1. Coloration au nitrate d’argent
Après migration SDS PAGE comme décrit précédemment, les protéines isolées après
ligand fishing ou simple exposition de billes magnétiques aux extraits nucléaires (dans les
conditions identiques au ligand fishing, sans ADN fixé) ont également subi une coloration totale au nitrate d’argent afin d’évaluer la complexité des échantillons. Le kit PlusOne Silver Staining Kit, Protein (GE Healthcare) a été utilisé en suivant l’ensemble des préconisations du protocole du fabricant.
2. Immunodétection (Western blotting)
Les gels de polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide 29:1, Euromedex) possèdent une partie de concentration (4,25% acrylamide/bisacrylamide 125mM Tris-HCl pH6,8 0,2% SDS), et une partie de migration (10% acrylamide/bisacrylamide 375mM Tris-HCl pH8,8 0,1% SDS) (méthode SDS polyacrylamid gelelectrophoresis, SDS-PAGE). La polymérisation s’effectue en ajoutant 0,1% de persulfate d’ammonium (Sigma) et 0,1% TEMED (Euromedex). Les gels sont coulés à l’aide du système Mini PROTEAN (Bio Rad).
Les échantillons protéiques (20µl) sont déposés sur le gel. Dans le but de normaliser ces dépôts (afin d’effectuer des comparaisons quantitatives lors de l’immunodétection), des essais de dosage de protéines ont été effectués selon deux méthodes : absorbance UV à 280nm sur NanoDrop 1000 (après élution dans un tampon dénaturant) et µBC (après élution avec le tampon dénaturant ou l’aide d’une nucléase, voir protocole plus bas ; le protocole de µBC sera décrit dans la section Matériels et Méthodes de la cinquième partie de ce travail). L’une et l’autre de ces méthodes ont produit des résultats variables et donc peu fiables, car se trouvant aux limites inférieures de détection respectives. Il a été possible d’estimer à quelques dizaines de µg la quantité totale de protéines récupérées par l’élution totale dans chaque échantillon,
mais du fait de l’imprécision des mesures nous avons décidé de ne pas normaliser les dépôts de protéines sur gel. Par la suite, nous avons découvert la récurrence de la présence de β-actine dans les listes de résultats de protéomique, tous échantillons confondus, et décidé de l’utiliser comme contrôle de charge afin de contrôler la quantité relative des protéines d’intérêt au sein de chaque échantillon.
La migration des échantillons est réalisée à 150V dans un tampon 25mM Tris 192mM glycine 0,1% SDS. Un marqueur de taille à large échelle (20-120kDa, Euromedex) est utilisé pour déterminer la taille des bandes observées après détection. Le transfert est ensuite effectué sur une membrane de nitrocellulose Hybond-C extra (Amersham) dans un tampon 25mM Tris 192mM glycine 30% méthanol, sur glace et à 100V durant 45min. La membrane est ensuite bloquée dans une solution TBS 0,5% Tween-20 5% lait lyophilisé durant 01h00, et l’incubation avec l’anticorps primaire dilué dans cette même solution est réalisée sur la nuit à 4°C sous légère agitation. La membrane est ensuite rincée 3 fois 15min dans une solution TBS 0,5% Tween-20, puis l’incubation avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort est réalisée dans cette même solution durant 01h00. Après trois rinçages dans la solution de TBS 0,5% Tween-20, la membrane est partiellement séchée avant l’application de 1ml du réactif de révélation ECL Plus (GE Healthcare) durant 2min, puis un nouveau séchage de la membrane. Cette dernière est enfin emballée dans un film plastique et l’exposition se fait sur film photographique Hyperfilm ECL (Amersham), ensuite incubé dans un bain de révélateur puis de fixateur (Sigma). Les références et dilutions des anticorps utilisées sont présentées dans le Tableau 6.
Anticorps Dilution Source (animal) Fournisseur (référence)
Anti-DDB2 1/3 000ème Lapin Philippe Becuwe (Université de Nancy)
Anti-HMGB1 1/2 500ème Lapin Abcam (18256)
Anti-UBF 1/1 000ème Souris Santa Cruz (13125)
Anti-XPC 1/1 000ème Souris Santa Cruz (74410)
Anti-TOX4 1/1 000ème Lapin Abcam (66651)
Anti-TERF2 1/5 000ème Souris Abcam (13579)
Anti-PPP1R10 1/5 000ème Lapin Abcam (70248)
Anti-PARP-1 1/1 000ème Lapin Cell Signaling (9542)
Anti-βactine 1/10 000ème Souris Sigma (A2228)
Anti Ig de lapin 1/20 000ème Singe GE Healthcare (NA934)
Anti Ig de souris 1/20 000ème Mouton GE Healthcare (NA931)
3. Protéomique Principe général
L’identification des protéines présentes au sein d’échantillons complexes requiert aujourd’hui l’utilisation de méthodes qui vont au-delà du simple séquençage (méthode d’Edman), utilisé durant plusieurs décennies. En effet, deux paramètres sont cruciaux afin d’atteindre une nouvelle dimension d’analyse : la possibilité de réaliser de multiples identifications sur un même échantillon (haut débit), et celle de détecter des protéines présentes en très faible quantité par rapport à la population totale (large gamme dynamique). C’est dans ce but qu’ont été développés les protocoles de protéomique faisant appel à la spectrométrie de masse.
Les analyses protéomiques ont été réalisées sur la plate-forme EDyP-service du laboratoire d’Étude de la Dynamique des Protéomes (LEDyP, iRTSV, CEA Grenoble). Les échantillons sont d’abord débarrassés de toute présence résiduelle de billes magnétiques par SDS-PAGE. Ensuite, une digestion trypsique de toutes les protéines présentes est réalisée. Les peptides résultants ont été ensuite séparés par nano-CLHP (décomplexification de l’échantillon) et analysés en sortie à l’aide d’un spectromètre de masse à trappe d’ions (mesure des masses moléculaires de chaque peptide). Le couplage de la nanochromatographie (haute sensibilité et résolution chromatographique, diminution de la quantité d’échantillon nécessaire) au spectromètre de masse à trappe d’ion (haute précision de masse sur une large gamme dynamique, hautes résolution et sensibilité) permet d’obtenir une qualité d’analyse optimale.
Les données obtenues sont ensuite comparées à une base de données contenant les fragments trypsiques de milliers de protéines déjà identifiées, ce qui permet d’obtenir par cartographie peptidique (peptide mass fingerprinting) la liste de celles présentes dans nos échantillons. L’utilisation des contrôles appropriés (ADN non lésé fixé et billes sans ADN) permet de déterminer l’ensemble du bruit de fond que l’on va alors soustraire aux échantillons issus de l’exposition d’ADN lésé aux extraits nucléaires. La validation de l’ensemble des résultats a été facilitée par les outils bioinformatiques adaptés développés au sein du LEDyP. L’ensemble de ces étapes est résumé sur la Figure 34.
Figure 34 : Les grandes étapes de l’analyse protéomique des échantillons obtenus
après piègeage des protéines par les sondes plasmidiques lésées.
Protocole détaillé
Protocole d’analyse des échantillons protéiques – Les échantillons sont concentrés par SDS-PAGE en bande de 2mm (stacking migration) sur des gels précoulés NuPAGE (Invitrogen) par migration (temps < 2min) à 200V dans un tampon 50mM MES 50mM Tris 0,1% SDS 1mM EDTA. Les protéines sont ensuite fixées par un bain de 30min dans un tampon acide (7,5% acide acétique 30% EtOH) et colorées par un bain de 30min dans une solution de bleu de Coomassie (Bio-Rad). La décoloration se fait par plusieurs bains successifs dans le tampon acide. Les bandes de protéines sont ensuite manuellement excisées. La digestion des protéines et l’extraction des peptides résultants sont opérées par le robot EVO150 (Tecan) selon un protocole déjà décrit (Jaquinod et al., 2007).
Les peptides extraits ont été analysés par nano-CLHP sur un système Ultimate 3000 (Dionex) couplé à un spectromètre de masse en tandem LTQ-Orbitrap Discovery (Thermo Fischer).
Identification des protéines – Après acquisition des spectres, l’identification des peptides a été réalisée à l’aide du programme Mascot (Matrix Science). Celui-ci assigne un score probabilistique inversement corrélé à la probabilité que l’identification d’un peptide résulte d’un événement aléatoire, et la base de données Uniprot (compilation des données des bases Swiss-Prot, TrEMBL et PIR) sélectionnée pour l’espèce Homo sapiens comme décrit précédemment (Bernay et al., 2009). Les modifications autorisées sur les peptides sont : acétylation du N-terminus ou présence d’un pyroglutamate, amidation du C-terminus,
oxydation et dioxydation des méthionines. La précision de masse est fixée à 2ppm et 0,8Da. Les protéines identifiées avec deux peptides et un score ≥ 70 ont été validées à l’aide du logiciel IRMa, notamment en identifiant les protéines partageant des ensembles communs de peptides (Dupierris et al., 2009). Afin de renforcer la fiabilité des résultats, seules les protéines identifiées lors de deux expériences indépendantes ont été conservées pour l’établissement de l’interactome, mais les résultats d’analyses supplémentaires seront aussi présentés.
L’attribution de fonctions biologiques aux groupes de protéines a été effectuée à l’aide de la base Generic Gene Ontology Term Mapper (fichier goa_human Generic GO slim, humain, version 14 juillet 2010) accessible sur le site de l’Université de Princeton (url : http://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper/).