Ligation du NODH et évaluation de l’hydrolyse acide des prodrogues

Le NODH est un iHDAC analogue de la TSA conçu au sein de notre laboratoire (Figure 49). Actif à l’échelle nanomolaire, le NODH a montré des activités anticancéreuses intéressantes en inhibant les HDAC de classe I et II.233 D’après les résultats obtenus avec la ligation du SAHA et du CI-994, les précurseurs qui montrent un caractère acido-sensible intéressant sont les alcools 5a et 5c.

Trichostatine A (TSA) a : R1 = H c : R1 = Me 3 5a,c 3 24a,c rac-NODH

Figure 49 : Schéma de la conjugaison des précurseurs 5a,c au NODH, analogue de la TSA

Les prodrogues précédentes portant les groupements méthoxys comme substituants aromatiques (14b et 21b) ont montré une hypersensibilité envers les milieux aqueux. De ce fait, le précurseur 5b ne sera pas utilisé pour la ligation du NODH (Figure 50). Seuls les précurseurs 5a et 5c seront exploités pour la conjugaison de ce iHDAC. Le NODH est un iHDAC qui appartient à la famille des acides hydroxamiques. Il peut être obtenu en 7 étapes de synthèse selon des travaux décris dans la littérature.231

88 28b i, ii 85% iii Reflux 12h 86% iv 70% v 81% vi 92% vii 35% 25 26 _28a 29 30 31 33 32 1éq. 1éq. 1éq. 1éq.

Figure 50 : Schéma de la préparation du NODH (i) BF3.Et2O (5 éq.), MeOH, reflux/24h ;

(ii) CH2O, NaBH3CN (15 éq.), CH3CN, ta/2h ; (iii) K2CO3 (1,5 éq.), DMF ; (iv) a)

MeONa, MeOH, reflux/12h, b) HCl (6N), AcOEt, ta/15min ; (v) PhH, reflux/4h ; (vi) LiOH aq. (2,5 M), THF/MeOH, ta/12h ; (vii) a) Et3N (1,3 éq.), THF, 0°C, 20min, b)

NH2OH (1,6 éq.), MeOH, ta/25min.

La préparation passe tout d’abord par l’estérification de l’acide 2-hydroxy-4- amonibenzoïque 25 en présence de l’acide de lewis BF3.Et2O dans le méthanol suivie d’une amination réductrice afin d’obtenir le composé 26 avec 85% de rendement sur les 2 étapes. Ce dernier est ensuite mis en réaction avec le bromopropionate de méthyle, en présence de K2CO3 dans le DMF pour donne l’éther intermédaire 28a dont le chauffage in situ à reflux provoque la déprotonation en alpha du motif propionyle conduisant à une cyclisation intramoléculaire en composé 28b, suivie d’une décarboxylation in situ selon la réaction de Krapcho. La benzofuranone 29 est obtenue directement avec 86% de rendement. L’insertion de la chaine diènique sur cette benzofuranone passe par une étape d’aldolisation effectuée en présence du méthanolate de sodium dans le méthanol. Le carbanion issu de la dépotonation en C2 de la benzofuranone réagit avec l’éthoxyméthacroleine et le traitement acide de l’aldol brut permet d’obtenir l’aldéhyde 30 avec 70% de rendement avec une configuration E. Ce dernier subi par la suite une réaction de Wittig en présence du triphénylphosphorane 31 pour donner le composé 32 avec 81% de rendement. L’acide 33 est obtenu avec 92% de rendement par une réaction de saponification effectuée en présence d’hydroxyde de lithium dans le méthanol. La fonction carboxyle de l’acide 33 est convertie est acide hydroxamique suivant la

89 méthode déjà utilisée pour la synthèse du SAHA. Cette dernière étape nous permet d’obtenir le NODH avec un rendement de 35%.

a : R1 = H c : R1 = Me 3 3 5a,c 3 19a,c 24a, 35% 24c, 18% i ii

Figure 51 : Schéma de la ligation du NODH aux précurseurs 5a,c (i) HCl (2M)/Et2O (2

éq.), DCM, reflux /2h ou AcCl (5 éq.), toluène, reflux /2h (ii) NODH (1,2 éq.), Et3N/ACN

(1:1), ta/12h.

Une fois le NODH obtenu, il est conjugué aux précurseurs 5a et 5c suivant la méthode de ligation utilisée antérieurement pour le SAHA et le CI-994 avec une modification permettant d’améliorer la solubilité (Figure 51). Après la formation des chlorures 19a,c, ces intermédiaires sont mis en réaction avec le NODH en présence d’un volume équivalent de triéthylamine et d’acétonitrile comme solvants. Dans ce cas de figure, la triéthylamine est utilisée comme base, mais aussi, comme solvant et cela afin d’améliorer la solubilité du NODH dans le milieu réactionnel. Les prodrogues de NODH 24a et 24c ont été obtenues avec des rendements modérés de 35% et 18% respectivement. Le faible rendement obtenu est dû à la fragilité de la prodrogue lors des étapes de purification.

Comme pour le SAHA et le CI-994, la libération du NODH par les prodrogues 24a,c a été évaluée à pH 4,3, 5,0, 6,0 et 7,0. Les valeurs des temps de demi-vie sont présentées dans le tableau 3. On remarque que la prodrogue 24c présente un caractère acido-sensible envers toutes les solutions tampons testées, contrairement à la prodrogue 24a qui reste stable dans les mêmes conditions.

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Prodrogues de NODH R1 pH 4,3 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0

24a H stable stable stable stable

24c Me 6,9 h 18h 5,1 jours 2,5 jours

Tableau 3 : Temps de demi-vie des prodrogues 24a,c à pH 4,3 ; 5,0 ; 6,0 et 7,3

En comparaison avec le SAHA, qui appartient également à la famille des acides hydroxamiques, la prodrogue 24c est moins stable que la prodrogue de SAHA équivalente 14c. Ceci peut être expliqué par la présence de la chaine diènique du NODH ayant un caractère attracteur d’électrons qui pourrait rendre la liaison O-hydroxamate moins stable, comparée à celle de la prodrogue 14c, qui quant à elle est stabilisée par la chaine carbonyle à caractère donneur d’électrons.

D’après les résultats obtenus dans le tableau 3, on remarque que le temps de demi-vie de la prodrogue 24c à pH 7,0 est de deux jours et demi, plus faible que la valeur à pH 6,0 (t 1/2 = 5 jours). Cette différence pourrait être due à la sensibilité de la prodrogue envers la nature de la solution tampon utilisée à pH 7,0. En effet, les deux solutions commerciales utilisées à pH 6.0 et 7.0 sont préparées avec des sels différents et ceci pourrait influencer l’hydrolyse de la prodrogue 24c, ce qui expliquerait le temps de demi-vie obtenu à pH 7,0, moins important que celui obtenu à pH 6,0. Il est possible que la compétition substitution/élimination soit en faveur de l’élimination ades pH plus « basiques » que pH 6. Enfin NODH possède un groupement diméthylamino nucléophile qui n’est pas présent dans les deux molécules précédentes qui ne pourrait ralentir l’hydrolyse à pH acide en captant une partie des protons. Avec des temps de demi-vie de 18h à pH 5,0 et d’environs cinq jours à pH 6,0, la prodrogue 24c pourrait être un bon candidat pour la fonctionnalisation des nanoparticules polymériques.