Ligation du iHDAC organosulfuré NHC-31

Les systèmes pH labile diaryltriazoles ont également été utilisés pour élargir le panel des composés vectorisables. Le thiol est un groupement fonctionnel présent sur plusieurs iHDAC comme la romidepsin ou le NHC-31. Un travail a été donc entrepris dans le but d’accrocher le NHC-31 sur les précurseurs 5a et 5c. Pour ce faire, le iHDAC a été tout d’abord synthétisé selon la méthode décrite par Suzuki et son groupe (Figure 52).234

91

Figure 52 : Schéma de synthèse du NHC-31 (i) LiOH.H2O (1 éq.), EtOH, THF, H2O,

ta/12h ; (ii) DMF, DCM, ta/12h ; (iii) Et3N, DCM, ta/12h ; (iv) AcSK (2 éq.), EtOH,

60°C/4h ; (v) NaOH aq. (2 éq.) EtOH, THF, ta/12h.

En partant du 7-bromoheptanoate d’éthyle A et en présence d’une solution d’hydroxyde de lithium, l’acide B a été obtenu avec un rendement quantitatif. Ce dernier est ensuite mis en réaction avec de chlorure d’oxalyle pour donner quantitativement le chlorure d’acide C. L’acétylation de la fonction amine du 2-amino-4-phénylthiazole D est réalisée en présence du chlorure C et de la triéthylamine pour obtenir l’amide E avec 61% de rendement. Ce dernier est traité avec le thioacétate de potassium pour donner le composé F avec 60% de rendement. Ce thioacétate F est hydrolysé par la suite en présence d’une solution alcaline d’hydroxyde de sodium. Cette réaction permet d’obtenir le NHC-31 avec un rendement global de 26% en cinq étapes (24% dans la littérature). Une fois le NHC-31 synthétisé, un premier essai de ligation du iHDAC sur le précurseur 5c a été réalisé selon une méthode déjà développée au laboratoire et utilisée pour la conjugaison d’alcools (Figure 53).225

92 3 5a, c 3 6 B(C6F5)3 6% mol. NHC-31 (1.2 éq) reflux/12h prodrogues de NHC-31 a : R = H b : R = Me

Figure 53 : Schéma des essais de ligation du NHC-31 sur les précurseurs 5a et 5b

Les précurseurs 5a,c ont été mis en réaction avec le NHC-31 en présence du tris(pentafluorophenyl)borane comme catalyseur. Les prodrogue attendues n’ont pas été obtenues. Les réactifs de départ sont à chaque fois récupérés à la fin de la réaction. D’autres tentatives de conjugaison du NHC-31 ont été réalisées suivant le même mode opératoire utilisé pour la ligation des iHDAC décrit précédemment. Les résultats obtenus n’ont pas été satisfaisants. Ceci pourrait être dû à l’inactivation du NHC-31 causée par l’oxydation de la fonction thiol (SH) en disulfure (S-S) en présence d’oxygène. Cette hypothèse a été vérifiée en utilisant le test d’Ellman donnant une couleur jaune en présence de thiol libre. Hors le composé synthétisé donne une couleur peu intense indiquant qu’il y a sans doute majoritairement le disulfure. La manipulation du NHC-31 ainsi que sa ligation aux précurseurs 5a et 5b doit s’effectuer en atmosphère inerte afin d’éviter l’oxydation du thiol en disulfure. La mise en œuvre de ces travaux est en cours de réalisation dans le but de pouvoir préparer des prodrogues de NHC-31.

L’ensemble de ces travaux nous a donc permis de préparer plusieurs prodrogues acido- labiles de trois iHDAC différents. Afin de pouvoir choisir les meilleurs candidats pour une éventuelle ligation avec les nanoparticules, les prodrogues synthétisées doivent être testées biologiquement afin d’évaluer la libération des iHDAC in vitro.

93

4 Evaluation biologiques des prodrogues

L’ensemble des tests biologiques consacrés à ces travaux a été effectué en collaboration avec l’unité INSERM/U892 de Nantes dirigée par le Dr. Marc Grégoire.

Des travaux réalisés antérieurement en collaboration avec l’équipe de Nantes ont permis de développer un test BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) qui permet de déterminer la capacité d’une molécule à induire l’acétylation de l’histone H3 directement sur des cellules vivantes.235 Les interactions entre les protéines contenant des motifs bromodomaines qui reconaissent les groupements acétyles présents sur les histones sont exploitées afin de développer un système fluorescent à deux partenaires basé sur cette interaction. La présence d’un inhibiteur HDAC dans le moyau conduit à une acétylation plus élevée des histones et donc à une interaction plus importantes avecles protéines à bromodomaine. Ceci se traduit par une augmentation du signal BRET. Afin d’avoir des mesures cohérentes quelque soit les molécules testées, un système cellulaire de référence a systématiquement été utilisé pour ce test : la lignée cellulaire MeT-5A, dont la culture est plus facile que d’autres modèles de cellules cancéreuses. En parallèle tous les testsde cytotoxicité ont été réaiséssur des cellules de mésothéliome ou d’adénocarcinone.

Le suivi de la libération en milieu biologique des iHDAC par les prodrogues peut aussi être réalisé avec ce test. Une variation de signal BRET permet non seulement de vérifier une activité inhibitrice HDAC mais également démontre intrinsèquement que les molécules entrent dans les cellules puisque la mesure est faite directement sur cellules vivantes. Le test permt de déterminé la concentration inhibitrice 50 (IC50) par efet dose et le suivi cinétique de l’efet pour une dose donnée. Ces deux tests ont été systématiquement réalisés pour toutes les molécules présentées dans ce travail.

La Figure 54A montre les résultats obtenus avec le SAHA libre et les prodrogues 14a- c. Le signal maximal BRET induit a été obtenu entre 24h et 36h pour tous les dérivés du SAHA. Cependant, les intensités ont été différentes. En effet, le SAHA libre a induit le signal BRET le plus important comparé aux prodrogues 14a-c. La Figure 54B montre les résultats

94 obtenus avec le CI-994 libre et conjugué sous forme des prodrogues 21a-c. Le signal maximal BRET induit a été obtenu pour les prodrogues 21b, 21c et pour le CI-994 entre 24h et 36h. Alors que pour la prodrogue 21a, 48h ont été nécessaire pour remarquer l’induction du signal BRET maximal. Par ailleurs, aucune différence significative n’a été observée entre les intensités du signal maximal BRET induit par les différentes prodrogues et le CI-994 libre.

Figure 54 : Evaluation cinétique de l’induction de l’histone H3 par le test BRET du : (A) SAHA et 14a-c, (B) CI-994 et 21a-c, (C) NODH et 24c. (En haut) Résultats exprimés en signal BRET induit (En bas) Signal maximal BRET induit pour chaque prodrogue.

La Figure 54C montre les résultats obtenus avec le NODH seul et conjugué sous forme de prodrogue 24c. Le signal maximal BRET induit a été observé entre 22h et 24h pour le NODH et la prodrogue 24c. De plus, aucune différence significative n’a été remarquée entres les intensités du signal maximal BRET induit par le NODH et la prodrogue 24c.

Comme on peut le remarquer sur la Figure 54A, le signal BRET induit par le SAHA est plus rapide et plus intense que les prodrogues 14a-c. Le composé 14b est la seule prodrogue à avoir une induction maximale entre 20h et 24h. Ceci pourrait être le résultat de la libération partielle et précoce du SAHA à l’extérieur des cellules suivie par la diffusion du iHDAC libéré à l’intérieur de ces dernières. Pour la prodrogue 14c, le profil du signal BRET obtenu correspond à la libération prolongé dans le temps du SAHA dans les cellules. Cette induction tardive du signal BRET pourrait être expliquée par la pénétration lente des

95 prodrogues à l’intérieur des cellules. Quant au signal BRET peu élevé obtenu par la prodrogue 14a, il pourrait être dû à sa stabilité ou à sa pénétration très lente à l’intérieur des cellules.

Le CI-994 et ses prodrogues ont démontré les mêmes réponses BRET, indiquant que la libération du iHDAC observée dans les conditions acides (tableau 2) est maintenue dans les cellules, menant ainsi à la libération rapide du CI-994 à l’extérieur des cellules ou bien au niveau des compartiments acides de ces dernières. Concernant le NODH et sa prodrogue 24c, la réponse BRET est similaire pour les deux composés (Figure 54C). Cependant, le signal BRET de la prodrogue est maintenu dans le temps alors que celui du NODH seul diminue très vite.

D’après l’ensemble de ces résultats, on suppose que la libération du iHDAC en milieu acide se fait au niveau cellulaire étant donné le temps requis pour les prodrogues pour induire un signal BRET alors qu’elles ont démontré une stabilité à pH physiologique. Ceci a été notamment observé pour les composés 14c, 21a et 24c. Ces prodrogues acido-labiles ont été choisies pour la fonctionnalisation des nanoparticules polymériques (Figure 55).

3 24c 3 21a 14c 3

Figure 55 : Structures des prodrogues retenues pour la fonctionnalisation des nanoparticules

96

5 Fonctionnalisation des nanoparticules avec

les prodrogues

L’ensemble de ces travaux a été effectuée en collaboration avec le laboratoire de chimie et des polymères organiques à Bordeaux au sein de l’équipe du Dr. Valérie Hérogez.

Les nanoparticules envisagées pour la vectorisation des iHDAC sont composées de matériaux polymériques de type cœur-écorce. Ces co-polymères sont constitués d’un cœur de polynorbornène (PNB) dont la surface est recouverte par des chaines de poly(oxyde d’éthylène) (PEO) et cela afin d’apporter des propriétés de furtivité aux nanoparticules.

La méthode de polymérisation repose sur la métathèse de norbornène 34 (Figure 56) en présence du catalyseur de Grubbs de première génération. La réaction entre le catalyseur et le norbornène conduit à l’ouverture du bicycle. La disparition de la tension du bicycle rend cette réaction irréversible. L’intermédiaire réactif obtenu peut alors réagir avec un autre motif norbornène et ainsi se produit la polymérisation. Cette méthode de polymérisation est dite par ouverture de cycle (Ring-Opening Metathesis Polymerization ROMP). Les monomères norbornènes utilisés possèdent une chaîne PEO et sont techniquement des macromonomères, puisque la chaîne PEO est elle-même un polymère. Le groupe hydroxyle terminal de la chaîne PEO a été modifié en azoture pour application en chimie click et ces macromonomères peuvent donc être préfonctionnalisés avant la polymérisation. Le faible pourcentage utilisé de macromonomères avec chaînes PEO dans la polymérisation par rapport au norbornène (1% environ) permet de stabiliser le milieu dispersé et d’obtenir des nanoparticules sphériques de taille homogène. Notre choix s’est porté sur ce type de nanoparticules car elles sont biocompatibles, ciblent les tumeurs par l’effet EPR et sont internalisées par les cellules par endocytose. Ceci a été démontré par des travaux décrits antérieurement.236 En effet, des co- polymères PNB-PEO ont été fonctionnalisés par une molécule fluorescente : la rhodamine, dans le but d’effectuer le suivi intracellulaire de ces nanoparticules (Figure 56). Le couplage de la rhodamine propargylée 38 au macromonomère azidé 36 a été effectué par chimie click pour obtenir le macromonomère fonctionnalisé 39.

97

Figure 56 : Schéma de la préparation de nanoparticules PNB-PEO fluorescentes (i) DPMK, THF, Oxyde d’éthylène, 20°C/48h, ensuite MeOH/HCl ; (ii) (a) MsCl, THF, Et3N, 20°C/24h, (b) NaN3, DMF, 20°C/40h ; (iii) EDC, DMAP, DCM, alcool

propargylique, 20°C/24h ; (iv) CuBr, PMDETA, DCM/EtOH 35/65, (v) 39 (1% mol), 40 (98% mol), et 35 (1% mol), Grubbs I, DCM/EtOH 35/65, 20°C/24h.

Ce dernier a été ensuite co-polymérisé par ROMP avec le monomère 35 et le norbornène 40 en milieu dispersé. Des nanoparticules fluorescentes sphériques ont été obtenues ayant un cœur hydrophobe recouvert d’une couche hydrophile de PEO. La caractérisation des nanoparticules a été réalisée par chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour déterminer la quantité de macromonomères consommée, et par chromatographie gaz pour déterminer la quantité de norbornène consommée. La taille des nanoparticules ét égalemetn déterminée par SEC et aussi par diffraction de la lumière (DLS). Le taux de fonctionnalisation du macromonmomère 39 par chimie click a été confirmé par RMN du proton.

98 Des tests in vitro réalisés sur les cellules de mésothéliome pleural malin montrent que ces nanoparticules sont internalisées par voie lysosomale. Ceci a été confirmé en co-localisant les nanoparticules fluorescentes avec les compartiments acides intracellulaires (Figure 57). Ces derniers ont été caractérisés par le marquage du gène LAMP-1 (Lysosomal-Associated Membrane Protein 1) qui se trouve au niveau des membranes lysosomales.

Figure 57 : Analyse par microscopie de fluorescence de l’internalisation de nanoparticules PNB-PEO fonctionnalisées par la rhodamine. (A) Localisation des nanoparticules fluorescentes, (B) Marquage LAMP-1 des vésicules acides, (C) Superposition des images A et B confirmant la co-localisation des nanoparticules avec compartiments acides intracellulaires.

L’analyse par microscopie de fluorescence montre que les cellules cancéreuses traitées avec les nanoparticules fonctionnalisées à la rhodamine ont bien été internalisées (Figure 57A).Le marquage LAMP-1 a permis de mettre en évidence les vésicules acides présentes dans les cellules (Figure 57B). La superposition des deux résultats (Figure 57C) donne la couleur jaune qui montre la co-localisation des co-polymères PNB-PEO avec les compartiments acides, confirmant que ces nanoparticules sont internalisées suivant les voies acides intracellulaires. L’utilisation de nanoparticules de type PNB-PEO acido-labiles pourrait être ainsi un moyen très efficace pour la libération d’agents actifs dans le milieu acide intracellulaire.

La biodistribution de ces co-polymères a été évaluée in vivo en injectant les nanoparticules fluorescentes à des souris portant une tumeur sous-cutanée de mésothéliome AK7. Après 24h d’injection des nanoparticules, la fluorescence a été détectée seulement dans la tumeur (Figure 58A). Après une semaine de post-injection, l’analyse de la fluorescence des organes isolés a démontré que les nanoparticules sont principalement concentrées au niveau

99 de la tumeur (Figure 58B). Cette accumulation sélective résulte de l’effet EPR favorisé par la furtivité des chaines PEO qui confère aux nanoparticules l’effet de furtivité in vivo.237

Figure 58 : Biodistribution des nanoparticules PNB-PEO fonctionnalisées avec la rhodamine sur une souris porteuse d’une tumeur sous-cutanée de mésothéliome. (A) Suivi de la fluorescence après l’injection, (B) Fluorescence observée sur des organes isolées une semaine après l’injection.

Ainsi, d’après les résultats obtenus par ces travaux, il a été convenu de préparer des co-polymères de type PNB-PEO acido-labiles fonctionnalisés avec les iHDAC. Pour ce faire, la préparation de ces nanoparticules repose sur la même stratégie de synthèse utilisée pour la préparation des nanoparticules de rhodamine (Figure 56).