La représentation des différents acteurs concernant les tâches d’orientation

Para avaliação da guanilato ciclase solúvel (GMPc) no efeito protetor da via HO- 1/biliverdina/CO, os animais foram tratados com ODQ (um inibidor da enzima guanilato ciclase solúvel) na dose de 12,5 mg/Kg, ou salina por gavagem. Trinta minutos depois da administração do ODQ, os camundongos foram tratados com hemina (3,0 mg/kg), biliverdina (3,0 mg/kg) ou DMDC (12,5 µmol/Kg), por via intraperitoneal. Os grupos controles receberam apenas a solução salina ou INDO ou hemina, biliverdina e DMDC associado a INDO. Após 30 min, a lesão gástrica foi induzida pela administração de INDO, por gavagem, na dose de 30 mg/Kg. Três horas após a administração de INDO, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos foram rapidamente removidos e abertos ao longo da grande curvatura para avaliação das lesões gástricas, de acordo com a metodologia descrita na seção anterior utilizando um

paquímetro digital e uma lupa com aumento de cerca de 3X. O índice de lesão (I.L.) foi considerado como a somatória das extensões de todas as erosões encontradas na mucosa do órgão (SANTUCCI et al., 1994). A seguir, amostras do estômago foram retiradas, pesadas e congeladas a -70 graus para dosagem mieloperoxidase (MPO), malondialdeído (MDA) e glutationa reduzida (GSH).

4.12. PAPEL DA NO SINTASE NO EFEITO PROTETOR DA HEMINA, BILIVERDINA OU DO DECACARBONIL DIMANGANÊS (DMDC) NA LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL EM CAMUNDONGOS.

L-NAME, um inibidor não seletivo da enzima óxido nítrico sintase (NOS), foi utilizado para verificar a participação do óxido nítrico (NO) no efeito protetor da hemina, biliverdina ou DMDC. L-NAME, na dose de 3,0 mg/Kg, ou salina foram administrados por intraperitoneal, trinta minutos antes da administração de hemina (3,0 mg/kg), biliverdina (3,0 mg/kg) ou DMDC (12,5 µ mol/Kg), por via intraperitoneal. Após 1 hora da administração de L-NAME, etanol 50% (0,5 ml/Kg) foi administrado por gavagem, para induzir a lesão gástrica. Os grupos controles receberam apenas a solução salina ou etanol 50%. Uma hora após a adição do etanol, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos foram rapidamente removidos e abertos ao longo da grande curvatura para avaliação das lesões gástricas, de acordo com a metodologia descrita na seção anterior utilizando um programa de planimetria computadorizada (Image J). A seguir, amostras do estômago foram retiradas, pesadas e congeladas a -70 graus para posterior dosagem de malondialdeído (MDA) e glutationa reduzida (GSH).

4.13. PAPEL DA NO SINTASE NO EFEITO PROTETOR DA HEMINA, BILIVERDINA OU DO DECACARBONIL DIMANGANÊS (DMDC) NA LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR INDOMETACINA (INDO) EM CAMUNDONGOS.

Para determinar o envolvimento da enzima óxido nítrico sintase (NOS) na gastroproteção induzida pela hemina, biliverdina ou DMDC, os animais foram pré-tratados com L-NAME, um inibidor não seletivo da NOS, na dose de 3,0 mg/Kg. L-NAME foi administrado por intraperitoneal, trinta minutos antes da administração de hemina (3,0 mg/kg), biliverdina (3,0 mg/kg) ou DMDC (12,5 µmol/Kg), por via intraperitoneal. Após 1 hora da administração de L-NAME, INDO (30 mg/Kg) foi administrado por gavagem, para induzir a lesão gástrica. Os grupos controles receberam apenas a solução salina ou INDO ou hemina, biliverdina e DMDC associado a INDO. Três horas após a administração de INDO, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos foram rapidamente removidos e abertos ao longo da grande curvatura para avaliação das lesões gástricas, de acordo com a metodologia descrita na seção anterior utilizando um paquímetro digital e uma lupa com aumento de cerca de 3X. O índice de lesão (I.L.) foi considerado como a somatória das extensões de todas as erosões encontradas na mucosa do órgão (SANTUCCI et al., 1994). A seguir, amostras do estômago foram retiradas, pesadas e congeladas a -70 graus para dosagem mieloperoxidase (MPO), malondialdeído (MDA) e glutationa reduzida (GSH).

4.14. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE MALONDIALDEÍDO (MDA) NA MUCOSA GÁSTRICA DE CAMUNDONGOS.

Os níveis de malondialdeído na mucosa gástrica foram determinados pelo método de Uchiyama e Mihara (1978). Fragmentos da mucosa gástrica de camundongos submetidos aos tratamentos citados anteriormente foram homogeneizados com KCl gelado 1.15% para obtenção de um homogenato à 10% . Meio mililitro (0,5ml) do homogenato foi pipetado dentro de um tubo de centrífuga de 10 ml, contendo 3 ml de H3PO4 (1%) e 1 ml

de uma solução aquosa de ácido tiobarbitúrico aquoso (0,6%). Posteriormente, os tubos foram aquecidos, por um período de 45 minutos, em um banho de água fervendo e a mistura reacional foi, então, resfriada em um banho de água gelada, seguida da adição de 4 ml de n-butanol. Após a adição de n-butanol, as amostras foram agitadas por 40 segundos em um misturador "vortex", e depois centrifugados a 1200 xg, por um período de 10 minutos. O sobrenadante foi mensurado a uma absorbância de 520 e 535 nm, em espectrofotômetro. Os resultados foram expressos em nmol/g de tecido gástrico.

4.15. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE GLUTATIONA REDUZIDA (GSH) NA MUCOSA GÁSTRICA DE CAMUNDONGOS.

A dosagem de GSH foi realizada através determinação dos grupos sufidrílicos não protéicos (glutationa), de acordo com a metodologia descrita por Sedlak & Lindsay (SEDLAK & LINDSAY, 1968), das amostras de tecidos gástricos de camundongos submetidos aos tratamentos anteriores citado. A determinação do GSH baseia-se na reação do DTNB, com o tiol livre originando o ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. Inicialmente, 50-100 mg da mucosa gástrica foi homogeneizado em EDTA 0,02 M (1 ml/100 g de tecido)

gelado. A uma alíquota de 400 µl do homogenato foi adicionado 320 µl de água destilada, e 80 µl de ácido tricloroacético (TCA) a 50%. Em seguida o material foi centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos, seguido de agitação e filtração. Depois de centrifugado, 400 µl do sobrenadantes foram misturados a 800 µl de tampão Tris 0,4 M (pH 8.9) e, por fim, foi adicionado 20 µl de DTNB (5,5´-dithio-bis -2- ácido nitrobenzóico) a 0,01M. O material foi então agitado durante 3 minutos e a absorbância foi determina a 412 nm, em espectrofotômetro. A concentração de GSH/g de tecido foi determinada a partir de uma curva padrão de glutationa reduzida, processada de maneira semelhante. Os resultados foram expressos em µ g de GSH/g de tecido.

4.16. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE BILIRRUBINA NA MUCOSA GÁSTRICA DE CAMUNDONGOS.

A concentração de bilirrubina na mucosa gástrica foi medida de acordo com o protocolo descrito por Foresti et al. (2003), com algumas modificações. Inicialmente, 100 mg do tecido gástrico foi homogeinezado em 1 ml de salina. A uma alíquota de 500 µl do homogenato foram adicionadas 250 mg de BaCl2 e misturado vigorosamente. Depois, 0,75

ml de benzeno foram adicionados ás amostras e imediatamente misturado em um vortex. A fase benzênica contendo a bilirrubina extraída foi separada da fase aquosa por centrifugação a 13000 g por 30 minutos. Uma curva para bilirrubina padrão foi obtida utilizando bilirrubina comercial (Labtest, Brasil). A concentração de bilirrubina nas amostras de tecido gástrico foi mensurada por espectrofotômetro e calculadas pela diferença das absorbâncias, entre 450 e 600 nm. A concentração de bilirrubina foi expressa como mg/dL.

4.17. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE MIELOPEROXIDASE (MPO)

NA MUCOSA GÁSTRICA DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À