Effet in vivo des nanoparticules 57

Les résultats obetenues avec le SAHA et le CI-994 étant modérés, le modèle in vivo utilisé a été modifié en comparaison de travaux antérieurs développés dans l’équipe de Marc Grégoire.240 Ces travaux ont démontré que sur modèle orthotopique de tumeur la combinaison d’un iHDAC avec la décitabine, un agent hypo-méthylant, permettait de diminuer significativement la masse tumorale en comparaison des traitements utilisant les composés seuls. Ces tavaux ont également montré que la séquence d’administration des composés est importante pour obtenir une synergie et que la décitabine seule dans ce modèle n’a pas d’effet. Ainsi la décitabine doit être administrée avant l’inhibiteur HDAC. En se basant sur ces travaux un plan de travail a été difini avec injections multiples de décitabine suivi des nanoparticules 57. La concentration utile en décitabine a été fixée en référence aux travaux précédents alors que pour les nanopartiocules 57 différents concentrations ont été étudiées. Le tout a conduit à définir plusieurs groupes de souris qui ont toutes préalablement reçus au jour J0 une injection de cellules cancéreuses. Après 7 jours de croissance, à l’exception du groupe témin, les groupes de souris ont reçus 2 injections de décitabine 4 µg de décitabine par gramme de souris aux jours J7 et J9. Aux jours J12, J14, J16 et J19 les groupes ont reçu respectivement une injection de NODH (0,25 µg/g et 1,25 µg/g), de nanoparticules non fonctionnelles 58 (80 µg/g), et des nanoparticules 57 (0,25 µg/g équivalent NODH, 16 µg/g de polymères). Après 20 jours de traitement, aucune souris n’est morte et elles ont été euthanasiées et leurs organes isolés. S’agissant d’un modèle ortohotopique de mésothéliome péritonéale les différents sites de développement des tumeurs ont été extraits et pesés. La

115 Figure 71A montre que les masses obtenues pour les souris non traitées ou traitées avec les nanoparticules non fonctionnelles 58 ou NODH à 0,25 µg/g sont similaires.

Figure 71 : Activité anti-tumorale des nanoparticules 57 in vivo. Les souris porteuses d’une tumeur intrapéritonéale AK7 sont traitées par injections intraveineuses avec les nanoparticules 58 (80 µg/g), le NODH 1x (0,25 µg/g), le NODH 5x (1,25 µg/g) et les nanoparticules 57 (0,25 µg/g de NODH, 16 µg/g de polymères) en association avec la décitabine (4 µg/g). (A) Les graphiques représentent le poids des tumeurs mesurés à la fin des expériences. (B) à (D) Images histologiques représentatives du pancréas du groupe de contrôle (B), du groupe traité avec NODH 1x (C), du groupe traité avec les nanoparticules 57. Les flèches noires indiquent l’invasion pancréatique par les cellules cancéreuses.

Ceci indique une absence d’effet, attendue pour les nanoparticules non fonctionnelles mais décevant pour NODH à 0,25 µg/g. Cependant lorsque NODH est utilisé seul à une concentration 5 fois plus élevée (1,25 µg/g) une réduction significative de 80% de la masse tumorale est obtenue. Dans le cas des nanoparticules 57, une réduction de 80% de la masse est

116 également obtenue mais avec une concentration en NODH équivalente à 0,25 µg/g. En complément de ces résultats l’analyse histologique des tumeurs chez les souris non traitées ou traitées avec 0,25 µg/g de NODH seul montre l’apparition de plusieurs régions d’invasions tumorales au niveau du pancréas (Figure 71B et 71C, flèches noires : invasion des cellules cancéreuses). Ces zones d’invasion sont absentes chez les souris traitées avec les nanoparticules 57 (Figure 71D). Ainsi, la vectorisation du NODH avec les co-polymères PNB-PEO utilisant un système de délivrance acido-sensible ralenti d’un facteur 5 la croissance tumorale in vivo. Aucune toxicité n’a été induite chez les souris dans toutes les conditions testées. Les mesures du poid des organes isolés (foie, reins et rate, Figure 72A) et des formulations sanguines chez les souris après euthanasie indique que les nanoparticules ne sont pas toxiques.

Figure 72 : Toxicité des nanoparticules 57 in vivo. Les souris porteuses d’une tumeur intrapéritonéale AK7 sont traitées par injections intraveineuses le NODH 1x (0,25 µg/g), le NODH 5x (1,25 µg/g) et les nanoparticules 57 (0,25 µg/g de NODH, 16 µg/g de polymères) en association avec la décitabine (4 µg/g). Le jour de l’euthanasie des souris, le foie, la rate et les reins ont été pesés (A), et des échantillons sanguins ont été collectés pour déterminer le niveau des leucocytes, des thrombocytes et des érythrocytes (B).

117 Alors que l’évaluation in vitro des nanoparticules 57 montre que la vectorisation du NODH diminue son activité dans notre test cellulaire BRET, l’étude in vivo a clairement montrée un effet antitumoral important. Ceci suggère que la délivrance d’une quantité importante de NODH au niveau du site tumorale par les nanoparticules 57 grâce à l’effet EPR conjugué à la libération intracellulaire par stimuli acide est un résultat très prometteur pour le cancer du mésothéliome.

6 Conclusion

En conclusion, ce travail nous a permis de vectoriser trois différents inhibiteurs de HDAC : le SAHA, le CI-994 et le NODH. Notre approche nous a permis dans un premier temps de préparer plusieurs prodrogues acido-labiles capables de libérer l’agent anti- cancéreux en milieu acide grâce à un système de type diaryltriazole. Ces prodrogues ont pu induire l’acétylation de l’histone H3, évaluée par le test BRET sur des cellules cancéreuses, ce qui démontre l’efficacité du système acido-labile synthétisé. Les prodrogues présentant une libération du iHDAC prolongée dans le temps en milieu acide ainsi qu’une certaine stabilité à pH physiologique ont été choisies pour la fonctionnalisation de nanoparticules polymériques.

Notre choix s’est porté sur l’utilisation de co-polymères de type PNB-PEO ayant une forme sphérique cœur-écorce. La particularité de ces nanoparticules réside dans leur capacité à s’accumuler au niveau des tumeurs grâce à l’effet EPR et à ne générer aucune toxicité in

vivo. La fonctionnalisation de ces co-polymères par les prodrogues passe tout d’abord par la

préparation d’un macromonomère pré-fonctionnalisé par chimie click. Les nanoparticules sont ensuite obtenues par une polymérisation par métathèse avec ouverture du cycle en présence du catalyseur de Grubbs de première génération.

Les nanoparticules fonctionnalisées avec le SAHA ont permis l’induction de l’acétylation de l’histone H3, ce qui montre qu’il y a bien eu libération du SAHA dans le milieu cellulaire. Ceci pourrait permettre l’activation des gènes suppresseurs de tumeurs sensibilisant ainsi les cellules tumorales à l’action d’un autre agent anti-cancéreux plus puissant. La préparation de nanoparticules portant le SAHA et la rhodamine comme molécule

118 fluorescente a permis de démontrer que la biodistribution des co-polymères PNB-PEO n’est pas modifiée par l’ajout de prodrogues de iHDAC. La fonctionnalisation des nanoparticules par le CI-994 n’a pas donné de résultats encourageants in vivo même si les études in vitro ont montré l’induction de l’acétylation de l’histone H3. Quant aux nanoparticules fonctionnalisées par le NODH, les études in vivo ont démontré une diminution significative de la masse tumorale chez des souris porteuses de tumeurs de mésothéliome intrapéritonéales. En améliorant la délivrance du NODH, la quantité injectée du iHDAC a été réduite par cinq afin d’obtenir le même effet anti-cancéreux induit par le NODH seul. Ce traitement a été réalisé en combinaison avec la décitabine, un agent hypométhylant qui n’a aucune activité anti-tumorale utilisé tout seul dans notre modèle de tumeur.

Cette stratégie a donc permis la délivrance de la substance active dans le milieu tumoral par ciblage passif et cela en utilisant des nanoparticules polymériques acido-labiles fonctionnalisées par des iHDAC.

119

Chapitre II :

Synthèse de prodrogues de iHDAC

fluorescentes acido-sensibles

121

1 Généralités

La connaissance du devenir des molécules biologiquement actives in vitro ou in vivo est réalisée de manière statique ou dynamique et cela par le dosage de ces molécules dans le sang ou dans les organes cibles, ou bien, via l’utilisation de traceurs fixés sur les molécules d’intérêt. L’application de cette dernière méthode en imagerie médicale repose sur l’utilisation de trois techniques principales: la fluorescence, la radioactivité et la détection par contraste.

L’imagerie par fluorescence reste le moyen le plus utilisé essentiellement en biologie. De nombreuses avancées ont été réalisées dans ce domaine grâce au développement de marqueurs biologiques fluorescents. La facilité d’utilisation des sondes fluorescentes in vitro a permis d’appliquer cette technique pour les suivis cellulaires. Il existe plusieurs dérivés fluorescents dont certains ont été adaptés à différents éléments cellulaires. Citons l’exemple du LysoTracker® (Life Technologies) conçu pour le marquage et le suivi des organelles acides dans les cellules vivantes et le MitoTracker® (Life Technologies) développé pour le marquage des mitochondries. Cependant, ces sondes fluorescentes ne sont pas adaptées à la visualisation des tissus profonds in vivo. Afin de pallier cette limitation, les traceurs radioactifs ou les agents de contraste sont utilisés, car ils peuvent offrir la possibilité d’un suivi en trois dimensions. Des marqueurs fluorescents qui émettent dans le proche infrarouge sont également développés pour une meilleure détection en imagerie médicale.241

L’application de ces différentes approches est réalisée par la modification directe de la molécule active qui peut être fluorescente ou être rendue fluorescente, ou bien, par l’insertion d’un atome radioactif (18

F, 131I, etc…). L’incorporation d’agents de contraste sur des composées bioactifs est très peu étudiée.

Dans le cas des nanoparticules porteuses de substances actives, l’insertion de molécules fluorescentes peut être également réalisée, comme ce qui a été démontrée par nos travaux avec la rhodamine et le SAHA cités précédemment (figure 62, chapitre I). Dans ce contexte, le suivi cellulaire de nanoparticules fluorescentes peut être corrélé avec d’autres

122 techniques comme le marquage par des anticorps reconnaissant un élément spécifique de la cellule. Les nanoparticules peuvent avoir également des caractéristiques fluorescentes intrinsèques comme le cas des Quantum Dots (introduction, paragraphe 3.3.1). Dans tous ces cas de figure, le suivi cellulaire effectué par ces techniques donne le trajet emprunté par les nanoparticules mais aucune indication sur les conditions et le moment exacte de la libération de l’agent actif.

L’objectif de cette partie de ce travail a consisté à développer un système pH sensible portant une prodrogue fluorescente et dont la fluorescence pourrait être modulée par le pH. La variation du pH intracellulaire au niveau des endosomes/lysosomes doit permettre de libérer la substance active mais pourrait aussi conduire à un changement des propriétés de fluorescence de la sonde insérée. Une fois relié à une nanoparticule, ce système pourrait permettre un suivi de cette nanoparticule in vitro (ou vivo) avec comme informations complémentaires les conditions précises de libération de la substance active.

Nos travaux avec les iHDAC décrits précédemment (chapitre I) ont montré que la libération de ces molécules depuis des nanoparticules polymériques est possible, mais dans le cas du CI-994 par exemple, la cinétique de libération indique que celle-ci pourrait être extracellulaire. Situer le moment où l’endroit exact de la libération du principe actif lors de l’internalisation par les voies acides de l’endocytose permettrait d’apporter une information importantre dans ce type de stratégies anticancéreuses. Des iHDAC fluorescents242, 243 ou radio-marqués244, 245ont été décrits comme outils de suivi ou pour le développement de nouveaux tests.

Cependant s’il est envisageable d’utiliser ce type de marquage pour distinguer une molécule active de la particule porteuse, cette technique ne permettrait sans doute pas d’identifier clairement l’étape clef de la libération. D’autre part l’utilisation de molécules radiomarquées nécessite des équipements spéciaux. Cette approche n’a pas été étudiée dans ce travail qui a porté sur le développement de systèmes fluorescents. L’objectif de cette partie du travail était d’envisager d’associer sur une même structure chimique une libération de principe actif par stimuli acide et obtenir en même temps une modulation de fluorescence en milieu acide.

123

2 La fluorescence

La fluorescence est une émission lumineuse qui se produit suite à l’absorption de photons par une molécule de type fluorochrome ou fluorophore. Cette dernière se trouve alors électroniquement excitée une fois l’énergie du photon absorbée. Le retour à l’état fondamental est caractérisé par l’émission d’un photon de manière très rapide entre deux états de même multiplicité (souvent un état singulet) : c’est le principe de la fluorescence.

Les molécules fluorescentes ont la particularité de posséder dans leurs structures des groupements chromophores ayant des électrons Π délocalisés. Ces composés sont généralement constitués de cycles aromatiques comme l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la rhodamine B (Figure 73) utilisées dans plusieurs applications en biotechnologie telles que la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux. Grâce à leurs dérivés portant une fonction acide carboxylique ou isothiocyanate, ces molécules fluorescentes peuvent être facilement conjuguées à des protéines ou à des anticorps. Ce principe a été appliqué pour le développement de plusieurs tests utilisés en biologie comme le LysoTracker® et le MitoTracker® cités précédemment. Dans certaines conditions une fluorescence à 2 photons est possible.

Figure 73 : Structures chimiques du FITC et de la rhodamine B

Le pH joue un rôle très important dans l’étude des mécanismes d’internalisation cellulaire comme la phagocytose246 et l’endocytose247. Le développement de molécules fluorescentes acido-sensibles a permis de mesurer qualitativement le pH intracellulaire grâce à la modulation de la fluorescence émise par les composés internalisés. Il existe une très large

124 gamme de sondes fluorescentes répondant au pH qui a été répertoriée par Han et al. en 2010.248

Parmi ces molécules fluorescentes pH sensibles on retrouve les dérivés de fluorescéine comme la BCECF (2ʹ,7ʹ-Bis-(2-carboxyéthyl)-5-(et-6-)carboxyfluorescéine), les sondes à base de benzoxanthène comme les SNAFRs (seminaphthofluorones), les molécules à base de cyanines comme la CypHer 5 ou encore les dérivés de coumarines comme la 7- hydroxycoumarine249 (Figure 74).

Figure 74 : Structures de quelques sondes fluorescentes pH sensibles

Si la littérature propose plusieurs modèles de sondes fluorescentes répondant au pH, il n’existe pas à notre connaissance de systèmes permettant à la fois la libération de molécules actives et la modulation de la fluorescence sous l’influence du pH. Nous avons ainsi entrepris de développer de nouveaux modèles de prodrogues de iHDAC 59 (Figure 75) dont la structure chimique permette à la fois une libération de substance active et une modulation de fluorescence, ces deux effets étant produit par variation de pH et à des pH légèrement acides. Afin que ces deux effets puissent être corrélés, la position du groupe fluorescent introduit a été choisie pour permettre la délocalisation du carbocation décrit précédement responsable de l’acido-labilité. Le choix de la sonde fluorescente s’est porté sur un motif coumarine connu pour avoir une longueur d’onde d’excitation autour de 420 nm et une émission vers 320 nm.

125 Cette fenêtre de fluorescence n’est pas idéale à cause de l’autofluorescence des cellules mais ce type de composéest facile d’accès et doit permettre de valider notre approche.

L’insertion dans les précurseurs de prodrogues 5 d’un motif coumarine semblait possible avec une coumarine 61 portant un azoture R4 et un autre groupement fonctionnel et R5 permettant le rattachement du bras PEO-alcyne. Cette approche permettait de réutiliser au maximum la chimie déjà mise au point pour la synthèse des précurseurs 5.

Figure 75 : Insertion d'une molécule fluorescente pH sensible aux prodrogues de iHDAC Paunescu et son groupe ont décrit la préparation de dérivés de 7-azidocoumarines

126 applications en biologie.250 Lors de cette étude, la synthèse de l’acide 7-azidocoumarin-4- acétique 62 (Figure 75) a été décrite. Cette molécule répondait à nos objectifs avec une fonction acide carboxylique peremettant le rattachement par estérification du bras PEO-alcyne ainsi que d’un azoture pour la préparation du groupe acido-labile. Ainsi le fluorophore 62 peut être inséré dasn les structures 5 précédement décrites. Une réaction de chimie click entres les alcynes 7 et l’azoture 62 et une réaction d’estérification entre la fonction acide du composé 62 et une chaine PEG à quatre unités suivie d’une propargylation permettra d’accéder aux précurseurs 63 utilisables pour préparer les prodrogues 64 des iHDAC : SAHA, CI-994 et NODH. Compte tenu de nos précédents résultats avec les prodrogues acido-labiles, nous ne préparerons que des dérivés 63 pour lesquels R1 = H ou méthyle (Me).

3 Synthèse des précurseurs fluorescents acido-

labiles

Le schéma rétrosynthétique établi pour l’insertion de la coumarine 62 est présenté sur la Figure 76. La préparation des précurseurs propargylés 63 est réalisée à partir des diols 65. Le groupement azoture de la coumarine 62 servira à produire le motif acido-labile par chimie click pour les alcynes 7a-b déjà préparés. La fonction acide carboxylique des coumarines 66a-b servira pour l’insertion du bras espaceur PEO grâce à une réaction d’estérification et le groupement éther propargylique comme précédemment (Figure 41, chapitre I).

127 3 3 62 63a-b a : R 1 = H b : R 1 = Me 65a-b 66a-b 7a-b

Figure 76 : Schéma rétrosynthétique de la synthèse des précurseurs fluorescents 63

L’acide 7-azidocoumarin-4 acétique 62 a été préparé suivant la procédure décrite par

Paunescu et al. (Figure 77).250 La première étape est une protection sélective de la fonction amine du 3-aminophénol 67 en présence du chloroformiate d’éthyle. Une réaction de Pechmann sur le carbamate 68 en présence de l’acide 1,3-acétonedicarboxylique dans une solution concentrée d’acide sulfurique donne le carbamate 69, ensuite hydrolysé par 10 éq. de NaOH en chauffant à reflux. L’amine 70 obtenue est convertie en azoture en présence du nitrite de sodium et d’azoture de sodium dans une solution d’acide chlorhydrique (12M). La coumarine 62 est obtenue avec 12% de rendement global en 4 étapes (rendement similaire à celui décrit en littérature).

Figure 77 : Schéma de synthèse de la 7-azidocoumarine 62. (i) ClCO2Et (0,5 éq.), AcOEt,

reflux/12h ; (ii) H2SO4 70%, 0°C/2h-ta/12h ; (iii) NaOH (10 éq.), H2O, reflux/24h ; (iv)

128

Figure 78 : Schéma des essais de préparation des composés 66a-b par chimie click

L’azidocoumarine 62 a été soumise à une réaction de chimie click avec les alcynes 7a- b afin de préparer les acides carboxyliques 66a-b (Figure 78). Le premier essai réalisé suivant la même procédure de chimie click utilisée pour la préparation des diols 12a-b (Figure 40, chapitre I, CuBr, mélange de DCM/H2O) ne conduit pas à la formation des composés 66a-b attendus. Les conditions opératoires de la cycloaddition de Huisgen ont donc été changées. Un deuxième essai a été réalisé en présence d’iodure de cuivre et de TMEDA (TétraMEthylèneDiAmine) en chauffant à reflux dans le DMF. L’utilisation de cette méthode et la variation des conditions de température n’ont donné aucun résultat satisfaisant.

Figure 79 : Schéma réactionnel d’insertion de la chaine PEG sur l'azidocoumarine 62 par estérification de Steglish. (i) EDC (1,2 éq.), DMAP (0,3 éq.), DCM, ta/12h.

La non formation des composés 66a-b peut être expliquée par la présence de la fonction acide carboxylique libre sur l’azidocoumarine 62 qui peut interférer avec le sel de cuivre utilisé dans la réaction en formant un carboxylate de cuivre ne permettant plus la réaction de cycloaddition. La cycloaddition de Huisgen étant impossible directement sur l’azidocoumarine 62 peut être à cause de la fonction acide carboxylique libre, il a paru nécessaire d’effectuer l’estérification avec le bras espaceur avant la réaction de chimie click. L’introduction de la chaine PEG s’effectue selon la réaction d’estérification de Steglich (Figure 79). Cette réaction permet la formation d’ester à partir d’acide carboxylique et

129 d’alcool et cela en présence d’un agent de couplage comme l’EDC et d’un catalyseur comme la DMAP.251

Figure 80 : Schéma de la cycloaddition de Huisgen entre les alcynes 7a-b et l'azidocoumarine 71. (i) CuBr (0,2 éq.), DCM/H2O, ta/12h.

Afin d’éviter la réaction secondaire de di-estérification du tétraéthylène glycol, seulement 0,25 éq. de l’azidocoumarine 62 ont été utilisés. La réaction est réalisée dans le dichlorométhane à température ambiante pour conduire à la formation du composé 71 avec 51% de rendement. Le composé 62 n’ayant pas réagi est également récupéré après la purification du mélange brut. L’ester 71 a été ensuite mis en réaction avec chacun des alcynes 7a et b en présence de bromure de cuivre pour une réaction de couplage par chimie click (Figure 80).

Les esters 71 ont bien conduit comme attendu à la cycloaddition sur les alcynes 7a-b pour donner les composés 72a-b. Ceci prouve bien que l’absence de réactivité l’acide 62 est due à la présence de la fonction acide carboxylique libre. Les composés 72a et b ont été obtenus avec des rendements de 69% et 70% respectivement. Les systèmes diaryltriazoles 72a et b ainsi préparés, la prochaine étape consiste à introduire le groupement propargylique sur l’alcool primaire des composés 72a-b pour leur future fonctionnalisation avec les nanoparticules par chimie click. Pour ce faire, la même méthode de propargylation des alcools 12a-b (Figure 41, chapitre I) a été suivie (Figure 81).

130

Figure 81 : Schéma de l’essai de propargylation des composés 72a-b

Les composés 72a-b ont été mis en réaction avec du NaH et du bromure de propargyle. Cependant, aucune formation des composés 73a-b n’a été observée. Une dégradation in situ des composés 72a-b a été observée ne permettant pas la réaction