1. Culture des cellules Stress UVB
Les cellules sont cultivées et irradiées dans les mêmes conditions que pour la mesure de capacités de réparation des photoproduits. Les temps de récolte post-irradiation et le nombre de boîtes nécessaires à chacun de ces temps est indiqué dans le Tableau 21.
Temps 04h00 24h00 36h00 48h00 Non irradiées
Nombre total de
bp60 3 3 3 3 3
Tableau 21 : Nombre de bp60 nécessaires pour chaque condition lors de la mesure
d’expression de gènes suite à un stress UV.
Traitement au cisplatine
Les cellules sont cultivées et traitées avec le cisplatine exactement dans les mêmes conditions que lors du test de réparation des adduits du cisplatine.
2. Extraction de l’ARN total
L’ARN total des culots cellulaires est extrait à l’aide du kit GenEluteTM Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) selon le protocole du fabricant. Brièvement, les culots cellulaires sont soigneusement resuspendus dans la solution de lyse 1% 2-
mercaptoéthanol, puis le lysat est placé sur une colonne GenElute Filtration et centrifugé à 16 000g durant 2 min. À l’éluat est ajouté un volume d’EtOH 70%, et l’échantillon est soigneusement homogénéisé. Ce mélange est disposé sur une colonne GenElute Binding, qui est centrifugée à 16 000g durant 30sec. L’éluat est éliminé, et les acides nucléiques fixés sur la colonne rincés par ajout d’un volume de solution de lavage n°1 puis une centrifugation à 16 000g durant 30sec. Chaque colonne reçoit ensuite 80µl d’une solution de DNaseI (10µL d’enzyme et 70µL de tampon RDD, mélangés par inversion) et est incubée à température ambiante durant 15min, ce qui permet de dégrader tout ADN présent qui est ensuite éliminé par rinçage à l’aide d’un volume de solution de lavage n°1 et une centrifugation, puis par deux rinçages avec 500µl de solution de lavage n°2 80% EtOH puis centrifugation. 50µl de solution d’élution de l’ARN sont disposés sur chaque colonne, ce qui permet de récupérer une solution contenant l’ARN, et dont la concentration et le taux de contamination en protéines sont dosés par mesure d’absorbance à 260 et 280nm à l’aide du NanoDrop 1000. Une concentration supérieure à 200ng/µl est acceptable afin de réaliser une qPCR sur l’échantillon, ainsi qu’un rapport 260/280 entre 1,7 et 2,1 pour une préparation d’une pureté acceptable. L’ARN ainsi obtenu est conservé à -80°C.
L’intégrité de la préparation est vérifiée en déposant sur gel natif (1% agarose 0,5X TBE 0,5µg/µl bromure d’éthidium) 500ng d’ARN dans un tampon de dépôt (15% ficoll 0,25% cyanol de xylène 0,25% bleu de bromophénol), et en confirmant la présence de deux bandes correspondant aux ARN ribosomiques 18s et 28s (intensité relative 2:1, respectivement). Le marqueur de taille utilisé est le 1kb ladder (Invitrogen).
3. Rétrotranscription
La rétrotranscription de l’ARN total en ADNc est réalisée à l’aide du kit SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Brièvement, pour chaque échantillon 2µg d’ARN sont mélangés à 1µl d’amorces random primers (Promega), 1µl de dNTP 10mM (Sigma) et 12µl d’eau RNase free. Les échantillons sont chauffés à 70°C pendant 5min puis rapidement refroidis par transfert dans la glace. Après une courte centrifugation afin d’éliminer la condensation, 4µl de tampon First Strand Buffer 5X, 2µl de DTT 0,1M et 1µl d’inhibiteur de RNase (Sigma) sont ajoutés, le mélange homogénéisé puis incubé durant 2min à 25°C. Enfin, l’enzyme superscript II RT (200U, 1µl), est ajoutée et chaque échantillon incubé durant 10min à 25°C puis durant 50min à 42°C. À l’issue de la réaction de rétrotranscription, l’enzyme est inactivée par chauffage à 70°C durant 15min, et la solution d’ADNc conservée à -20°C.
4. PCR quantitative Test des amorces
Les séquences des amorces choisies pour nos gènes d’intérêt sont présentées dans le Tableau 22. À l’exception de S18 (Javeri et al., 2008), TOX4, PNUTS (établies par nos soins à l’aide du programme Primer3 ; url : http://frodo.wit.mit.edu/primer3/), les séquences ont été déterminées dans le cadre d’une étude portant sur l’implication de la réparation de l’ADN dans la maladie d’Alzheimer (Anne Forestier). Elles ont été obtenues auprès d’Eurogentec.
Ces amorces ont été testées sur de l’ADNc de fibroblastes ([C] = 20ng/µl) disponible dans notre laboratoire. Dix dilutions séquentielles de cet ADNc dans l’eau ont été réalisées et déposées en double sur une plaque qPCR 96-well plate non-skirted high profile (Eurogentec), en ajoutant un contrôle sans ADNc (non template). Chaque puits reçoit ensuite :
- 12,5 µL de MESA BLUE qPCR MasterMix contenant la Taq polymérase (Eurogentec) et le fluorophore SYBR Green, s’intercalant dans l’ADN
- 2,5 µL d’amorce forward (concentration du stock : 2µM) - 2,5 µL d’amorce reverse (concentration du stock : 2µM) - 2,5 µL eau RNase free (Sigma).
La plaque est recouverte d’un cache transparent et centrifugée durant 3min à 700rpm. L’amplification et la lecture de fluorescence sont réalisées sur un thermocycleur MX3005P Multiplex Quantitative PCR sous le contrôle du logiciel MXPro (Stratagene Agilent Technologies) en utilisant le profil thermique suivant :
- 5 minutes à 95°C (activation de la polymérase) - 15 secondes à 95°C (dénaturation de l’ADN)
- 20 secondes à 55°C (hybridation des amorces) (40 cycles) - 40 secondes à 72°C (synthèse du brin complémentaire)
- 1 minute à 95°C (dénaturation de l’ADN)
- 30 secondes à 55°C (renaturation de l’ADN) détermination de - 30 secondes à 95°C (dénaturation de l’ADN) la courbe de fusion
L’efficacité E des amorces est déterminée par le logiciel MXPro à l’aide de la formule :
Nn = Ninitiale x (1 + E)n
où N est le nombre de copies de la séquence amplifiée et n le nombre de cycles. Pour E = 1 (efficacité de doublement de 100%), le nombre final de copies après n cycles est égal au nombre maximal théorique de copies qu’il est possible d’obtenir avec la quantité initiale de copies. L’efficacité mesurée expérimentalement doit être comprise entre 95 et 105% pour valider un couple d’amorces. L’observation de la courbe de fusion permet quant à elle de
s’assurer, par l’obtention d’un pic unique, qu’un seul produit correspondant à une amplification spécifique est présent dans le mélange.
GÈNE SÉQUENCES DES AMORCES TAILLE DE L’AMPLICON
S18 Forward : AAC GTC TGC CCT ATC AAC TTT
Reverse : TGG ATG TGG TAG CCG TTT TCT
117
Cyclophiline A Forward : TTCATCTGCACTGCCAAGAC
Reverse : TCGAGTTGTCCACAGTCAGC
158
Cyclophiline B Forward : GCAAGATCGAGGTGGAGAAG
Reverse : CTGTGGAATGTGAGGGGAGT
171
GAPDH Forward : GAGTCAACGGATTTGGTCGT
Reverse : TTGATTTTGGAGGGATCTCG
238
DDB2 Forward : TCAAGGACAAACCCACCTTC
Reverse : GTGACCACCATTCGGCTACT
226
TOX4 Forward : TGGAAAGTAGTCCTGAGCGGCCT
Reverse : AGGCTGGGGTGAGAGTGCCA
176
PNUTS Forward : CTGAGCCCGAGGTGCTGACG
Reverse : TGGTGAACGGGTCTGCAGGAG
229
Tableau 22 : Séquence des amorces utilisées pour les expériences de PCR
quantitative.
Validation du gène de ménage
La mesure de l’expression de gènes par qPCR nécessite tout d’abord la validation de gènes de ménage, c'est-à-dire de gènes dont l’expression ne change pas au cours du temps malgré l’application d’un stress. Cela permet de disposer d’une référence invariable pour comparer les échantillons. À l’aide d’amorces dédiées décrites ci-dessus, l’expression de S18 (protéine ribosomale), cyclophiline A, cyclophiline B et GAPDH (glyceraldéhyde-3- phosphate deshydrogénase) est vérifiée sur les échantillons afin de choisir celui dont l’expression est la plus stable.
À l’issue de la rétrotranscription la concentration de l’ADNc est de 4ng/µL. Chaque puits reçoit 5µl de ce stock d’ADNc puis des volumes de réactifs équivalents à ceux décrits lors de l’étape de vérification des amorces. Les dépôts sont réalisés en triplicat pour chaque condition considérée. L’amplification est réalisée de façon identique à l’étape de validation des amorces.
La validation du gène de ménage le plus approprié parmi les quatre disponibles est effectuée à l’aide de la matrice Excel BestKeeper© version 1.0 (Pfaffl et al., 2004). Afin de déterminer la variabilité d’expression du gène entre chaque condition expérimentale et chaque
lignée testée, la moyenne géométrique des cycles seuils est calculée, ainsi que la déviation standard associée. Le critère de validation est fondé sur un écart type des cycles seuils de toutes les conditions inférieur à 1. Ce fut le cas pour S18, que nous avons donc systématiquement choisi pour référence au cours de nos analyses.
Mesure de l’expression de gènes d’intérêt
Ces analyses incluent sur chaque plaque le gène de ménage retenu et deux gènes d’intérêt au maximum. Le protocole d’amplification et d’acquisition des données est identique à celui dédié à la validation du gène de ménage.
Après vérification de la validité du gène de ménage à l’aide de la macro BestKeeper© Les résultats de la PCR quantitative sont analysés à l’aide de la macro Excel REST-MCS© (Pfaffl, 2001), capable de traiter un gène de ménage, plusieurs gènes d’intérêt et plusieurs conditions expérimentales. Elle réalise le calcul du facteur de sur- ou sous-expression par rapport à la condition contrôle selon la méthode du ΔΔCt, et procure également une mesure statistique (test de comparaison par paires après réallocation aléatoire) de la significativité de cette expression (p-value < 0,05). Selon la référence choisie il est alors possible de mesurer l’expression du gène au cours du temps au sein d’une même lignée (conditions de référence = cycles seuil pour les cellules non traitées), ou de comparer des lignées entre elles également au cours du temps (conditions de référence = cycles seuil pour les cellules contrôles non traitées). Les valeurs d’expression sont confirmées par l’utilisation d’un réplicat biologique.
II. Résultats
A) Vérification de l’expression de DDB2 et sensibilité des lignées aux trois dérivés du