Nanoparticules fonctionnalisées avec CI-994

5.2.1 Préparation des nanoparticules

85 85 i 49 R = OH _{50 R = N} 3 85 85 1 110 1 50 ii 40 40 + 49 + 51 51 iii 3 3 52 3 21a 85 110 53 2

Figure 65 : Schéma de la préparation des nanoparticules fonctionnalisées avec le CI-994. (i) a) MsCl, THF, Et3N, 20°C/24h, b) NaN3, DMF, 20°C/40h (ii) CuBr, PMDETA,

DCM/EtOH 35/65 (iii) Grubbs I, Et3N, DCM/EtOH 50/50, 20°C/24h.

La synthèse des nanoparticules fonctionnalisées par le CI-994 s’effectue suivant la même stratégie de synthèse des nanoparticules fonctionnalisées avec le SAHA (Figure 65). A partir du norbornène 40 (100 éq.), du macromonomère 49 (1 éq.) et du macromonomère 51 (1 éq.) obtenu par la cycloaddition de Huisguen entre la prodrogue 21a et le monomère 50, les co-polymères 52 sont formés par ROMP en présence du catalyseur de Grubbs de première génération. Les nanoparticules obtenues sont de forme sphérique de type cœur-écorce, elles présentent un diamètre de 320 nm (dans l’eau) et sont composées de 49,6 µmol de prodrogue par gramme de polymère.

108 Afin de pouvoir les analyser biologiquement, les nanoparticules 52 sont mises en solution aqueuse à une concentration de 1,72 mg/mL qui correspond à une concentration de 85x10-3 µmol/ml de prodrogue.

5.2.2 Inhibition des HDAC par les nanoparticules 52

Dans un premier temps, les cellules ont été traitées pendant 16h avec différentes concentrations de CI-994 et de nanoparticules 52 dans le but d’activer l’induction du signal BRET (Figure 66). Le CI-994 a permis d’induire un signal très fort à des concentrations en dessous de 25µM, ce signal diminue par la suite à des concentrations plus importantes probablement à cause de l’apparition de l’effet toxique du CI-994 (Figure 66A). Quant aux nanoparticules 52, elles ont permis d’induire un signal BRET moins important que le CI-994 mais maintenu même à de très grandes concentrations équivalentes en CI-994.

Figure 66 : Caractérisation pharmacologique des nanoparticules 52 par le test BRET. Ce test a été réalisé sur des cellules de type MeT-5A. (A) les cellules sont traitées pendant 16h avec des doses croissantes de CI-994 et de nanoparticules 52. (B) Les cellules sont traitées avec 10 µM de CI-994 ou 1,72 mg/mL de nanoparticules 52 pendant 8h, 24h, 36h et 48h. (C) Signal maximal BRET induit par chaque composé pendant les expériences de cinétique.

L’évaluation cinétique du signal BRET a été ensuite réalisée sur des cellules d’adénocarcinome et de mésothéliome pleural malin (Figure 66B). Ces cellules ont été traitées avec 10 µM de CI-994 et avec 1,72 mg/mL de nanoparticules 52 (85x10-3 µM de CI-994) pendant 48h. Après 24h de traitement, l’inhibition des HDAC a été stabilisée pour le CI-994 et diminuée après 36h. Alors que l’inhibition des HDAC par les nanoparticules 52 augmente tout au long de l’expérience. La figure 66C montre que les signaux maxima BRET induits par le CI-994 et par les nanoparticules 52 sont similaires mais pas au même moment.

109 La cinétique de libération obtenue par les nanoparticules 52 est similaire à celle obtenue par la prodrogue 21a (Figure 54B), ce qui démontre que les propriétés de libération du système acido-labile de la prodrogue 21a ne sont pas altérées par la présence des co- polymères PNB-PEO. De plus, l’effet des nanoparticules 52 est maintenu dans le temps, ce qui suggère que l’internalisation cellulaire suivie par la libération du iHDAC sont les deux évènements responsables de l’induction d’un signal BRET différé.

5.2.3 Toxicité cellulaire des nanoparticules 52

La toxicité cellulaire des nanoparticules 52 a été évaluée sur des lignées cellulaires d’adénocarcinome (ADCA) et de mésothéliome (MPM) qui représentent deux types de cancers thoraciques très agressifs. Dans les Figures 67A et B, la toxicité des nanoparticules 52 a été comparée au CI-994 et aux co-polymères non fonctionnalisées 53 (Figure 65) utilisées comme référence. Aucune toxicité n’a été observée pour les nanoparticules 53 sur les deux lignées cellulaires. La diminution de la viabilité cellulaire ADCA a été obtenue par l’augmentation des doses de nanoparticules 52 (Figure 67A), un résultat similaire est obtenu par l’effet du CI-994, ce qui montre que l’activité de ce iHDAC n’a pas été modifiée par sa ligation aux co-polymères PNB-PEO. Sur les cellules MPM, la toxicité des nanoparticules 52 est moins importante que le CI-994 (Figure 67B).

La diminution de la viabilité cellulaire induite par les nanoparticules 52 est principalement due à la libération du CI-994 puisque les nanoparticules 52 sont utilisées avec une concentration polymérique de 1,72 mg/mL, moins importante que la concentration des nanoparticules non toxiques 53 (2 mg/mL).

L’apoptose induite par les nanoparticules 52 a été ensuite évaluée in vitro (Figures 67C et D). Le traitement des lignées cellulaires ADCA et MPM avec 1,72 mg/mL de nanoparticules 52 pendant 48h a permis de générer une apoptose observée par un marquage Annexin-V. Les cellules cancéreuses ADCA (Figure 67C) ont été plus sensibles au traitement que les cellules MPM (Figure 67D). Cette différence de sensibilité peut être expliquée par la faible endocytose des nanoparticules par les cellules mésothéliales.238 Ceci a été confirmé par

110 des travaux réalisés antérieurement et qui démontraient que les cellules MPM présentaient de faibles capacités d’internalisation comparées aux cellules ADCA.239

Figure 67 : Caractérisation biologique des nanoparticules 52, 53 et du CI-994. (A) Test de viabilité des cellules ADCA. (B) Test de viabilité des cellules MPM. Les deux types de lignées cellulaires sont traités avec 2 mg/mL de nanoparticules 53 et avec des concentrations croissantes de CI-994 et de nanoparticules 52 pendant 72h. (C) Apoptose des cellules ADCA. (D) Apoptose des cellules MPM. Les lignées cellulaires sont traitées avec 1,72 mg/mL de nanoparticules 52 pendant 48h. L’apoptose est évaluée en utilisant le marquage Annexin-V et par cytométrie en flux.

Ainsi, l’ensemble de ces résultats montrent que le CI-994 a bien été libéré au niveau cellulaire, ce qui a permis l’acétylation des histones H3 et donc l’induction du signal BRET. Cette libération est en corrélation avec la viabilité cellulaire des nanoparticules 52 ainsi que l’apoptose induite par ces dernières.

Les tests in vivo réalisés avec les nanoparticules 52 porteuses de CI-994 sur des souris porteuses de tumeurs sous-cutanée AK7 n’ont pas donné de résultats satisfaisants et ne seont pas détaillés dans ce manuscrit. En résumé, le traitement n’a pas induit de diminution de la croissance des tumeurs et l’acétylation des histones H3 au niveau des cellules tumorales n’a pas été très significative. Ces résultats indiquent que les nanoparticules portant le CI-994 se

111 compote de manière très différentes des nanoparticules portant le SAHA. La différence majeure étant la vitesse d’hydrolyse du système acido-labile, il est possible que la libération trop rapide du CI-994 ne permette pas une activité biologique soutenue contrairement à ce qui est observé pour le SAHA, libéré moins rapidement.