Deuxième étude : Synthèse énantiosélective de benzofuranones 2,2-disubstituées

Une deuxième approche consiste à préparer des benzofuranones 2,2-disubstituées chirales à partir d’éthers de phénols tertiaires optiquement actifs. Parmi les méthodes de synthèse stéréospécifique d’éthers de phénols tertiaires décrites en littérature, on trouve les travaux présentés par Shi et al..269 Par une réaction de Mitsunobu en présence du DIAD (DiIsopropylAzoDicarboxylate) et de la triphénylphosphine, l’éthérification du phénol 128 avec le composé optiquement actif 127 a permis la synthèse de de l’éther chiral 129 avec 56% de rendement (Figure 111).

Figure 111 : Synthèse de la benzofuranone chirale 129 par la réaction de Mitsunobu

Cependant, d’après ces travaux, il apparait que l’éthérification des phénols par la réaction de Mitsunobu ne se produit que lorsqu’il y a un groupement OBn (O-benzyle) en para de la fonction alcool ou quand il n’y a aucun groupement sur le cycle aromatique.

Les éthers de phénols tertiaires optiquement actifs peuvent également être obtenus par dédoublement en formant des sels de diastéréoisomères. Cette approche a été décrite par les

163 travaux de Das et al.270 et consiste à préparer l’éther de phénol chiral 133 (Figure 112) en partant de l’acide 130. Le traitement de ce dernier avec la (R)-+-benzylamine 131 permet d’obtenir 4% du sel 132 par recristallisation fractionné du mélange réactionnel. Le diastéréoisomère 132 ainsi obtenu est estérifié en présence de l’acide sulfurique dans le méthanol pour obtenir l’éther de phénol 133 avec 98% de rendement.

Figure 112 : Schéma de synthèse de l'énantiomère chiral 133 par séparation de sels de diastéréoisomères

En se basant sur ces travaux, il a été convenu de préparer l’éther de phénol tertiaire optiquement actif 137 par séparation de sels de diastéréoisomères en partant de l’acide 135 (Figure 113). La synthèse de ce dernier a été réalisée suivant la méthode décrite par Das et al. La condensation du 3-méthoxyphénol 108b a été effectuée dans un large excès d’hydroxyde de sodium et de butanone 134 et cela en présence de chlorure de triéthylbenzylammonium et de bromoforme. Cette réaction nous a permis d’obtenir l’acide 135 avec 35% de rendement. Ce dernier a été par la suite mis en réaction avec la (R)-+-1-phényléthylamine 131 dans un mélange d’éther de pétrole et d’acétate d’éthyle (8/2). La séparation des sels de diastéréoisomères a été réalisée par plusieurs recristallisations fractionnées en présence d’éther de pétrole et d’acétate d’éthyle (1/1). Le diastéréoisomère 136 est obtenu lorsqu’il n’y a plus de variations du pouvoir rotatoire du composé récupéré après la recristallisation ([α]D = -5,7°, c 1, CHCl3).

164

Figure 113 : Schéma de la synthèse de la benzofuranone chirale (R)-(+)-138 à partir de l'éther de phénol tertiaire chiral (R)-(+)-135 obtenu par séparation de sels de diastéréoisomères (i) NaOH (8 éq.), chlorure de triéthylbenzylammonium (TEBA) (0,1 éq.), CHBr3 (4 éq.), toluène, ta/3h30min ; (ii) EP/AE (8/2) reflux/1h puis recristallisation

fractionnée 11 fois (EP/AE : 1/1) ; (iii) H2SO4, MeOH, reflux/3h ; (iv) TfOH (15 éq.),

75°C/15min.

Ainsi, cette opération nous a permis d’obtenir le sel de diastéréoisomère 136 avec 21% de rendement. L’estérification de ce dernier est réalisée en présence de H2SO4 dans le méthanol pour avoir l’éther de phénol chiral R(+)137 avec 94% de rendement. L’éther de phénol racémique 137 a été également préparé par estérification de l’acide 135.

Une fois l’éther R(+)137 obtenu, il a été mis en réaction avec 15 éq. d’acide triflique. La benzofuranone R(+)138 a été obtenue avec 53% de rendement. Ce rendement modéré est peut être dû à la dégradation d’une partie du substrat à cause du milieu très acide utilisé.

La pureté énantiomérique des composés R(+)137 et R(+)138 a été évaluée par HPLC chirale. D’après les chromatogrammes présentés dasn la Figure 114A et 114B, on peut remarquer la présence d’un seul pic, ce qui confirme la pureté énantiomérique de l’éther R(+)137 et de la benzofuranone R(+)138.

Cependant, l’analyse de l’éther de phénol racémique 137 (Figure 114C) suivant la même procédure utilisée pour l’éther chiral R(+)137 a montré la présence d’un seul pic au lieu de deux pics correspondant aux deux formes énantiomériques. Plusieurs autres essais ont été effectués en utilisant différentes méthodes analytiques, les chromatogrammes obtenus ont

165 montré la présence d’un seul signal. Ce résultat inattendu pourrait être expliqué par les échanges effectués entre le substrat analysé et la phase stationnaire chirale. En effet, le centre stéréogène C2 ne doit pas être considéré comme tel et cela à cause de la présence des substituants éthyle et méthyle dont la différence n’est pas suffisante pour obtenir une bonne résolution par la phase stationnaire chirale.

Figure 114 : Chromatogrammes des analyses par HPLC chirale des composés (A) (R)- (+)-137 (B) (R)-(+)-138 et (C) 137

La pureté énantiomérique de l’éther R(+)137 et de la benzofuranone R(+)138 ne peut pas être confirmée. La préparation d’un éther de phénol tertiaire ayant un centre stéréogène portant une longue chaine alkyle de type butyle ou pentyle pourrait permettre la validation de cette approche.

Pour ce faire, l’éther de phénol tertiaire 141 (Figure 115) a été obtenu à partir de l’acide 140. Ce dernier a été préparé suivant la même procédure utilisée pour la synthèse de l’acide 135 (Figure 113). Le 3-méthoxyphénol 108b a été cette fois condensé dans d’un large excès d’heptanone 139 et d’hydroxyde de sodium en présence de bromoforme et de chlorure de triéthylbenzylammonium. L’acide 140 a été obtenu avec 37% de rendement.

166 L’estérification de ce dernier en milieu acide et en présence de méthanol permet l’obtention de l’éther de phénol 141 avec 97% de rendement.

Figure 115 : Schéma de la préparation de l'éther de phénol tertiaire 141 (i) NaOH (8 éq.), chlorure de triéthylbenzylammonium (TEBA) (0,1 éq.), CHBr3 (4 éq.), toluène,

ta/3h30min ; (ii) H2SO4, MeOH, reflux/3h.

L’éther de phénol 141 a été par la suite analysé par HPLC chirale. Le chromatogramme présenté par la Figure 116 montre la présence de deux pics représentatifs des deux formes énantiomériques du composé racémique 141. Ce résultat confirme l’hypothèse émise précédemment : le carbone C2 du composé racémique 137 n’est pas considéré comme un centre stéréogène à cause de la présence des substituants éthyle et méthyle. La phase stationnaire chirale utilisée pour ces analyses ne permet pas l’obtention de la résolution des deux énantiomères du composé 137.

Figure 116 : Chromatogramme de l'analyse par HPLC chirale du composé racémique 141

La résolution des énantiomères de l’éther 141 devra donc être améliorée. Elle peut être effectuée par séparation de sels de diastéréioisomères en présence de la (R)-+-benzylamine 131 et cela en partant de l’acide 140 (Figure 117). Une fois le sel de diastéréoisomère 142 obtenu, il sera mis en réaction avec l’acide sulfurique et le méthanol pour obtenir l’éther chiral R(+)141. La cyclisation intramoléculaire de ce dernier dans l’acide triflique permettra

167 l’obtention de la benzofuranone chirale R(+)143. La pureté énantiomérique des composés R(+)141 et R(+)143 devra par la suite être confirmée par HPLC chirale.

(1 éq.) 142 129 R(+)141 _R(+)143 recristallisation fractionnée (EP/AE: 1/1) MeOH reflux/3h 140 TfOH (15 éq.) 75°C

Figure 117 : Hypothèse de travaux à développer pour la benzofuranone chirale (R)-(+)-143

L’ensemble de ces travaux est en cours de réalisation afin de valider la méthode utilisée pour la synthèse de benzofuranones chirales portant un centre stéréogène tertiaire.

Des essais ont été entrepris dans le but de séparer les énantiomères des composés racémiques 141 et 143 (Figure 118) par purification chromatographique utilisant une colonne chirale OD-I. Les résultats obtenus n’ont pas été concluants et ne seront pas présentés dans ce manuscrit.

168

4 Conclusion

L’ensemble des travaux présentés dans ce chapitre nous a permis dans un premier temps de mettre au point une nouvelle méthode de synthèse de benzofuranones en seulement deux étapes à partir de phénols commerciaux (Figure 119). Cette stratégie de synthèse repose sur une cyclisation intramoléculaire par acylation de type Friedel-Crafts en présence d’un superacide : l’acide triflique. Cependant la cyclisation intramoléculaire est contrôlée par la nature et la position du substituant R présent sur le cycle aromatique. Plusieurs benzofuranones ont été obtenues avec de bons rendements. Parmi elles, le composé 91f portant un substituant aromatique hydroxyle qui pourra être converti en triflate, ouvrant ainsi la voie à des fonctionnalisations ultérieures par des couplages de Sonogashira. D’autres fonctionnalisations peuvent être également envisagées en exploitant la partie ester de la benzofuranone 91j.

Compte tenu de l’intérêt des dérivés de benzofuranones dans la synthèse des analogues de la TSA, ce travail sera poursuivi afin de développer d’autres méthodes de synthèse de benzofuranones portant des groupements aromatiques halogénés, nécessaires pour des réactions de couplages pallado-catalysés.

Figure 119 : Nouvelle méthode de synthèse de benzofuranones par cyclisation intramoléculaire en présence de l’acide triflique

169 Une étude préliminaire a été entreprise dans le but de préparer des benzofuranones chirales par cyclisation intramoléculaire d’éther de phénols optiquement actifs. Ce travail nous a permis de mettre au point une méthode de séparation énantiopure par purification chromatographique d’un mélange racémique de l’éther de phénol 109l sur une colonne chirale OD-I (Chiralcel 5g) (Figure 120). Lors de la cyclisation intramoléculaire des énantiomères obtenus, l’équilibre céto-énolique permet la racémisation des benzofuranones (+)112l et (- )112l à cause du centre stéréogène secondaire.

Figure 120 : Schéma des essais de synthèse de benzofuranones chirales

L’analyse de l’éther de phénol tertiaire racémique 137 n’a pas montré la présence de deux pics correspondant aux deux formes énantiomériques. Ceci suggère que le carbone C2 n’est pas considéré comme centre stéréogène par la phase stationnaire chirale. Cette dernière n’a pas permis la différenciation des groupements méthyle et éthyle lors de l’analyse. Le remplacement du groupement éthyle par une longue chaine pentyle a permis de contourner ce problème. L’énantiomère R(+)141 peut être obtenu par séparation des sels de diastéréoismères. La cyclisation de cet éther de phénol permettrait d’obtenir la benzofuranone R(+)143 et de vérifier la stabilité chirale de cette dernière lors de la cyclisation intramoléculaire. Des travaux sont en cours de réalisation afin de valider la pertinence de cette approche.

170

Conclusions

172

Conclusions

Un premier travail a été entrepris visant à développer des prodrogues pH sensibles « à cliquer » de type diaryltriazole permettant la libération de substances actives à des pH légèrement acides, tels que ceux observés lors de l’endocytose dans les compartiments acides (les endosomes (pH 6) et lysosomes (pH 5)). Ce projet a été appliqué à la libération de deux différents iHDAC connus, le SAHA et le CI-994, ainsi qu’un autre composé analogue de la trichostatine A préparé dans notre laboratoire, le NODH (Figure 121). Plusieurs prodrogues ont été préparées pour chacun de ces composés. Ces prodrogues doivent permettre la libération du iHDAC à pH 5-6 et d’avoir également une certaine stabilité à pH physiologique. L’induction de l’acétylation de l’histone H3 a été évaluée avec un test sur des cellules vivantes montrant que l’activité initiale des inhibiteurs est restaurée en totalité.

Les prodrogues de iHDAC ont été par la suite conjuguées à des nanoparticules polymériques polynorbornène-polyéthylène oxyde (Figure 121) non toxiques et capables de s’accumuler au niveau de la masse tumorale grâce à l’effet EPR. Ces nanoparticules ont été fonctionnalisées avec nos prodrogues par chimie click ‘’azoture-alcyne’’ via la préparation d’un macromonomère conjugué aux prodrogues de iHDAC. Les nanoparticules sphériques sont obtenues par une polymérisation par méthathèse avec ouverture du cycle en présence du catalyseur de Grubbs de première génération.

Les nanoparticules fonctionnalisées avec le CI-994 ont permis d’induire l’acétylation de l’histone H3 in vitro. Les nanoparticules fonctionnalisées avec le SAHA ont induit l’acétylation de l’histone H3 in vivo mais sans ralentir le développement de la tumeur avec la quantité de SAHA chargée sur les nanoparticules. Les nanovecteurs porteurs de SAHA pourraient permettre la sensibilisation des cellules cancéreuses à l’action d’un autre agent anticancéreux plus puissant et cela grâce à la réactivation de gènes suppresseurs de tumeurs.

Les résultats les plus significatifs ont été obtenus avec les nanoparticules portant le NODH utilisées en combinaison avec la décitabine. Si cette combinaison avec le NODH seul permet d’observer un effet sur la réduction tumorale dans un modèle de mésothéliome intrapéritonéal orthotopique, cet effet est cinq fois plus important lorsque la combinaison

173 décitabine-nanoparticules de NODH est utilisée. L’efficacité du iHDAC est ainsi améliorée grâce à sa conjugaison aux nanoparticules polymériques via un système acido-labile.

Figure 121 : prodrogues de iHDAC synthétisées et représentation schématique d’une nanoparticule fonctionnelle de type PNB-PEO

Ce projet de thèse a également porté sur le développement de systèmes diaryltriazoles pH sensibles portant une substance active et un groupe fluorescent (Figure 122). Ces systèmes doivent être capables de réagir à la variation du pH en libérant la molécule d’intérêt et en

174 modulant la fluorescence également. Cette approche a été étudiée en préparant des modèles de prodrogues intégrant un motif coumarine comme molécule fluorescente. Cette étude nous a permis de valider la libération du iHDAC par ces nouveaux modèles diaryltriazoles fluorescents. Cependant la fluorescence du motif coumarine disparait dans le temps en milieu acide probablement à cause de la sensibilité de la structure de la coumarine envers les milieux tampons utilisés. L’utilisation d’un motif fluorescent plus efficace et plus stable comme les rhodamines ou les bodipys peut maintenant être envisagée et devrait permettre d’obtenir des systèmes acido-sensibles à fluorescence stable utilisables pour différentes molécules bioactives. La fonctionnalisation de nanoparticules par ce type de prodrogues est envisageable.

3

Bodipy Rhodamine

R2 = Modulateurs épigénétiques :

iHDAC, iHAT, iDNMT...

R1 = H, Me, OMe...

Nouveaux modèles de prodrogues pH labiles fluorescentes

R3 = Molécules fluorescentes pH labile :

Bodipy, rhodamine...

Figure 122 : Nouveau modèle de système diaryltriazole constitué à la fois d'une molécule fluorescente pH sensible et d’une molécule bioactive

En parallèle à ces travaux, une étude méthodologique a été réalisée concernant la synthèse de benzofuranones. Ces dernières sont nécessaires pour la préparation de différents analogues actifs de NODH en vue d’obtenir des inhibiteurs plus sélectifs soit des classes I/II des HDAC soit des isoformes de HDAC. Cette étude nous a permis dans un premier temps de mettre au point une nouvelle méthode de synthèse en milieu superacide de benzofuranones substituées en seulement deux étapes en partant de différents phénols commerciaux (Figure

175 123). La cyclisation intramoléculaire est effectuée sur des éthers de phénols en présence de l’acide triflique. Plusieurs benzofuranones ont été obtenues avec de bons rendements. Certains de ces composés peuvent être exploités pour d’éventuelles fonctionnalisations ultérieures.

Figure 123 : Préparation de benzofuranones en deux étapes à partir de phénols

Lors de cette étude, d’autres travaux ont été effectués dans le but de préparer des benzofuranones optiquement actives. Cette approche a été réalisée par la séparation énantiomérique de l’éther de phénol 109-l (Figure 124) en utilisant une technique de purification chromatographique automatique par colonne chirale. Cependant, la racémisation des substrats lors de la cyclisation intramoléculaire nous a conduits à adopter une autre approche. Cette dernière consiste en la séparation de sels de diastéréoisomères à partir d’un éther de phénol tertiaire 138 (Figure 124). La pureté énantiomérique de la benzofuranone correspondante doit être vérifiée. Ce travail devra être poursuivi afin de valider la pureté énantiomérique de la benzofuranone R(+)143 synthétisée.

Figure 124 : Résolution d'énantiomères d'éthers de phénols pour la préparation de benzofuranones chirales

176

Partie expérimentale

178

Partie expérimentale

1 Matériels et méthodes

1.1. Produits chimiques et solvant

Les réactifs chimiques et solvants utilisés pour la synthèse de l’ensemble des produits proviennent de chez plusieurs fournisseurs : Sigma-Aldrich, Flucka, Alfa-aesar et Acros organics. Les réactifs ont été utilisés sans purification particulière. Les solvants sont anhydres et sous septum.

1.2. Suivi des réactions et purifications chromatographiques

L’avancement des réactions a été réalisé par chromatographie sur couche mince. Les plaques de silice utilisées sont de type Macherey-Nagel (ALUGRAM® SIL G/UV254). La révélation des plaques CCM a été effectuée : par fluorescence dans l’ultra-violet à 254 nm et/ou par pulvérisation d’une solution d’acide phosphomolybdique dans l’éthanol suivie d’un chauffage par décapeur thermique.

La plupart des produits ont été purifiés par chromatographie flash automatique Combi- flash® sur des colonnes de silice RediSep® Rf (35-70 µm) et RediSep Rf GOLD® (20-40 µm) (Teledyne ISCO).

Certains produits ont été purifiés par chromatographie flash sur colonne de gel de silice (MACHEREY-NAGEL 60, 15-40 µm).

1.3. Analyses des composés

Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton (1H) du carbone (13C) et du fluor (19F) ont été enregistrés sur l’appareil BRUCKER 400 AVANCE III Plus à 400 et 100 MHz respectivement. Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm et sont calibrés par rapport au pic résiduel du solvant deutéré (CDCl3 : 7,26 ppm, CD3COCD3 : 2,05 ppm, DMSO-d6 : 2,50 ppm) comme référence. L’attribution des déplacements chimiques des

179 protons et des carbones a été réalisée par les expériences 1D (DEPT 135) et 2D (COSY H-H et HSQC). Les signaux observés ont été décrits avec les abréviations suivantes : s : singulet ; d : doublet ; t : triplet ; q : quadriplet ; dd : doublet dédoublé ; m : multiplet.

Les composés n’ont pas été numérotés selon la méthode conventionnelle dans le but de simplifier l’attribution des pics. Les analyses de spectrométrie de masse haute résolution (SMHR) ont été réalisés au Centre Régional de Mesures Physiques de l’Ouest (CRMPO) de l’université de Rennes sur des spectromètres de masse haute résolution WATERS Micro-Tof- Q et Q-Tof 2. Les points de fusion (Pf) ont été déterminés avec l’appareil BÜCHI Melting Point B-545. Les pouvoirs rotatoires [α]D ont été mesurés avec le polarimètre SHMIDT Polartronic HH8 à 20°C suivant l’équation : [α]D= ([α]D lue x 100)/(c x l), avec l : longueur de la cuve (dm) et c la concentration de la solution en g.mL-1.

1.4. Suivi d’hydrolyse des prodrogues par HPLC

Le suivi d’hydrolyse des prodrogues a été réalisé par HPLC en phase inverse sur des échantillons contenant 1 mg/mL de la prodrogue dans un mélange de solution tampon/acétonitrile (80/20).

Les analyses de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ont été effectuées avec l’appareil VWR HITACHI équipé d’un détecteur DAD L-2455 (gamme de détection : 200 à 400 nm) et d’une colonne ACE® C18 (5 µm, 4,6 x 250 mm). Les éluants sont composés d’acétonitrile et d’eau. Les analyses ont été réalisées selon la méthode générale présentée par le tableau 1 (injection : 15 µL ; débit : 1mL/min) :

Table 1 : Méthode générale des analyses HPLC

Temps (min) % ACN % H2O

0 2 98 5 2 98 10 70 30 30 70 30 35 5 95 40 2 98

180 Les hydrolyses ont été effectuées dans différentes solutions tampons à pH : 3, 4,3, 5, 6 et 7,3 (Sigma-Aldrich).

1.5. Analyses et purifications d’énantiomères par HPLC

La pureté énantiomérique des composés a été effectuée par HPLC en phase normale sur des échantillons contenant 1 mg/mL du composé à analyser dans l’hexane.

Les analyses HPLC ont été effectuées avec l’appareil VWR HITACHI équipé d’un détecteur DAD L-2455 (gamme de détection : 200 à 400 nm) et d’une colonne CHIRAL OD- H (150 x 4,6 mm). Les éluants sont composés de A : hexane, B : 2-pronanol et C : hexane/2- propanol (99/1). La plupart des composés ont été analysés suivant la méthode A présentée par le tableau 2 (injection : 15 µL ; débit : 1mL/min).

Table 2 : Méthode A des analyses de composés racémiques ou énantiopurs par HPLC

Temps (min) % A % B 0 98 2 5 98 2 10 90 10 15 90 10 20 98 2

Les composés 137, R(+)137, R(+)138 et 141 ont été analysés suivant la méthode B présentée par le tableau 3.

Table 3 : Méthode B des analyses de composés racémiques ou énantiopurs par HPLC

La purification des énantiomères (+)109l et (-)109l a été réalisée par chromatographie flash automatique combi-flash® sur une colonne OD-I (Chiralcel 5g ; 20µm ; Interchim). La séparation est effectuée en phase normal avec un éluant composé d’hexane et d’acétonitrile. Le tableau 4 présente la méthode utilisée pour la purification des deux énantiomères (débit : 1mL/min).

Temps

(min) % A % C

0 87 13

181

Table 4 : Méthode de séparation du composé racémique 109l sur colonne chirale OD-I

Temps

(min) % Hexane % 2-propanol

0 100 0 5 100 0 12 95 5 30 95 5 35 90 10 60 90 10

1.6. Analyses de fluorescence

Les spectres de fluorescence ont été enregistrés sur l’appareil Fluoromax®-4 (HORIBA Jobin Yvon). Les analyses ont été réalisées dans des cellules de quartz contenant des échantillons d’une concentration de 10 µM du composé à analyser dans une solution tampons à pH 1 (Sigma-Aldrich). Les échantillons sont préparés à partir d’une solution mère de 1 mM dans le DMSO.

1.7. Procédure A de ligation du iHDAC

Les quantités utilisées sont détaillées pour chaque exemple donné ci-après. A une solution de précurseur propargylé 5 (ou 77) dans le toluène sec est ajoutée le chlorure d’acétyle. Le mélange est maintenu sous agitation à reflux pendant 2h (ou 4h). Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite. Le brut obtenu est dilué dans un très petit volume d’acétonitrile fraichement distillé et ajouté sur un mélange de iHDAC, de triéthylamine et d’acétonitrile distillés. L’agitation est maintenue 12h à température ambiante. Le iHDAC non réagi est récupéré par filtration du mélange brut. Le filtrat est évaporé sous pression réduite et le brut obtenu est purifié par chromatographie flash automatique combiflash® (éluant DCM/MeOH : 100/0 – 96/4) pour obtenir la prodrogue correspondante.

1.8. Procédure B de ligation du iHDAC

A une solution de précurseur propargylé 5 dans le dichlorométhane sec est ajoutée une solution de HCl (2M dans Et2O). Le mélange est maintenu sous agitation à reflux pendant 2h.

182 Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite. Le brut obtenu est dilué dans un très petit volume d’acétonitrile fraichement distillé et ajouté sur un mélange de iHDAC, de triéthylamine et d’acétonitrile distillés. L’agitation est maintenue 12h à température ambiante. Le iHDAC non réagi est récupéré par filtration du mélange brut. Le filtrat est évaporé sous pression réduite et le brut réactionnel est purifié par chromatographie flash automatique

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