Les systèmes sensibles à la variation enzymatique

La délivrance de médicaments par voie enzymatique a beaucoup attiré l’intérêt des chercheurs durant ces dernières décennies. L’agent actif est couplé à son nanovecteur via une liaison chimique capable de se rompre par l’action d’une enzyme spécifique au site ciblé. Ces enzymes sont présentes au niveau extracellulaire ou au niveau lysosomal.

Plusieurs recherches se sont concentrées sur l’étude du N-(2- hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) comme nanovecteur pour le conjuguer à différents agents anticancéreux via des espaceurs sensibles aux enzymes lysosomals.188,189 Citons l’exemple du GFLG (GlycylPhenylalanylLeucylGlycine), une séquence de peptide capable de s’hydrolyser en présence de cathepsine B, une enzyme lysosomale et de rester stable dans le plasma.190 Plusieurs agents anticancéreux ont été accrochés au copolymère HMPA via cette séquence tétrapeptidique, tels que la doxorubicine,191 le methotrexate (MTX),192 et le platinate.193 Il a été démontré que l’insertion du GFLG assure la stabilité du nanovecteur conjugué et aussi la délivrance de la molécule anticancéreuse après l’endocytose de la nanoparticule.

4.2.2 Les systèmes sensibles au potentiel Redox

La délivrance de médicaments peut être activée grâce à la différence très importante du potentiel redox dans le milieu cellulaire. En effet, il apparait que le potentiel redox existe entre le milieu réducteur intracellulaire et l’environnement oxydatif extracellulaire.194

Cette différence est générée par la présence du glutathion dont la concentration est plus importante à l’intérieur de la cellule et plus particulièrement dans le cas de cellules tumorales. Les nanovecteurs sensibles au potentiel redox dépendent de la capacité réductive du milieu intracellulaire connue pour rompre les liaisons disulfures. En se basant sur ce concept,

59 plusieurs micelles sont développées ayant un pont disulfure entre les deux blocs polymériques. Une étude a montré que l’encapsulation du paclitaxel à l’intérieur de ce type de micelle permet la libération intracellulaire de l’agent anticancéreux ainsi que l’augmentation de son pouvoir anticancéreux.195 Un médicament comportant un système sensible au potentiel redox a été mis sur le marché, c’est le Mylotarg®. Ce médicament est constitué de l’antibiotique anti-CD33 utilisé pour le traitement de la leucémie myéloïde aigue. Cependant, il a été retiré du marché à cause de son manque d’efficacité thérapeutique.196 Les systèmes sensibles au potentiel oxydatif ont également été explorés et notamment pour la libération d’agent actif sur des tissus inflammatoires connus pour la présence d’espèces oxydatives.197

4.2.3 Les systèmes pH sensibles

Le pH de certains sites pathologiques s’avère être significativement plus bas que dans les tissus normaux.198 Ceci est notamment remarqué dans le cas d’inflammations, d’infections et de cancers. Ainsi, plusieurs nanovecteurs acido-sensibles sont développés et notamment pour la délivrance d’agents anticancéreux. A l’heure actuelle, les nanoparticules acido- sensibles sont étudiées pour cibler plus spécifiquement l’acidité extracellulaire des tumeurs, mais aussi, le pH au niveau des endosomes. Ces approches vont permettre la libération de l’agent actif soit (i) par le changement structural des blocs polymériques formant la nanoparticule sous l’effet du pH, soit (ii) par l’hydrolyse d’une liaison acido-sensible qui relie la substance active à la nanoparticule.199

Il a été démontré que le pH extracellulaire de la plupart des tumeurs solide (pH 6,5- 7,2) est plus acide que celui les tissus normaux (pH 7,4).200 En effet, étant donné la prolifération anormale et rapide des cellules cancéreuses, la vascularisation de la tumeur est insuffisante pour fournir l’oxygène et les nutriments essentiels pour toute la population cellulaire de la tumeur. Cette insuffisance en oxygène va conduire à l’hypoxie qui va causer à son tour la production de métabolites acides comme l’acide lactique.201La délivrance d’agents anticancéreux peut être ainsi activée au niveau extracellulaire de la tumeur grâce à l’acidité du milieu. Ceci requiert l’utilisation de nanoparticules capables de changer de forme ou de se dégrader afin de libérer le médicament s’il est encapsulé à l’intérieur du nanovecteur.

A titre d’exemple, Deng et al. ont récemment développé des nanoparticules pH sensibles à base de chitosan et encapsulant le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) pour

60 le traitement du cancer du sein. Il a été démontré qu’au niveau de l’environnement acide des tissus tumoraux, les nanoparticules étaient capables de se gonfler ouvrant ainsi les pores du nanovecteurs et libérant le TNFα qui va à son tour induire l’apoptose des cellules ciblées.202 Une autre étude a montré que les micelles à base de PEG-poly(β-amino ester) étaient capables de se désassembler à pH variant entre 6,4 et 6,8. Ceci a permis la libération in vivo de la camptothécine, un agent anticancéreux, utilisé dans ce cas pour traiter des souris porteuses de tumeurs mammaires.203

Cependant, cette approche présente deux limitations principales : (i) l’acidité la plus importante se trouve au centre du tissu tumoral et (ii) le pH de l’interstitium tumoral ne descends pas en dessous de 6,5.149 Ces caractéristiques limitent ainsi le développement de nanoparticules sensibles à des pH plus acides. L’acidité au niveau intracellulaire a été exploitée afin de libérer les agents anticancéreux et cela après l’internalisation des nanoparticules pH sensibles par les cellules cancéreuses (Figure 25). La libération peut s’effectuer grâce au pH des endosomes qui varie entre 5,0 et 6,0, ou bien, celui des lysosomes qui peut varier entre 4,0 et 5,0.204

Figure 25 : Schéma représentatif de l'internalisation cellulaire de nanovecteurs acido- sensibles

Afin de créer des systèmes intelligents pour la libération des molécules actives au niveau intracellulaire, la fonctionnalisation des nanovecteurs par l’agent actif se fait via des liaisons chimiques acido-sensibles telles que les acétals, les hydrazones, les vinyléthers, les

61 orthoesters et les diorthoesters. L’hydrolyse de ces liaisons va ainsi permettre la libération de l’agent thérapeutique à l’intérieur de la cellule ciblée (Figure 26).

Figure 26 : Schémas réactionnels d'hydrolyse des principales fonctions acido-labiles utilisées pour la libération des substances actives

Gillies et al. ont développés des nanoparticules polymériques à base de PEG et

fonctionnalisées par le 5-fluorouridine comme agent actif. Ce dernier a été couplé au système polymérique par une liaison acétal qui s’est hydrolysée rapidement à pH 5,0. Ainsi le taux de libération du 5-fluridine était beaucoup plus important à pH 5,0 qu’à pH 7,4.205 Des fonctions polyacétals ont également été étudiées pour la libération d’agents actifs en milieu acide. Un conjugué amino-PEG polyacétal a été synthétisé et fonctionnalisé par la doxorubicine. La

62 dégradation complète du composé est observée à pH 3,2 au bout de 24h. De plus, ce système a montré un temps de demi-vie plasmatique de 19h, ce qui améliore l’accumulation de la doxorubicine au niveau des tumeurs.206

La fonction hydrazone est également connue pour son hydrolyse à pH 5,0 et 6,0 et à sa stabilité à pH 7,4.207 Le groupe de Kataoka a développé des micelles fonctionnalisées par la doxorubicine via une liaison hydrazone. Les études in vivo ont montré que ces micelles étaient stables pendant la circulation sanguine et une accumulation significative a été observée au niveau des tumeurs solides suivie d’une libération cytoplasmique de la doxorubicine.208

Ainsi, l’amélioration de la délivrance d’agents actifs par le développement de systèmes acido-labiles a connu un essor considérable dans la lutte contre le cancer. Il est nécessaire d’ajouter qu’il existe encore plusieurs fonctions pH sensibles utilisées pour la conception de nanovecteurs (les liaisons oxime209 et thiopropionate210), mais aussi, pour le développement d’autres agents thérapeutiques comme les immunoconjugués cytotoxiques. Ces derniers consistent à combiner un anticorps monoclonal à un agent anticancéreux puissant par le biais d’un agent de liaison qui va permettre la libération de l’agent actif une fois l’immunoconjugué ayant atteint la cellule cancéreuse. Des recherches se sont intéressées à l’utilisation du groupement trityle comme agent de liaison acido-labile,211

utilisé également comme groupement protecteur en chimie organique.212 La particularité de cette fonction réside dans l’acido-sensibilité qui peut varier en modifiant la nature des substituants présents sur les cycles aromatiques du groupement trityle. Les cycles aromatiques peuvent aussi servir de sites de fonctionnalisation de l’immunoconjugué par le couplage d’un anticorps monoclonal. Cette approche a donc permis le développement d’un immunoconjugué acido- labile (Figure 27).

63 Il apparait donc évident que la conception de nanoparticules sensibles à des stimuli d’origine physique ou biologique représente une approche très intéressante pour la délivrance des agents anticancéreux. La grande diversité des stimuli permet d’activer la libération du médicament au bon moment et au bon endroit, et la grande variété structurale des particules et des fonctions sensibles à ces signaux permettent la conception d’un large choix de nanovecteurs réceptifs au stimulus correspondant. Cependant, même si les tests in vitro confirment la faisabilité de cette approche, seulement une minorité de nanoparticules stimuli- sensibles ont été testées in vivo, et encore moins sont arrivées en essais cliniques. Ceci est peut être dû à la complexité structurale des nanoparticules développées limitant leur synthèse à l’échelle industrielle, mais aussi à la biocompatibilité insuffisante des matériaux utilisés et au manque de biodégradabilité. Il serait donc primordial de concevoir des nanoparticules stimuli-sensibles plus simples à synthétiser et constituées de composés biocompatibles et biodégradables pour qu’elles puissent atteindre la phase clinique.

64

5 Présentation du sujet de thèse

L’objectif principal de ce projet, intitulé ‘’Nanosondes épigénétiques’’ est la vectorisation d’inhibiteurs de HDAC par des nanoparticules polymériques biocompatibles capables de libérer les agents anticancéreux grâce à un système pH sensible. Cette libération est activée par le milieu acide intracellulaire et plus particulièrement au niveau des endosomes et des lysosomes. L’inhibiteur de HDAC ainsi libéré va pouvoir apporter des modifications épigénétiques et plus particulièrement au niveau des histones et cela en limitant leurs désacétylation excessive responsable du silence des gènes suppresseurs de tumeurs. Notre intérêt s’est également porté sur la conception de nanovecteurs polymériques polyfonctionnels portant à la fois un iHDAC et une sonde fluorescente réactive aux variations du pH intracellulaire (Figure 28). La fluorescence modifiable par le pH doit permettre, d’une part, le suivi in vivo des nanoparticules, et d’autre part, de définir le moment et la localisation exacte de la libération de la molécule anticancéreuse.

Figure 28 : Nanoparticule polymérique transportant des agents anticancéreux (iHDAC) et/ou des molécules fluorescentes

La fonctionnalisation des nanoparticules polymériques requiert l’incorporation de précurseurs composés du iHDAC, du système acido-sensible mais aussi d’un bras espaceur

65 présentant un groupement fonctionnel terminal nécessaire pour le couplage de ces précurseurs sur la nanoparticule.

Ainsi la mise en œuvre de ce projet passe par deux étapes primordiales :

La synthèse de précurseurs acido-sensibles capables de libérer dans le temps l’inhibiteur de HDAC. Ce travail fait l’objet de ce sujet de thèse.

La synthèse des nanoparticules et leurs fonctionnalisations par les précurseurs synthétisés.

La réalisation de ce projet a donc fait l’objet de deux collaborations :

La première collaboration est réalisée avec le Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques (LCPO ; UMR 5629) à Bordeaux pour la synthèse des nanoparticules polymériques, leurs couplages avec les précurseurs développés dans notre laboratoire, ainsi que leurs caractérisations.

La deuxième collaboration est réalisée avec l’Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM ; U892) à Nantes pour l’ensemble des tests biologiques.

Les travaux présentés dans ce manuscrit seront répartis en trois chapitres.

Le chapitre I traitera des travaux réalisés pour la synthèse de différents systèmes acido-sensibles analogues de trityle. La libération de la substance active peut être contrôlée par la variation des substituants sur les cycles aromatiques de la fonction acido-labile analogue de trityle. Ces systèmes seront ensuite conjugués à trois iHDAC : CI-994, SAHA et NODH. Ce dernier est un analogue de la TSA, développé il y a quelques années dans notre laboratoire. La libération de ces agents anticancéreux à partir de différentes versions acido- labiles sera étudiée afin de sélectionner le meilleur candidat pour la fonctionnalisation des nanoparticules polymériques. Le pouvoir anticancéreux de ces nanoparticules fonctionnalisées sera ensuite évalué par des tests in vitro et in vivo.

Dans le chapitre II, nous étudierons les méthodes mises en œuvre pour la synthèse de précurseurs acido-sensibles portant la coumarine comme molécule fluorescente, et cela dans le but de mettre en évidence les mécanismes de la libération cellulaire des iHDAC. La libération du SAHA et du NODH de ces nouveaux précurseurs sera évaluée.

66 En parallèle aux travaux menés pour la conception de prodrogues acido-labiles, une autre thématique de recherche a été également suivie lors de ce projet de thèse, et cela dans le but de développer des analogues de type furanone de la TSA. En effet, l’insertion d’un cycle furanone sur la structure de la TSA a permis de développer le NODH, un analogue ayant une activité anticancéreuse aussi importante que la TSA et apportant mois d’effet toxique. Notre intérêt s’est donc également porté sur la synthèse d’autres analogues de la TSA basés sur le NODH. Ce travail nous a menés à l’élaboration d’une nouvelle méthode de synthèse de benzofuranones par cyclisation intramoléculaire en milieu superacide. L’ensemble de ces travaux sera détaillé dans le chapitre III.

67