Ligation du SAHA et évaluation de l’hydrolyse acide des prodrogues

Comme il a été souligné précédemment, le SAHA appartient à la famille des acides hydroxamiques et c’est par le biais de cette fonction (CONHOH) que cet agent anticancéreux va être conjugué aux précurseurs diaryltriazoles 5a-e (figure 42). Ce choix permet également

80 de protéger cette fonction qui est le site principal de la métabolisation du SAHA par glucuronidation.229

igure 42 : Schéma de la conjugaison du SAHA avec les précurseurs 5a-e via la fonction acide hydroxamique

Cependant, étant donné le prix élevé du SAHA commercial, il a été synthétisé en trois étapes selon la méthode décrite par Mai et al. (figure 43).230 La préparation du SAHA débute par la synthèse de l’anhydride 16 obtenu par le chauffage à reflux de l’acide subérique 15 en présence d’anhydride acétique. L’anhydride subérique 16 a été par la suite condensé avec l’aniline en présence de THF afin d’obtenir l’acide 17 avec 94% de rendement. Ce dernier a été ensuite converti en acide hydroxamique correspondant en une seule étape. Celle-ci nécessite tout d’abord la formation du composé 18 en présence du chloroformiate d’éthyle et de triéthylamine. L’intermédiaire 18 est traité in situ avec l’hydroxylamine afin d’obtenir le SAHA avec un rendement global de 58% en trois étapes.

Figure 43 : Schéma de synthèse du SAHA selon la méthode décrite par Mai et al. (i) (CH3CO)2O, reflux/1h, (ii) Aniline (1 éq.), THF, ta/30min ; (iii) a) ClCOOEt (1,3 éq.),

81 Le SAHA ainsi obtenu est accroché sur chacun des précurseurs acido-labiles 5a-e préparés préalablement (figure 44). Cette approche passe par deux étapes. La première consiste en la formation des chlorures intermédiaires 19a-e. Ces derniers sont obtenus en présence d’une solution d’acide chlorhydrique (2M) dans l’éther et en chauffant à reflux dans le DCM. Cependant, en utilisant cette méthode sur les dérivés halogénés 5d et 5e, les chlorures intermédiaires ne se sont pas formés. Une autre alternative a donc été utilisée et cela en faisant réagir les précurseurs 5a-e avec le chlorure d’acétyle en chauffant à reflux dans le toluène. Cette approche permet la formation de tous les chlorures intermédiaires 19a-e au bout de 2h de réaction. Après l’évaporation sous pression réduite du solvant et du chlorure d’acétyle restant dans le brut réactionnel, les composés 19a-e sont ensuite ajoutés sur un mélange de SAHA et d’acétonitrile en présence de la triéthylamine afin de former les prodrogues de SAHA correspondantes 14a-e. La conjugaison du SAHA aux précurseurs diaryltriazoles 5a-e a permis d’obtenir les prodrogues 14a-e avec des rendements modérés allant de 18% à 42%. Comme on peut le remarquer, les rendements les plus faibles sont obtenus lorsque les cycles aromatiques des composés 5a-e sont substitués par des groupements à effet donneur d’électrons (R1 = OMe, Me).

3 5a-e 14a-e 3 3 19a-e i ii 42% 14a : R1 = H 18% 14b : R1 = OMe 18% 14c : R1 = Me 38% 14d : R1 = F 24% 14e : R1 = Cl SAHA, 3 é q.

Figure 44 : Schéma de synthèse des prodrogues de SAHA (i) HCl (2 M)/Et2O (2 éq.),

DCM, reflux/2h ou AcCl (5 éq.), toluène, reflux /2h ; (ii) Et3N (3 éq.), ACN, ta/12h.

Lorsque ces substituants sont halogénés (R1 = F, Cl), des rendements plus élevés sont obtenus (38% et 24% pour les substituants fluorés et chlorés respectivement). Le meilleur

82 rendement est obtenu lorsqu’il n’y a aucun substituant sur les cycles aromatiques des précurseurs 5a-e (42% pour R1 = H). Ceci pourrait être expliqué par la nature de l’effet électronique des substituants R1. En effet, l’effet mésomère +M des groupements R1 participent à la stabilisation des carbocations formés lors de la réaction, la prodrogue formée est alors moins stable. Il est possible qu’une partie de la prodrogue soit donc hydrolysée lors de la purification. Cependant, les réactifs de départ qui n’ont pas réagis peuvent être récupérés après la purification du mélange brut. Les précurseurs 5a-e et le SAHA sont ainsi recyclés pour une autre réaction de ligation.

L’acido-sensibilité de chaque prodrogue 14a-e est ensuite évaluée dans des solutions tampons à pH 4,3, 5,0, 6,0, et 7,3. Le suivi d’hydrolyse a été effectué par HPLC sur des échantillons contenant les prodrogues 14a-e à une concentration de 0.1mg/ml dans un mélange de solution tampon/acétonitrile (80/20). Le tableau 1 présente les valeurs des temps de demi-vie de chaque prodrogue de SAHA synthétisée.

D’après les résultats du tableau 1, on remarque que seules les prodrogues 14b et 14c sont acido-labiles. De plus, il apparait que plus R1 est un groupement à effet donneur d’électrons, plus la libération du SAHA est rapide. L’hydrolyse de la prodrogue 14c s’est produite à tous les pH, contrairement aux composés 14a, 14d et 14e qui sont restés stables dans les mêmes conditions. Ceci montre que l’effet +M des atomes d’halogène est fortement atténué par leur effet –I et qu’ils ne sont pas adaptés à la libération d’acide hydroxamique. La rapidité de l’hydrolyse du composé 14b pourrait être expliquée par la sensibilité de cette prodrogue à l’attaque nucléophile de la molécule d’eau dans le milieu, et cela à cause de la présence des groupements méthoxys sur les deux cycles aromatiques. Un résultat similaire a été décrit par Streidl et al. qui a observé une hydrolyse très importante des chlorures de di- et trianisyles en milieu aqueux.231

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Prodrogues de SAHA R1 pH 4,3 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,3

14a H stable stable stable stable

14b OMe 30 min 80 min 108 min 34 min

14c Me 20h 63 h 80 h 4 jours

14d F stable stable stable stable

14e Cl stable stable stable stable

Tableau 1 : Temps de demi-vie des prodrogues 14a-e à pH 4,3 ; 5,0 ; 6,0 et 7,3

3 14b,c 3 b : R1 = OMe c : R1 = Me pH<7 3 - SAHA 5b-c SAHA 20b,c -H+

Figure 45 : Schéma du mécanisme de libération du SAHA

Au niveau intracellulaire, les endosomes et les lysosomes, organites cellulaires nécessaires lors de l’endocytose, présentent un pH d’environ 6,0 et 5,0 respectivement. Ainsi, le taux d’hydrolyse mesuré à pH 6,0 montre que l’hydrolyse endosomale de la prodrogue 14c devrait être lente mais plus rapide au niveau lysosomal.

La libération du SAHA pour les prodrogues 14b et 14c pourrait être expliquée par le mécanisme d’hydrolyse présenté par la figure 45. En effet, l’acidité du milieu permet la protonation des prodrogues 14b et 14c au niveau de l’atome d’oxygène lié au carbone tertiaire, considéré comme le site le plus nucléophile. Cette protonation permet ainsi la libération de la molécule active et la formation du carbocation 20 stabilisé par les deux groupements aryles. Ce carbocation va par la suite subir une attaque nucléophile SN1 par la molécule d’eau pour obtenir les alcools 5b et 5c. Ainsi, d’après l’ensemble de ces résultats, il

84 apparait que la meilleure prodrogue capable de libérer le SAHA suivant les mécanismes d’endocytose est la prodrogue 14c. Avec un temps de demi-vie de 20h à pH 4,3 et de 4 jours à pH 7,3, cette prodrogue va permettre de prolonger la présence du SAHA dans l’organisme, comparé au SAHA libre qui est métabolisé en moins de deux heures.