Dans un dernier temps, nous avons souhaité vérifier les capacités d’interaction d’une version recombinante de TOX4, HMGB1 faisant office de contrôle positif. En raison des signaux peu élevés enregistrés pour les plus faibles densités de greffage (0,5 et 2µM) lors de l’expérience portant uniquement sur HMGB1, nous avons choisi de réintroduire une densité plus élevée. Les concentrations de sondes choisies pour le dépôt sont : 2µM, 5µM et 10µM.
Les signaux correspondant à l’hybridation des cibles sur les sondes sont présentés sur la Figure 65. Parmi les deux densités de greffage les plus élevées, ce sont les ROI correspondant à la concentration 5µM qui ont produit les sensorgrammes les plus homogènes. Cette densité a donc été sélectionnée pour l’étude de l’interaction des protéines avec les sondes. À cette densité, c’est la construction portant l’adduit cisplatine qui a produit le plus faible signal. On remarque pour les autres types de sondes une bonne homogénéité à cette même densité : 1,40% de réflectivité pour le JM118 et l’ODN non lésé, 1,10% pour l’oxaliplatine. Les mesures pour la sonde non lésée ont de nouveau été utilisées pour effectuer la normalisation des signaux d’interaction.
Figure 65 : Hybridation séquentielle des cibles/sondes sur la troisième version de la
biopuce supportant la fixation d’adduits cisplatine, oxaliplatine et JM118. L’ordre d’injection est : [ODN JM118-Zip4C] ; [ODN non lésé-Zip6C] ; [ODN cisplatine- Zip7C] ; [ODN oxaliplatine-Zip9C].
Les protéines HMGB1 et TOX4 ont été successivement injectées (concentrations 20 et 40nM) avec une étape de régénération saline intermédiaire. De plus, un contrôle négatif a cette fois été ajouté, à savoir la BSA (version commerciale ultrapure) injectée dans les mêmes conditions que les deux protéines d’intérêt. Les sensorgrammes obtenus pour la concentration 20nM de chaque facteur sont visibles sur la Figure 66.
On y constate tout d’abord une absence totale de signal mesuré pour la BSA, une observation également faite à 40nM. Pour HMGB1, de très forts signaux d’interaction pour les sondes cisplatine (3,3%) et JM118 (3,2%) ont été enregistrés. La variation de réflectivité observée pour les sondes oxaliplatine est inférieure (2,7%), suivie par celle mesurée pour les sondes ODN non lésé (2,4%). On remarquera donc la part très significative de l’interaction aspécifique avec l’ADN double-brin : après soustraction, le signal résiduel correspondant à l’interaction les lésions atteint 0,8% pour le cisplatine, 0,7% pour le JM118 et 0,4% pour l’oxaliplatine. Lors de la phase de rinçage (30min à débit identique) les sondes JM118 ne
connaissent aucune diminution de signal, alors que les sondes cisplatine enregistrent une perte d’1/4 du signal, et les sondes oxaliplatine une réduction de près de 3/5. En outre, à l’instar de la deuxième série d’expériences, le signal obtenu pour la sonde ODN non lésée est encore une fois bien supérieur au signal produit par les sondes simple-brin, qui atteint 1,2%.
Figure 66 : Capacités d’association/dissociation comparatives d’HMGB1, TOX4 et
la BSA (20nM) pour les adduits 1,2-d(GpG) formés par le cisplatine, l’oxaliplatine et le JM118.
La protéine TOX4, à concentration égale à celle d’HMGB1, engendre des signaux moins forts sur chaque sonde présente. Ceci paraît indiquer une affinité inférieure. Les signaux les plus importants pour TOX4 sont mesurés sur les sondes cisplatine (1,5%), suivie
par les sondes oxaliplatine (1,2%), JM118 (1,1%), ODN non lésé (0,9%). La séquence ASO- A-24 ne produit pas un signal dépassant celui des plots de PPy, ce qui semble indiquer une incapacité totale de cette version de TOX4 d’interagir avec l’ADN simple-brin non lésé. Lors de la phase de rinçage (après soustraction du signal des sondes ODN non lésé), on observe une perte de 1/10 du signal pour les sondes cisplatine, 1/4 du signal pour les sondes oxaliplatine, et aucune variation pour les sondes JM118. Une augmentation du débit lors de la phase de rinçage n’a pas généré de rupture de pente, indiquant qu’une éventuelle réassociation des protéines avec des sondes en aval n’est pas observée, ou est négligeable.
Cependant, la hiérarchie d’affinité de TOX4 pour les adduits 1,2-d(GpG) des trois dérivés du platine qui a été notée ici (cisplatine > oxaliplatine > JM2118) n’a pu être totalement validée lorsque l’expérience a été réitérée sur un autre prisme fonctionnalisé de façon identique. En effet, si les signaux obtenus pour les sondes portant les adduits étaient systématiquement supérieurs à ceux pour les sondes non lésées, et ceci pour les deux protéines, l’ordre précis n’était pas reproduit : la protéine a alternativement démontré une préférence variable selon les expérimentations pour chacun des trois adduits.
Nous avons donc conclu que TOX4 possède une préférence pour l’ADN lésé par les trois dérivés du platine considérés versus l’ADN double-brin non lésé, et qu’elle ne semble pas capable d’interagir avec l’ADN simple-brin. Cette affinité est cependant inférieure à celle d’HMGB1, autre protéine à boîte HMG, pour les mêmes lésions. De plus, la version recombinante utilisée ainsi que les configurations actuelles du prisme et du protocole SPRi ne nous permettent pas de trancher définitivement à propos d’une affinité supérieure de cette protéine pour l’un ou l’autre de ces adduits.
III. Discussion
À travers notre approche de ligand fishing nous sommes parvenus à capturer, parmi d’autres protéines, HMGB1 et TOX4 sur les adduits générés par trois dérivés du platine. La première de ces protéines était un membre déjà connu de l’interactome des lésions du cisplatine, alors que la seconde a été identifiée par nos travaux. Notre système de ligand
fishing ne nous a pas permis de déterminer une éventuelle préférence de ces protéines pour les
lésions de l’un ou l’autre des trois dérivés du platine. De ce fait, nous avons souhaité vérifier ces caractéristiques à l’aide d’une autre méthode. La SPRi avait déjà été utilisée par notre laboratoire pour étudier les propriétés de fixation et d’excision de glycosylases sur des bases oxydées et sites abasiques (Corne et al., 2008; Fuchs, 2009). Cette approche, autorisant l’étude de plusieurs interactions en parallèle, nous a semblé appropriée à l’objectif fixé. Nous avons donc adapté un format de biopuce SPRi servant à mesurer les capacités d’interaction de protéines avec des sondes comportant l’adduit 1,2-d(GpG) du cisplatine, de l’oxaliplatine ou du JM118. La biopuce a été utilisée avec des versions recombinantes d’HMGB1 et TOX4. Cette dernière est un des membres du complexe PTW/PP. Elle possède une boîte HMG, ce qui est susceptible de faire d’elle, au sein du complexe, le facteur responsable de l’interaction avec les adduits platinés. Également disponible sous forme recombinante, TOX4 nous a ainsi paru être un candidat adéquat pour l’évaluation de ses capacités d’interaction.
Dans un premier temps, nous allons discuter de la méthode, en insistant sur ses points forts mais aussi sur les points faibles que nous avons identifiés au travers de nos expériences. Ensuite, nous reviendrons sur les interactions que nous avons observées pour chacune des deux protéines.