HMGB1 et TOX4 sont deux protéines à boîte HMG sans spécificité de reconnaissance. La structure de TOX4 n’a pas encore été précisément étudiée. Nous pouvons cependant signaler que HMGB1 possède deux boîtes HMG, contrairement à TOX4 qui n’en possède qu’une seule (Lee et al., 2009). Nous avons étudié l’affinité d’HMGB1 pour les adduits de nos trois dérivés du platine. La seconde étape fut la détermination de l’affinité de TOX4 pour les mêmes lésions, afin de mieux comprendre le fonctionnement du complexe PTW/PP dans lequel cette protéine est impliquée.
1. Affinité d’HMGB1 pour les sondes platinées
HMGB1 s’est avérée capable de se fixer sur nos sondes oligonucléotidiques lésées et non lésées. Cependant, nous sommes parvenus à observer des comportements différents pour chaque sonde. Tout d’abord, HMGB1 a démontré une capacité équivalente de fixation sur les adduits du cisplatine et du JM118. De plus, l’association formée est restée stable au cours du temps. Lors de nos expériences successives, nous ne sommes pas parvenus à établir une différence d’affinité d’HMGB1 pour ces deux lésions. En effet, l’amplitude de la variation de réflectivité était systématiquement équivalente pour chacune de ces deux lésions. Dans le cas de l’oxaliplatine, HMGB1 s’associe aux sondes de façon similaire à ce qui est observé avec les deux lésions précédemment citées, mais le complexe formé est moins stable et la protéine se dissocie progressivement de la lésion, ce qui indique une plus faible affinité. Nos résultats semblent donc indiquer la séquence suivante : affinité de HMGB1 pour l’adduit 1,2-d(GpG)- cisplatine ≈ affinité pour l’adduit 1,2-d(GpG)-JM118 > affinité pour l’adduit 1,2-d(GpG)- oxaliplatine.
Ces données ne sont pas en parfaite adéquation avec celles obtenues par EMSA (Figure 67) lors d’une comparaison de l’affinité d’HMGB1 pour les adduits 1,2-d(GpG) produits par ces trois dérivés (Vaisman et al., 1999). Ces travaux indiquent que les adduits du
cisplatine sont mieux reconnus par HMGB1 que ceux de l’oxaliplatine et du satraplatine (soit cisplatine > satraplatine ≈ oxaliplatine). Les différences de déformation de la structure de l’ADN selon les adduits, en raison de l’encombrement stérique apporté par les groupements transporteurs de l’oxaliplatine et du cisplatine, sont certainement responsables de cette affinité variable. Notre biopuce n’a permis qu’une confirmation partielle de ces observations.
Figure 67 : L’affinité différentielle de HMGB1 pour l’adduit 1,-2d(GpG) généré par
le cisplatine, l’oxaliplatine et le satraplatine. (A) Résultats de l’expérience d’EMSA à l’aide d’oligonucléotides lésés. (B) Quantification de la fraction d’ADN lié sur chaque type de sonde : ● = cisplatine ; ▼ = oxaliplatine ; ■ = satraplatine ; O = contrôle (adapté de Vaisman et al., 1999).
D’une façon générale, HMGB1 est capable de se fixer sur l’ADN double-brin, bien qu’elle possède une préférence très marquée pour les structures tridimensionnelles inhabituelles. Cette aptitude justifie le fait que la sonde double-brin a été reconnue par la protéine, puis que celle-ci s’en soit dissociée. De plus, en raison de la longueur de nos sondes, il était envisageable que plusieurs molécules viennent s’y fixer, interagissant spécifiquement avec la lésion, ou aléatoirement avec le reste de la séquence pour s’en détacher ensuite. Chaque domaine HMG d’HMGB1 nécessite en effet moins de dix bases pour se fixer sur l’adduit (He et al., 2000b). Lors de nos expériences, ce phénomène a été bien illustré par la perte de signal lors de la phase de rinçage qui, dans le cas d’HMGB1 et des adduits du cisplatine et du JM118, correspond exactement à la perte de signal enregistrée avec la sonde double-brin non lésée.
La première série d’expériences que nous avons menée avec HMGB1 nous avait permis de visualiser une interaction d’HMGB1 avec la sonde simple-brin supérieure à celle constatée pour la sonde double-brin non lésée. Ceci semblait en accord avec les travaux d’Isackson et al., qui avaient montré à l’aide d’une expérience simple (interaction de la
protéine avec ADN simple- et double-brin immobilisés sur colonne) que HMGB1 possède une plus grande capacité de liaison à l’ADN simple-brin qu’à l’ADN double-brin (Isackson et
al., 1979). Cependant, si une certaine affinité de la protéine (lot identique) pour la sonde
simple-brin a toujours été observée au cours des expériences ultérieures (signaux supérieurs à ceux enregistrés pour les plots pyrrolés), cette interaction ne s’est jamais avérée supérieure à celle observée pour la sonde double-brin non lésée par la suite.
2. Affinité de TOX4 pour les sondes platinées
TOX4 a été analysée en parallèle d’HMGB1. Elle s’est également avérée capable d’interagir avec les sondes lésées avec une affinité supérieure à celle observée pour la sonde double-brin non lésée. Ceci confirme donc les résultats obtenus par notre approche combinant
ligand fishing et protéomique. En raison d’un manque de reproductibilité entre les
expériences successives, les données mesurées n’ont cependant pas permis d’établir une préférence de TOX4 pour l’une ou l’autre des trois lésions. Remarquons que les signaux mesurés lors de l’interaction de TOX4 avec les sondes, étaient globalement de plus faible amplitude que ceux obtenus avec HMGB1 sur les mêmes biopuces. Ceci peut bien sûr indiquer de plus faibles capacités de reconnaissance de l’ADN lésé pour TOX4, d’autant plus que notre version recombinante était d’une taille deux fois supérieure à celle d’HMGB1 (94,4kDa contre 50kDa), une caractéristique plutôt à même de renforcer le signal d’interaction (celui-ci dépend en partie de la taille des analytes se fixant sur les sondes). Cependant, en raison de la source de protéine utilisée, nous ne pouvons malheureusement pas être certains que l’amplitude des signaux observés reflète une activité optimale de TOX4. Nous disposions en effet d’une version recombinante de la protéine produite in vitro à l’aide d’un système d’expression cell free, ne pouvant introduire toutes les modifications post- traductionnelles potentiellement nécessaires à la parfaite fonctionnalité de la protéine.
La principale différence entre HMGB1 et TOX4 est l’incapacité de cette dernière à reconnaître l’ADN simple-brin. Nous pouvons émettre l’hypothèse que, en raison de la présence d’une seule boîte HMG, TOX4 est potentiellement moins capable de former un complexe stable avec l’ADN en général, et avec l’ADN lésé en particulier. En outre, son rôle putatif de facteur de transcription, que ne partage pas HMGB1, confère peut-être à TOX4 des spécificités de séquences et/ou de motifs qui la rendent moins à même d’interagir avec toutes les formes d’ADN.
Ainsi, notre étude a permis d’effectuer une validation qualitative des capacités d’interaction de TOX4. Des travaux d’optimisation sont encore nécessaires pour aboutir à une puce SPRi parfaitement fonctionnelle, qui permettra une caractérisation fine de l’interaction mesurée (détermination des paramètres thermodynamiques). Nous sommes parvenus, au cours de nos travaux, à identifier les paramètres critiques ainsi que des solutions qui peuvent
être apportées pour contourner les obstacles expérimentaux, ce qui permettra à terme de finaliser la construction d’une biopuce efficace.
D’après nous, la méthode ne peut se passer, pour l’instant, de techniques de référence plus éprouvées (telles que l’EMSA) pour la validation des paramètres thermodynamiques lorsqu’il sera possible de les déterminer. Cependant, il faut remarquer que dans la série d’expériences, déjà évoquée au cours de notre introduction bibliographique, mettant en œuvre l’anisotropie de fluorescence (Hey et al., 2001), les constantes de dissociation observées pour la protéine XPA sur une séquence platinée sont 20 fois plus grandes que celles obtenues pour la même protéine et la même lésion par la méthode de SPR (Wang et al., 2000). Ceci illustre bien le fait que la mesure de tels paramètres est fortement dépendante du support utilisé (notamment de la taille de la séquence oligonucléotidique sonde), ce qui constitue un inconvénient de taille (Draghici et al., 2006).
Les deux premières parties de ce travail ont permis d’optimiser deux approches technologiques complémentaires. Dans une troisième partie, nous avons souhaité appliquer cs méthodes à une autre problématique : la protéine DDB2 et son rôle en tant que membre de l’interactome des lésions de l’ADN. Ce dernier thème nous a permis de tester nos méthodes sur d’autres modèles.
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