescence ... 179
Tableau 11 : Anticorps primaires utilisés pour les analyses par Western-Blot ... 182
Tableau 12 : Principales phospho-kinases étudiées avec le kit Human Phospho Kinase et leurs principaux sites de phosphorylation ... 184
Tableau 13 : Séquences des amorces utilisées en qPCR ... 187
Tableau 14 : Paramètres radiobiologiques des populations FaDu CD44Low, FaDu-CSCs, SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en réponse à une irradiation photonique (250 kV) ou par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) en conditions normoxiques ou hypoxiques. ... 219
Tableau 15 : Paramètres radiobiologiques des populations FaDu CD44Low, FaDu-CSCs, SQ20B CD44Low et SQ20B-CSCs en réponse à une irradiation photonique (250 kV) ou par ions carbone (75 MeV/n, GANIL) en conditions normoxiques ou hypoxiques ... 223
Tableau 16 : Valeurs brutes des signaux de phosphorylation des principales kinases impliquées dans l’EMT dans les cellules SQ20B CD44Low ... 256
Tableau 17 : Valeurs brutes des signaux de phosphorylation des principales kinases impliquées dans l’EMT dans les cellules SQ20B-CSCs ... 257
Tableau 18 : Valeurs brutes des signaux de phosphorylation des principales kinases impliquées dans l’EMT dans les cellules SQ20B CD44Low après inhibition des RLO ... 260
Tableau 19 : Valeurs brutes des signaux de phosphorylation des principales kinases impliquées dans l’EMT dans les cellules SQ20B-CSCs après inhibition des RLO ... 261
Tableau 20 : Vitesse de décroissance des CDBs dans les 4 sous-populations transfectées avec un siRNA contrôle ou dirigé contre HIF-1α et irradiées avec des photons (250 kV) en conditions normoxiques ou d’hypoxie chronique ... 302
19 Protein 1
5-FU : 5-Fluorouracile Aa : Acide aminé
ABC : ATP-Binding Cassette
ABCB5 : ATP-Binding Cassette transporter B5 ADAM : A Disintegrin and Metalloprotease ADN : Acide désoxyribonucléique
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire AKT/PKB : Protein Kinase B
ALDH : Aldéhyde déshydrogénase APC : Adenomatous Polyposis Coli APC : Allophycocyanine
APEX1=APE1: Endo-désoxyribonucléase apurinique /apyrimidinique 1
APS : Ammonium persulfate
ARCHADE: Advanced Resource Center for HADrontherapy in Europe
ARN : Acide ribonucléique ARNm : ARN messager
ARNT1 : Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator 1
ATCC : American Type Culture Collection Atg : Autophagy related protein
ATM : Ataxia Telangectiasia Mutated ATP : Adenosine Triphosphate ATR : ATM and Rad3-related ATRIP : ATR-interacting-protein BCA : Acide bicinchoninique BER : Base Excision Repair
bHLH/PAS : Basic Helix-Loop-Helix/PER-ARNT-SIM BMDC : Cellules dérivées de la moelle
BMP/GDF/MIS : Bone Morphogenetic Protein/ Growth and Differenciation Factor/ Muellerian Inhibiting Substance
BRCA1 : BReast Cancer Associated Protein 1 BSA: Bovin Serum Albumin
c-abl : Abelson murine leukemia viral oncogene CAD : Domaine de transactivation C-terminal CBP : CREB Binding Protein
CDB : Cassure double-brin CDKs : Cyclin-Dependent Kinases CETN2 : Centrine 2
CHKs : Checkpoint Kinases CK1α : Casein Kinase 1α
CM-H2DCFDA : Chloromethyl derivative 2ʹ,7ʹ-Dichlorodihydrofluorescein diacetate
CNAO : Centro Nazionale di Adroterapia Oncologica
CO2 : Dioxyde d’oxygène
CoCl2 : Chlorure de cobalt
CSB : Cassure simple-brin
CSCs : Cellules souches cancéreuses
CuSO4 : Sulfate de cuivre
D : Dose
D10 : Dose induisant 10 % de survie DAPI : 4’, 6’-diamidino-2-phénylindole
DEAB : Diethylaminobenzaldéhyde
Dhh : Desert Hedgehog Dkk : Dickkopf
DLL : Delta Like ligand
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO : Dimethyl sulfoxyde
DNA-PK : DNA-dependant Protein Kinase dNTP : Désoxyribonucléotide
DSB : DNA Double Strand Break DSL : Delta and Serrate Ligand Dvl : Disheveled
e- : Electron
EBR : Efficacité Biologique Relative EBV : Epstein - Barr virus
ECM : Matrice extracellulaire
EcOG : Eastern Cooperative Oncology Group EDTA : Acide Ethylenediamine Tetra Acétique EGF : Epidermal Growth Factor
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor EMT : Transition épithélio-mésenchymateuse EpCAM : Epithelial Cell Adhesion Molecule EPE : End-processing enzyme
EPO : Erythropoïetine
Erb/HER : Human Epidermic Receptor ERK : Extracellular signal-Regulated Kinases ESA : Epithelial-specific antigen
ETAR : Endothelin-1-receptor
Etoile : Espace de Traitement Oncologique par Ions Légers en Europe
EXO 1 : Exonucléase 1
FACS : Fluorescence Assisted Cell Sorting
Fe2+ : Ions ferreux
FDA : Food Drug Administration FGFs : Fibroblast Growth Factors FIH : Factor inhibiting HIF-1α FITC : Fluorescéine isothiocyanate FOXO : Forkhead box O
FRMD6 : FERM domain containing 6 Fu : Fused
Fzd : Frizzled
γH2AX : Forme phosphorylée de l’histone H2AX γGLU-GLU : Acide Gamma glutamyl-glutamique γ-POL : γ -family polymerase
GANIL : Grand Accélérateur National d’Ions Lourds GAPDH : Glycéraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase
20 GSI : Gesellschaft für Schwerionenforschung
GSK3β : Glycogen Synthase Kinase 3β GS-SG : Glutathion oxydé
Gy : Gray
H2AX : Histone H2AX
H2 : Dihydrogène
H2O : Eau
H2O2 : Peroxyde d’hydrogène
HAS : Haute Autorité de Santé HDAC : Histone désacétylase HER : Human Epidermic Receptor HIF1,2…: Hypoxia Inducible Factor 1,2… HIF-1α : Hypoxia Inducible Factor 1α
HIMAC : Heavy Ion Medical Accelerator de Chiba HMG : High Mobility Group
HNSCC : Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
HO●: Radical hydroxyle
HPC : Progéniteurs hématopoïétiques HPLC : Chromatographie liquide haute performance
HPV : Human Papilloma Virus HRE : Hormone Response Element Hsp90 : Heat Shock Protein 90 IgG : Immunoglobuline G Ihh : Indian Hedgehog
IMRT : Radiothérapie par modulation d’intensité INCa : Institut National du Cancer
iNOS : Inducible Nitric Oxide Synthase InVS : Institut de Veille Sanitaire IV : Intraveineuse
Ja : Jagged
J-CROS : Japan Carbon Ion Radiation Oncology Study Group
JNK : c-Jun N-terminal Kinase kDa : Kilo Dalton
keV/μm : Kiloelectron Volt par micromètre KO : Knock-Out
kV : Kilo-Volt
LATS1/2 : Large Tumor Supressor
LC3 : Microtubule-associated protein 1 Light Chain 3
LDLR : Low Density Lipoprotein Receptor LIG1 : ADN ligase 1
LIMK1 : Lim kinase 1
LMDS : Locally Multiply Damaged Sites LRH-1 : Liver Receptor Homolog-1 mA : Milliampère
mAb : Ancticorps monoclonal
MAPK : Mitogen ACtivated Protein Kinases MAPK-APK3 : MAPK Activated Protein Kinase 3 Mdc1 : Mediator of Damage Checkpoint 1 MDSC : Cellules myéloïdes
Mg2+: Ions magnésium
MET : Transition Mésenchymo-Epithéliale MeV/n : Mega electron Volt par nucléon MGMT: MéthylGuanine MéthylTransférase miRNA : microARN
MMP : Matrix MétalloProtéase MMR : MisMatch Repair MP : Main Population
MRI : Imagerie par Résonance Magnétique MRN : Meiotic Recombination
MSCs : Cellules Souches Mesenchymateuses mTOR : Mammalian Target Of Rapamycin
N2 : Azote
NAD : Domaine N-terminal de transactivation NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate
Nbs1 : Nijmegen Breakage Syndrom 1 NCID : Notch Intra-Cellular Domain NEM : N-EthylMaleimide
NER : Nucleotide Excision Repair NEXT : Notch Extracellular Truncation NFκB : Nuclear Factor-kappa B NHEJ : Non-Homologous-End-Joining
NIRS : National Institute of Radiological Sciences NLS : Séquence de Localisation Nucléaire NO : Oxide nitrique
NOS : Nitric Oxide Synthase
O2 : Dioxygène
O2●- : Anion superoxyde
ODD : Oxygen Dependent Degradation Domain OER : Oxygen Enhancement Ratio
OH●: Radical hydroxyle
ONOO●- : Anion peroxynitrite
p53BP1 : p53 Binding protein 1 PARP 1 : Poly ADP-ribose-polymérase 1 pATM : Forme phosphorylée d’ATM PBS : Phosphate-Buffered Saline
PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR : Polymerase Chain Reaction PD-L1 : Programmed Death-Ligand 1 PE : Plating Efficiency
PE : Phyco-Erythrine PFA : Paraformaldéhyde PHD : Propyl-hydroxylase
PHRC : Programme Hospitalier de Recherche Clinique
PI : Iodure de propidium
PI3K : Phosphatidylinositol-3-Kinase PIP2 : Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate PIP3 : Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate PKM2 : Isoforme M2 de la pyruvate kinase PNK : Polynucléotide kinase
21 PS : Pénicilline/Streptomycine
Ptch : Patched
PTEN : Phosphatase and TENsin homolog pVHL : Protéine Von Hippel Lindau qPCR : PCR quantitative
R. : Radical organique
RAD 51 : Recombinase RAD51
RCP : Réunion de Concertation Pluridisciplinaire RH : Recombinaison Homologue
RHEB : Ras Homolog Enriched in Brain RI : Rayonnement ionisant
RISC : RNA-Induced Silencing Complex RL : Radicaux libres
RLO : Radicaux libres oxygénés RNO : Espèces réactives nitrées RNF2 : RiNG Finger protein 2 ROS : Reactive Oxygen Species RPA : Replication factor A RT : Reverse Transcription RT : Radiothérapie
RTk : Récepteur à activité tyrosine kinase S6K1 : p70-S6 kinase
S : Fraction de survie SAM : S-adénosylméthionine SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SF2 : Fraction de survie cellulaire à 2 Gy sFRP : Secreted Frizzled Related Protein Shh : Sonic Hedgehog
SIRT : Sirtuine
SM : Spectrométrie de masse Smo : Smoothened
SMURF : SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1
SOBP: Spread-out Bragg peak SP : Side population
SRC-1 : Steroïd-receptor co-activator 1
SuFu : Suppressor of Fused
SUMO : Small Ubiquitin-Like-Modifier SVF : Serum de Veau Foetal
TACE : TNFα Converting Enzyme TBS : Tris-Buffered Saline
TCF/LEF : T-cell Factor/Lymphoïd Enhancer Factor TCFRE : TCF Response Element
TEAD : TEA Domain
TEL : Transfert d’Energie Linéique
Temed : N, N, N', N'-tétraméthyléthylènediamine TIF2 : Transcription Intermediary Factor 2 TFIIH : Facteur de transcription IIH TGFα : Transforming Growth Factor α TGFβ : Transforming Growth Factor β TLR : Récepteur Toll
TLS : Mécanisme de réparation des lésions multiples
TNM : Tumor Node Metastasis
TOPBP1 : TOPo-isomerase II Binding Protein 1 TPF : Taxotère®, sels de platine, fluoropyrimidines Tris-HCl : Tris hydrochloride
TSC : Complexe de la sclérose tubéreuse Ub : Ubiquitine
UICC : Union Internationale Contre le Cancer UV : Ultra-Violet
VADS : Voies Aéro-Digestives Supérieures VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VHL : Syndrome de Von Hippel-Lindau WB : Western-Blot
Wif-1 : Wnt-inhibitory factor-1
XRCC1 : X-ray Repair Cross Complementary 1 YAP/TAZ : Yes Associated Protein/WW domain countaining transcription regulator 1
22
23
R
Résumé
L’hadronthérapie par ions carbone est une alternative à la radiothérapie photonique dans le traitement des cancers des VADS, en raison d’une balistique précise et d’une efficacité biologique élevée, y compris au sein des zones tumorales hypoxiques. Ces cancers sont de mauvais pronostic en raison d’un risque élevé de récidives liées à la présence de cellules souches cancéreuses (CSCs). L’objectif de ce travail était de déterminer les spécificités moléculaires de la réponse aux ions carbone par rapport aux photons dans deux lignées cellulaires de cancer des VADS et leur sous-population CSCs en hypoxie et normoxie. Il s’est focalisé sur le rôle de la protéine HIF-1α dans la survie cellulaire, dans la mesure où l’hypoxie favorise sa stabilisation mais également la radiorésistance; sur la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la détection-réparation des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN.
HIF-1α est stabilisée plus précocement dans les CSCs par rapport aux non-CSCs. Son activation, tout comme celle des voies de l’EMT (STAT3, MEK/p38/JNK et Akt/mTOR) est dépendante des radicaux libres oxygénés (RLO), dont la production est homogène dans la cellule en réponse aux photons. Par contre, les RLO produits dans la trace des ions carbone ne permettent pas d’activer HIF-1α et les voies de l’EMT. Sous hypoxie, une relation a été établie entre l’activation d’HIF-1α et celles des voies de détection (ATM) et de réparation (Rad51) des CDBs (Recombinaison Homologue).
Ces travaux démontrent que l’avantage thérapeutique des ions carbone repose sur la répartition spatiale des RLO à l’échelle nanométrique et consécutivement sur la non-activation de voies clés de la défense cellulaire tumorale.
Mots clé : Ions carbone, Hadronthérapie, Radiothérapie photonique, Cellules Souches Cancéreuses,
Hypoxie, HIF-1α, Transition épithélio-mésenchymateuse, Radicaux Libres Oxygénés, Cassure double brin de l’ADN
Abstract
Hadrontherapy using carbon ions is an alternative to photon irradiation in the treatment of Head and Neck cancers, because of accurate ballistics and high biological efficiency, including hypoxic tumor areas. These cancers are of poor prognosis because of a high risk of recurrences related to the presence of cancer stem cells (CSCs).
The aim of this work was to determine the molecular specificities of the response to carbon ion irradiations compared to photons in two cancer cell lines and their CSCs’ subpopulation, in hypoxic and normoxic conditions. This work focused on the role of the HIF-1α protein in cell survival, since hypoxia promotes its stabilization, but also in the radioresistance; the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and the detection and repair of DNA double-strand breaks (DSBs).
HIF-1α is stabilized earlier in CSCs compared to non-CSCs. Its activation, as well as the EMT pathways (STAT3, MEK/p38/JNK and Akt/mTOR), are dependent on reactive oxygen species (ROS), whose production is homogeneous in response to photons. At the opposite, the ROS produced in the carbon ion tracks are insufficient to activate HIF-1α and the upstream EMT pathways. Under hypoxic conditions, a relationship has been established between HIF-1α activation and that of the DSBs detection (ATM) and repair (Rad51) pathways (Homologous Recombination).
These studies demonstrate that the therapeutic advantage of carbon ions is based on the spatial ROS distribution at the nanoscale and consequently on the non-activation of key pathways involved in tumor cell defense.
Key Words: Carbon ions, Photons, Radiotherapy, Cancer Stem Cells, Hypoxia, HIF-1α,
25
27
1. Les cancers des voies aéro-digestives supérieures (VADS)
1.1. Les VADS
Les VADS sont constituées de plusieurs organes composant :
o Les voies aériennes supérieures qui assurent le passage et le traitement de l’air jusqu’à la trachée puis aux poumons, à savoir les fosses nasales, les sinus, le pharynx et le larynx qui contient les cordes vocales.
o Les voies digestives supérieures qui permettent la déglutition et la mastication des aliments. Elles sont constituées par la cavité buccale qui regroupe les lèvres, la langue et le palais mais également par les glandes salivaires et le pharynx qui comprend l’oropharynx situé en arrière de la langue et l’hypopharynx, au-dessus de l’œsophage.
Figure 1 : Anatomie des voies aéro-digestives supérieures (http://www.stopaucancer.com)
1.2. Définition des cancers des VADS
28
Tableau 1 : Répartition par localisation et par type tissulaire des cancers des VADS
Localisation Histologie la plus fréquente
Cavité buccale Carcinome épidermoïde
Oropharynx Carcinome épidermoïde
Hypopharynx Carcinome épidermoïde
Larynx Carcinome épidermoïde
Amygdale Carcinome épidermoïde
Sinus Maxillaire Carcinome épidermoïde
Sinus Ethmoïde
et fosses nasales Adénocarcinome
Glandes salivaires Carcinome adénoïde kystique
Nasopharynx, cavum et rhinopharynx Carcinome indifférencié du nasopharynx
Le carcinome épidermoïde, histologiquement le plus fréquent, est une tumeur maligne épithéliale résultant de la différenciation malpighienne, reconnue sur un plan morphologique par la présence de ponts d’union ou l’accumulation de kératine dans les cellules. La muqueuse malpighienne est épaissie et forme des bourgeons à partir desquels se détachent des amas de cellules tumorales infiltrantes. Ces modifications histologiques sont définies comme de la dysplasie par l’Organisation Mondiale de la Santé et la tumeur se développe à partir des cellules du tissu de revêtement, le plus souvent de l’oro- ou de l’hypo- pharynx, des lèvres, de la bouche et de la partie supérieure du larynx. Le travail présenté dans ce document s’est focalisé sur les cancers épidermoïdes de la tête et du cou, également appelés Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).
1.3. Epidémiologie
29 Au cours des 30 dernières années, les progrès dans le traitement des cancers des VADS ont amélioré la qualité de vie des patients grâce à l'utilisation de techniques chirurgicales novatrices notamment par voie endoscopique lorsque la localisation de la tumeur le permet, ce qui favorise la préservation des organes (Allegra and Trapasso 2012). Cependant, la survie sans récidive n’atteint pas 30 % à 3 ans selon l’Institut de Veille Sanitaire (InVS) et le taux de survie à 5 ans est resté stable, à savoir entre 50 et 60 % au cours des trois dernières décennies. Les principales causes de décès sont la récurrence locorégionale de la maladie qui ne répond pas aux traitements conventionnels dans 40 à 50 % des cas mais aussi les métastases pulmonaires, osseuses, hépatiques et cervicales dans 30 % des cas (Allegra and Trapasso 2012). Enfin, d’autres cancers de la sphère ORL apparaissent chez 20 % des patients dans les deux années suivant la prise en charge du cancer initial.
1.4. Facteurs de risque
o Alcool et tabac
Les cancers épidermoïdes de l’oropharynx, de l’hypopharynx, du larynx et de la cavité buccale représentent en France plus de 90 % des cancers des VADS. Le tabac et l’alcool en sont les principaux facteurs de risque et plus de 80 % des patients atteints sont doublement exposés (Scully and Bagan 2009). La consommation de tabac irrite chroniquement les muqueuses et les fragilise, tout en exposant les structures aéro-digestives à des substances cancérigènes. Pour les seuls éthyliques chroniques, le risque de développer un cancer des VADS est multiplié par 5 (Pelucchi et al. 2011). Enfin, l’association de ces 2 facteurs de risque est synergique, en augmentant d’un facteur 35 la probabilité de développer ce type de cancer (Blot et al. 1988). Cependant, l’absence de ces facteurs de risque ne permet pas d’éliminer le diagnostic. Ces dernières années, l’analyse des taux d’incidence par sexe montre des tendances opposées entre hommes et femmes. En effet, une diminution de l’incidence a été observée chez l’homme, surtout après diminution de la consommation d’alcool mais également de tabac. Chez la femme, l’incidence augmente avec la consommation d’alcool et de tabac (Ferlay et al. 2015).
o Virus
30 Concernant l’HPV, il est retrouvé quasiment exclusivement dans les cancers de l’oropharynx et représente la cause la plus fréquente de ces cancers en Europe du Nord et Amérique du Nord (Bui et al. 2018). Les HPV à haut pouvoir pathogène tels les variants 16 et 18 sont associés aux cancers des VADS ainsi qu’aux cancers du col utérin et du canal anal. Le virus, via les protéines E6 et E7, induit la dégradation de la protéine p53 et l’inactivation de la protéine du rétinoblastome induisant de ce fait une surexpression de p16 (Klozar et al. 2010; Miller et al. 2015). Ce mécanisme permet d’expliquer la plus grande sensibilité à la radiothérapie et à la chimiothérapie des tumeurs HPV positives et le risque de récidive plus faible observé comparativement aux tumeurs HPV négatives (Syrjänen 2010; Syrjänen et al. 2017).
Tableau 2 : Principaux facteurs de risque en fonction des répartitions par localisation et par type tissulaire des cancers des VADS (Haute Autorité de Santé)
Localisation Histologie
la plus fréquente
Principaux facteurs
de risque Répartition
Cavité buccale Carcinome épidermoïde Alcool et Tabac 20-25 %
Oropharynx Carcinome épidermoïde Alcool et Tabac
HPV +++
10-15 %
Hypopharynx Carcinome épidermoïde Alcool et Tabac 25-30 %
Larynx Carcinome épidermoïde Alcool et Tabac 30-35 %
Sinus Ethmoïde
et fosses nasales Adénocarcinome Expositions professionnelles
(poussières de bois) < 1 % Nasopharynx, cavum et rhinopharynx Carcinome indifférencié de type nasopharyngé
Virus Epstein Barr (EBV) Facteurs alimentaires
Facteurs génétiques Origine géographique (Asie du
Sud-Est, Méditerranée)
< 1 %
Carcinome
adenoïde kystique Carcinome épidermoïde / < 1 %
o Anomalies génétiques
31 Par ailleurs, un autre facteur de prédisposition aux tumeurs des VADS est l’altération de la protéine p53 soit par mutation des exons 5 à 9, soit par dégradation dans 50 à 80 % des tumeurs (Houten et al. 2002; Graveland et al. 2013; Braakhuis et al. 2014). En effet, la protéine p53 est une protéine suppresseur de tumeur qui intervient dans le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, la senescence et l’autophagie. La majorité des mutations répertoriées sont des mutations non-sens conduisant à la synthèse de protéines tronquées non fonctionnelles dont le turn-over est bloqué comparativement à celui de la protéine sauvage. Les mutations de p53 sont des facteurs de mauvais pronostic conduisant à une survie à 5 ans de l’ordre de 40,7 % contrairement aux patients non mutés (54,8 %) (Poeta et al. 2007, 2009). Par ailleurs, la survie globale des patients porteurs d’une mutation tumorale tronquante est diminuée d’un facteur 2,5 (Plas et al. 2011).
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1.5. Symptomatologie
Les cancers des VADS sont initialement pauci-symptomatiques. Le diagnostic doit être évoqué devant tout symptôme ORL unilatéral et persistant, en particulier devant une adénopathie cervicale isolée. L’ensemble des symptômes dépend de la localisation de la tumeur primaire mais c’est l’augmentation de la masse tumorale qui peut perturber le fonctionnement de la structure ou des structures voisines envahies, qui va être à l’origine de l’apparition des signes cliniques (Tableau 3).
Tableau 3 : Principaux signes cliniques selon la localisation tumorale
Topographie de la tumeur Symptômes
Sinus et fosses nasales Obstruction nasale, rhinorrhée, épistaxis, déformation faciale, diplopie, hypoacousie, anosmie
Cavité buccale et Oropharynx
Ulcération infiltrée souvent indolore et persistante, tuméfaction, trouble de la mobilité linguale, otalgie réflexe,
mobilité dentaire, gingivorragie, gêne à la déglutition, odynophagie
Hypopharynx Dysphagie, otalgie réflexe, dysphonie, douleur
Larynx Dysphonie, dysphagie, dyspnée
Toutes localisations Adénopathie cervicale isolée
1.6. Diagnostic
Il repose sur l’examen clinique associé à la biologie, l’anatomo-pathologie et l’imagerie. Il s’agit de confirmer le cancer, de caractériser la tumeur et de réaliser la bilan d’extension afin de proposer la meilleure stratégie thérapeutique. Il est constitué :
o D’un examen clinique : il consiste à rechercher des facteurs de risque, examiner les cavités buccale et nasales ainsi que les aires ganglionnaires.
o D’un examen histologique des tissus prélevés : il confirme la présence de cellules cancéreuses et permet de classifier la tumeur.
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1.7. Prise en charge thérapeutique
Le bilan pré-thérapeutique évalue les comorbidités du patient et permet d’évaluer la faisabilité des différentes options thérapeutiques. Il consiste en :
o Un bilan biologique (hépatique, rénal, numération formule sanguine, plaquettes, ionogramme, albuminémie) ;
o Une évaluation cardiovasculaire, pulmonaire et hépato-gastro-entérologique ; o Un bilan nutritionnel qui conditionne le pronostic ;
o Un bilan dentaire car la radiothérapie (+/- chimiothérapie) favorise les complications bucco-dentaires et le traitement chirurgical impose fréquemment des résections osseuses avec extractions dentaires.
Ces éléments guideront ensuite la décision thérapeutique discutée dans le cadre d’une réunion de concertation pluridisciplinaire (RCP). Les objectifs du traitement consistent à supprimer la tumeur et les métastases, réduire le risque de récidive, éviter les complications liées au traitement, minimiser les séquelles thérapeutiques, préserver la qualité de vie et proposer un soutien au patient, ainsi qu’à son entourage. En premier lieu, des mesures hygiéno-diététiques doivent être prises avec l’arrêt du tabac et de l’alcool. La stratégie thérapeutique est discutée selon l’organe concerné, la topographie de la tumeur, son type cellulaire histologique, son grade (degré d’agressivité) et son stade (volume, extension…) mais aussi de la présence d’une tumeur primitive synchrone des VADS (œsophage ou poumons), de l’état général du patient et de son choix éclairé.
La classification TNM (Tumor Node Metastasis) établie par l’Union Internationale Contre le Cancer permet de déterminer les différents stades tumoraux (stade 1 à 4) et de caractériser la tumeur. Le score T est un indicateur de la taille de la tumeur, alors que les scores N et M permettent respectivement de notifier le degré éventuel d’extension ganglionnaire de la tumeur et la présence de métastases à distance.
Un des enjeux influant sur le choix du plan de traitement sera de préserver au maximum les fonctions respiratoires, phonatoires et de déglutition ainsi que la qualité de vie. En fonction de l’ensemble de ce bilan, la stratégie thérapeutique est définie et va impliquer la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, seules ou en association :
34 une information pronostique importante. Pour des cancers évolués, les interventions peuvent êtres mutilantes et conduirent à la perte de la voix et/ou de la dégutition. La chirurgie peut être associée à la radiothérapie, et cette dernière à de la chimiothérapie afin d’augmenter l’efficacité du traitement. La chirurgie permet également, dans certains cas, de reconstruire les modifications anatomiques et de traiter différentes séquelles engendrées par la maladie ou par les traitements reçus.
o La radiothérapie : la radiothérapie externe conformationnelle avec modulation d’intensité, permet le traitement de la tumeur et/ou des aires ganglionnaires cervicales en utilisant des rayonnements ionisants qui ciblent la tumeur tout en préservant les tissus et organes avoisinants sains. Elle peut cibler la tumeur, mais également le lit tumoral et/ou les chaînes ganglionnaires du cou. Elle peut être utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie et/ou la chirurgie, afin d’augmenter l’efficacité du traitement ou de diminuer les séquelles fonctionnelles. Elle est parfois utilisée pour prendre en charge certains symptômes engendrés par la maladie telle que les douleurs liées aux métastases osseuses.
Dans le cas de certains cancers localement évolués du larynx et de l’hypopharynx mais aussi dans les stades III et IV, le concept de «préservation d’organe» qui repose sur la chimiothérapie et la radiothérapie, est primordial afin d’éviter la laryngectomie totale et ses séquelles, et ainsi maintenir la qualité de vie du patient. Les nouvelles technologies et techniques de radiothérapie (Chapitre 2) ont pour objectif la réduction de la dose reçue par les organes sains situés à proximité de la tumeur. Le plus souvent, le plan de traitement consiste à administrer 65 à 70 Gy pendant 7 à 8 semaines à raison d’une séance par jour, 5 jours par semaine (Bourhis et al. 2012). Cette dose est administrée en première intention et peut être associée à de la chimiothérapie ou à des thérapies ciblées. Des schémas d’hypo ou d’hyper fractionnement peuvent parfois être proposés (Lacas et al. 2017). En post-opératoire, la radiothérapie doit être débutée au plus tard dans les sept semaines après la chirurgie, ceci en fonction de la localisation tumorale initiale et de la qualité de l’exérèse. Elle repose sur la délivrance d’une dose de 50 à 65 Gy en 5 à 6,5 semaines, à raison d’une séance par jour, 5 jours par semaine au niveau du lit tumoral et/ou des aires ganglionnaires.
35 moindres (Mizoe et al. 2012; Jingu et al. 2012). En cas de haut risque de rechute locorégionale et plus rarement, une chimiothérapie adjuvante peut être proposée.
Dans le cas de certaines tumeurs accessibles de petits volumes et bien limitées (lèvres, face, cavité buccale à distance des arcades dentaires et de l’oropharynx), la curiethérapie, interstitielle, qui consiste à introduire une source radioactive miniaturisée dans la tumeur peut être indiquée (Skowronek 2017). La dose peut être délivrée de manière fractionnée ou en une seule fois, ce qui peut nécessiter plusieurs jours d’hospitalisation en chambre radio-protégée.
o La chimiothérapie : les traitements systémiques permettent d’atteindre les cellules cancéreuses quelle que soit leur localisation, même si elles sont isolées et non détectées au diagnostic. La chimiothérapie agit sur les mécanismes de réplication de l’ADN et de division cellulaire alors que les thérapies ciblées bloquent préférentiellement des voies de transduction de signaux prolifératifs, parfois spécifiques aux cellules cancéreuses mais aussi aspécifiques et donc responsables de toxicités qui peuvent être extrêmement sévères. La chimiothérapie peut être concomitante : les médicaments anti-cancéreux sont dans ce cas administrés en association avec la radiothérapie ou après une chirurgie. Cette stratégie thérapeutique induit une cytotoxicité sélective et/ou une radiosensibilisation des cellules hypoxiques en redistribuant les cellules dans le cycle cellulaire, ce qui augmenterait l’apoptose et favoriserait la réoxygénation tumorale (Krstevska et al. 2012; Krstevska 2012). Elle est utilisée en préservation d’organes, afin de selectionner les tumeurs chimio-sensibles (et donc statistiquement radio-sensibles), permettant d’éviter une chirurgie mutilante, mais également afin de diminuer le risque de métastases. Plusieurs molécules sont le plus souvent combinées en une poly-chimiothérapie.
Dans les cancers des VADS, la chimiothérapie d’induction ou « néo-adjuvante » utilisée par voie veineuse est indiquée dans la réduction de la taille des tumeurs de stade III ou IV ou lors de risque élevé de propagation. Le protocole le plus utilisé est l’association de TPF (Taxotère®, sels de platine et fluoro-pyrimidines) administrés en 2 ou 3 cycles au patient (Leduc et al. 2018). Une évaluation de la réponse tumorale est effectuée au cours des cycles, à la suite de laquelle une radiothérapie fractionnée est préconisée, permettant d’éviter une chirurgie mutilante. Dans le cas contraire, une exérèse chirurgicale est conseillée suivie d’une radiothérapie, augmentant ainsi le taux de survie globale (Vermorken et al. 2013).
contre-36 indications aux traitements curatifs. Les médicaments prescrits, les doses administrées, ainsi que le rythme des cures varient d’une personne à l’autre, en fonction des caractéristiques du cancer, de l’état de santé général du patient, des effets secondaires connus et de la tolérance au traitement. Le plan de traitement est déterminé au cas par cas en fonction de ces paramètres.
L’arsenal chimio-thérapeutique est varié et repose sur l’association TPF, la plus souvent utilisée et qui donne les meilleurs résultats :
o Le 5-fluorouracile : le 5-FU est un antinéoplasique cytostatique qui inhibe la synthèse d'ADN (acide désoxyribonucléique) et freine la prolifération cellulaire. Il induit une transcription erronée mais également inhibe la thymidilate synthase (Longley et al. 2003 a,b). Il est utilisé seul ou en poly-chimiothérapie.
o Les dérivés du platine (cisplatine et carboplatine) : cet antinéoplasique cytostatique se fixe sur les bases puriques (G et A) de l’ADN. Il entraîne un changement de conformation de la double hélice de l’ADN et induit une diminution de la réplication et de la transcription. Il contribue également à l’augmentation du stress oxydatif dans les cellules (Galluzzi et al. 2012). Ils sont utilisés seuls ou en poly-chimiothérapie.
o Le docetaxel (Taxotère®) : cet agent antinéoplasique, non mutagène, favorise l'assemblage de la tubuline en microtubules stables et inhibe leur dépolymérisation. Les taxanes sont également des inhibiteurs puissants de la duplication du centromère, provoquant une désorganisation de la mitose. Les cellules meurent par apoptose et s’arrêtent en mitose (William et al. 2018).
37 diminution de la croissance tumorale des tumeurs HNSCC (Nanbu et al. 2018). L’erlotinib, quant à lui favorise la mort cellulaire et la diminution de la prolifération (Wu and Song 2017). Cependant, ces stratégies n’ont pas encore apporté la preuve de leur efficacité en clinique.
