Paul-Henri Consigny
Diagnostic parasitologique direct
Examen parasitologique du sang
Il est indiqué principalement dans le diagnostic du paludisme, mais peut s’avérer utile dans d’autres infections parasitaires à protozoaires (mise en évidence de Babesia, de trypanosomes), à métazoaires (mise en évidence de microfilaires san-guinicoles : loa loa, filaires lymphatiques, mansonella…), voire de certaines infec-tions bactériennes (borrélioses récurrentes). Il repose sur le frottis sanguin et la goutte épaisse. Les tests rapides pour le paludisme ne permettent pas un authentique diagnostic direct, car ils ne mettent en évidence qu’un antigène parasitaire (HRP2…) ou une enzyme parasitaire (LDH…).
Tableau 10.2
Principaux diagnostics à évoquer devant une pancytopénie au retour d’un voyage
Étiologie Diagnostic positif
Origine périphérique
Accès palustre aigu (accès palustre sévère)
Frottis sanguin–goutte épaisse Dengue hémorragique, fièvre
hémorragique virale Sérologie, recherche de virus par PCR
Hypersplénisme (neutropénie et thrombopénie prédominantes) : - paludisme chronique (paludisme
viscéral évolutif) - cirrhose hépatique
- autres causes de splénomégalie chronique
Frottis sanguin–goutte épaisse
Signes cliniques et biologiques d’insuffisance hépatocellulaire, d’hypertension portale Microangiopathie thrombotique
(anémie et thrombopénie prédominantes)
Hémolyse (avec schizocytes), insuffisance rénale Origine centrale à
moelle riche
Infection disséminée : - leishmaniose viscérale - tuberculose disséminée
- mycose profonde disséminée (histoplasmose)
- brucellose disséminée
Myéloculture, leuco-concentration, sérologie Myéloculture, recherche de BK dans d’autres sites (crachats, urines…)
Myéloculture, hémoculture,
sérologie
Myéloculture, hémoculture, sérologie
Carence vitaminique (en folates, en vitamine B12)
Dosage sérique folates, vitamine B12
Syndrome d’activation macrophagique, primitif ou secondaire
Hypertriglycéridémie sanguine, myélogramme, voire BM retrouvant une hémophagocytose Envahissement médullaire (par
hémopathie ou métastase de cancer) Myélogramme Myélodysplasie acquise (dont
l’infection VIH) Myélogramme, sérologie VIH Origine centrale à
moelle pauvre Aplasie médullaire
médicamenteuse : chloramphénicol, sulfamides, amphotéricine B, pyriméthamine, arsenicaux, hydantoïnes, barbituriques…
BM, anamnèse
(Suite)
Diagnostic du paludisme Frottis sanguin–goutte épaisse
Le frottis et la goutte épaisse se pratiquent sur un prélèvement sanguin veineux ou capillaire (au niveau d’un doigt).
Le frottis mince correspond à un étalement monocouche coloré au May-Grünvald-Giemsa (MGG), les structures des éléments figurés du sang et des parasites étant conservées. La goutte épaisse correspond, elle, à une technique de concentration aboutissant à un frottis « épais » coloré au MGG après hémolyse, ne permettant plus de visualiser les structures cellulaires, les parois cellulaires ayant été lysées : ce dernier est donc d’interprétation souvent plus délicate, si l’œil n’est pas entraîné, mais a l’intérêt de détecter des parasitémies faibles non identifiées sur le frottis.
Ces deux techniques sont indiquées en première intention et en urgence dans la présomption diagnostique du paludisme, permettant un diagnostic positif et, plus facilement pour le frottis mince, un diagnostic d’espèce, selon l’aspect microscopique observé, ainsi qu’une quantification de la parasitémie (cahier couleur : figure 10.2). Les principales caractéristiques de chaque espèce sont rapportées dans le tableau 10.3.
Tests de diagnostic rapide du paludisme (TDR) Ils regroupent deux types de tests :
n un test basé sur l’affinité de l’acridine orange pour l’ADN parasitaire, mis ensuite en évidence par fluorescence aux ultraviolets, sur sang centrifugé sur tube capil-laire : le QBC (quantitative buffy coat). Il permet un diagnostic positif mais pas un diagnostic d’espèce. La fluorescence observée correspond aux acides nucléiques parasitaires intra-érythrocytaires, les hématies non parasitées étant exemptes d’acides nucléiques. Cette technique a tendance à être abandonnée ;
n des tests basés sur la recherche d’un ou plusieurs antigènes parasitaires, par bande-lettes immunochromatographiques : ils utilisent soit l’antigène HRP2 (histidine rich protein 2), soit la pLDH (plasmodium lactate deshydrogénase), soit l’aldolase. Ils per-mettent un diagnostic rapide, positif et d’espèce pour certains d’entre eux, à l’ex-ception des infections mixtes. Sur le terrain, la limite des tests antigéniques est la persistance des antigènes parasitaires jusqu’à quelques semaines après le traitement.
Les principales caractéristiques de ces antigènes sont notés dans le tableau 10.4.
Tableau 10.2 (Suite)
Étiologie Diagnostic positif
Aplasie médullaire toxique
(insecticides…) BM, notion d’exposition soutenue Aplasie médullaire d’origine
infectieuse : hépatites virales B et C, EBV, CMV, rubéole
Myélogramme, voire BM, sérologies virales Myélofibrose (dans le cadre d’une
hémopathie) BM
BM : biopsie médullaire.
10. Interprétation d’un résultat de laboratoire77
Caractéristique P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae
Hématie parasitée Taille Normale Grande Grande Petite
Forme Normale Normale, déformée Ovale, frangée Normale
Granulation Taches de Maurer Grains de Schüffner Grains de
Schüffner Aucune
Parasite Polyparasitisme Fréquent Rare Rare Rare
Aspect du trophozoïte Annulaire, petit, souvent
binucléé, cytoplasme fin 1 ou 2 noyaux, cytoplasme
épais irrégulier 1 noyau, cytoplasme
épais régulier 1 noyau, cytoplasme
régulier dense, souvent pigmenté
Aspect du schizonte Absent Amoeboïde, pigment fin Amoeboïde, pigment
assez gros
En bande équatoriale, pigment gros abondant
Aspect de la rosace Absente Irrégulière, 16–24 noyaux Irrégulière, 8–10
noyaux
En marguerite, 6–12 noyaux
Aspect du gamétocyte En faux Sphérique Sphérique Sphérique
Parasitémie Moyenne 1 % 0,5 % 0,05 % 0,1 %
Maximale 40 % 2 % 2 % 2 %
Sensibilité des différentes techniques
Dans le paludisme, le seuil de détection de ces différentes techniques est de :
n frottis mince : 100 à 300 HPM (hématies parasitées/mm3) ;
n goutte épaisse : 5 à 20 HPM ;
n bandelettes réactives détectant des antigènes plasmodiaux : environ 100 HPM (la positivité à partir de 10 HPM est possible, mais avec une spécificité bien moindre) ;
n QBC : 0,1 à 1 HPM.
Diagnostic d’autres affections parasitaires ou bactériennes
Si le frottis sanguin et la goutte épaisse permettent prioritairement de faire le diagnostic de paludisme, ils sont aussi très utiles pour mettre en évidence d’autres parasites sanguins, qu’il s’agisse de protozoaires (trypanosomes, cahier couleur : figure 10.3 ; Babesia) ou de métazoaires (microfilaires sanguicoles, cahier couleur : figure 10.4), ou les bactéries spiralées responsables des borré-lioses récurrentes (Borrelia, cahier couleur : figure 10.5).
Tableau 10.4
Tests de diagnostic rapide du paludisme
Antigène HRP 2 pLDH Aldolase
Spécificité de(s) l’antigène(s)
P. falciparum P. falciparum P. vivax
Toutes les formes sexuées (gamétocytes) et asexuées
Toutes les formes sexuées et asexuées
Fonction de la parasitémie viable persistante
Fonction de la parasitémie viable persistante Possibilité de suivi
de l’efficacité thérapeutique
Non Oui Oui
Faux positifs Facteur rhumatoïde sur les tests de 1re génération Exemples de kits
commercialisés ICT Malaria Pf® Optimal® (avec la pLDH commune et l’antigène HRP 2 de P.f.) commune et l’antigène HRP 2 de P.f.) (1) Antigène commun à toutes les espèces plasmodiales.
Le prélèvement doit avoir lieu en période fébrile pour les trypanosomes, Babesia et Borrelia, ou conformément à la rythmicité d’émission des microfilaires selon la filariose suspectée (prélèvement à minuit dans la filariose lymphatique à Brugia malayi et Wuchereria bancrofti, à midi dans la loase).
Ces parasites ou bactéries peuvent tous être mis en évidence par frottis mince (ou épais) coloré au MGG, ou par un examen à l’état frais entre lame et lamelle, pour les parasites ou bactéries mobiles (microfilaires, trypanosomes, Borrelia).
Pour ces trois derniers, une centrifugation est souvent nécessaire au préalable.
Par ailleurs, le QBC permet de mettre en évidence ces différents parasites et bac-téries, ces derniers étant aussi pourvus d’acides nucléiques.
Examen parasitologique des selles Il se décompose en plusieurs étapes :
n examen macroscopique, permettant de mettre en évidence des helminthes adultes de grande taille (ascaris, oxyures, anneaux de ténias : pour ces derniers, les caractéristiques des anneaux sont récapitulées au paragraphe diagnostic de la fiche téniases, p. 215) ;
n examen microscopique direct :
l à l’état frais, indiqué particulièrement pour les parasites mobiles et pour apprécier la vitalité de certains œufs,
l après coloration pour mettre en évidence et identifier les kystes de proto-zoaires et les œufs d’helminthes, voire certains protoproto-zoaires, qui exigent des colorations spéciales ;
n examen microscopique après concentration : méthodes de concentration, souvent nécessaires pour bien mettre en évidence les kystes, œufs et larves, ceux-ci étant souvent excrétés de façon intermittente.
Afin d’assurer une bonne sensibilité à l’examen parasitologique des selles et compte tenu des cycles parasitaires, il est recommandé de pratiquer trois examens espacés de plusieurs jours répartis sur 8 à 10 jours.
Examen direct Pratique
Il se pratique à l’état frais, sur des selles fraîchement émises si possible dans l’heure précédente (prélèvement au laboratoire ), en diluant un petit frag-ment de selle dans une goutte de sérum physiologique, et en l’examinant entre lame et lamelle. Il permet de retrouver les formes parasitaires mobiles, comme les formes végétatives d’amibe ou de Giardia, d’apprécier la vitalité de certains œufs (schistosomes), mais aussi de mettre en évidence les kystes de protozoai-res, les œufs voire les larves d’helminthes, s’ils sont assez nombreux. Il permet par ailleurs de quantifier les leucocytes et hématies, de visualiser des cristaux de Charcot-Leyden.
Les colorations les plus employées sont :
n la coloration au lugol, particulièrement utile pour identifier les protozoaires, surtout les amibes (coloration en brun des vacuoles et noyaux des protozoaires) ;
n la coloration au MIF (merthiolate-iode-formol), dans la même indication ;
n La coloration de Ziehl-Neelsen modifiée, pour mettre en évidence les cryptos-poridies (mais aussi les Cyclospora et Isospora).
II. Pathologie du retour : orientation par signes et symptômes Caractéristiques des principaux protozoaires digestifs à l’examen direct
Forme végétative Kyste
Protozoaire Taille (m) Détails Taille (m) Détails
Flagellés Giardia intestinalis* 15 8 2 noyaux, corps parabasaux, 8 flagelles 12 8 Ovale, coque mince, 4 noyaux
Chilomastix mesnili 15 6 Sillon de torsion, vacuoles, 3 flagelles 8 5 Piriforme, coque épaisse, 1 gros noyau
Trichomonas intestinalis 12 8 Membrane ondulante, 5 flagelles
Amibes Entamoeba histolytica ou
dispar 15–30 Petites vacuoles, hématies dans les inclusions si
forme histolytica, membrane nucléaire fine, petit caryosome central
12–14 Sphérique, corps cristalloïdes épais,
pas de vacuoles, 4 noyaux
Entamoeba coli 20–40 Mobilité faible, nombreuses vacuoles, membrane
nucléaire épaisse, gros caryosome excentré 15–30 Sphérique ou ovalaire, corps
cristalloïdes fins, pas de vacuoles, 8 noyaux
Endolimax nana 5–15 Mobilité faible, petites vacuoles, membrane nucléaire épaisse, gros caryosome
7–12 Sphérique ou ovalaire, pas de
vacuoles, 1 à 4 noyaux Pseudolimax butschlii 8–15 Mobilité faible, nombreuses vacuoles, membrane
nucléaire mince, gros caryosome
5–20 Forme variable, grande vacuole
unique, 1 noyau Dientamoeba fragilis 3–15 Mobilité nulle, petites vacuoles, membrane nucléaire
mince, caryosome central avec 4–5 granules – Pas de kyste
Entamoeba hartmani 3–10 Petites vacuoles, membrane nucléaire mince, gros
caryosome excentré 9–10 Sphérique, corps cristalloïdes épais,
nombreuses petites vacuoles, 4 noyaux Entamoeba polecki 10–25 Mobilité nulle, grosses vacuoles, membrane
nucléaire mince, petit caryosome 9–17 Sphérique, nombre de vacuoles
variable, 1 noyau
*Cahier couleur : figure 10.6
Les différents œufs, kystes et formes végétatives
Pour les protozoaires, l’examen direct permet de distinguer les différentes for-mes végétatives et kystiques : le tableau 10.5 récapitule les caractéristiques des principaux protozoaires retrouvés.
L’examen direct permet aussi de mettre en évidence les œufs d’helminthes : l’identification des principaux se fait selon un mode résumé dans le tableau 10.6, prenant en compte la taille, la forme, les caractéristiques morphologiques de l’œuf.
Techniques de concentration
Elles sont destinées à enrichir le prélèvement à analyser, afin d’augmenter le ren-dement de détection de kystes, d’œufs ou de larves d’helminthes, surtout en cas de pauci-infestation.
Méthode de concentration de Ritchie
Plusieurs techniques de concentration sont décrites, basées sur des méthodes physiques (sédimentation, flottation), diphasiques (séparation chimique en phase lipophile et hydrophile, et sédimentation) ou combinées.
La méthode de Ritchie est une méthode diphasique, utilisant le formol et l’éther. Après obtention d’une émulsion contenant les selles diluées et les réactifs, est effectuée une centrifugation. La lecture microscopique se fait sur le culot de centrifugation, où sont concentrés les parasites, les résidus fécaux ayant été dissous. Les résultats obtenus sont similaires à ceux de l’examen direct, avec une concentration des kystes et œufs.
D’autres techniques diphasiques sont largement utilisées, comme la méthode de Bailenger (utilisant de l’acétate) ou de MIF-concentration (utilisant le MIF).
Méthode de concentration de Baermann
La méthode d’extraction de Baermann est destinée à mettre en évidence des lar-ves d’anguillules (Strongyloïdes stercoralis), mais elle peut aussi mettre en évidence d’autres larves d’helminthes, comme les larves rhabditoïdes d’ankylostomes.
Cette technique est basée sur l’hygrotropisme et le thermotropisme des lar-ves. La selle est déposée dans une passoire, sur de la gaze, elle-même dans un entonnoir relié à un tuyau fermé dont le fond est rempli d’eau chaude, où se rendent les larves en 1 à 4 heures. Après cette durée, le tuyau est ouvert, l’eau récupérée, centrifugée et le culot est examiné.
Examen parasitologique des urines
La recherche s’effectue sur les urines du matin ou émises après un effort (mar-che, sautillement…), voire sur toutes les urines de la journée (dont on recueille le dépôt). Les urines obtenues sont centrifugées et le culot analysé de façon directe, afin de visualiser les œufs et leur viabilité.
Il permet surtout la détection d’œufs de Schistosoma haematobium (cf. cahier couleur : figure 10.7) mais il peut parfois mettre en évidence des microfilaires en cas de chylurie (pour W. bancrofti) ou après prise de Notézine® (pour toutes les filaires), voire des protozoaires (Trichomonas vaginalis).
Examen mycologique
Il repose sur l’examen direct et la culture. Ces deux examens sont indissociables pour obtenir l’identification précise de l’agent fongique.
Taille(1) Présence d’un éperon
Présence d’un opercule Présence d’une coque uniforme
Latéral Terminal Épaisse Mince
Œufs (ovoïdes intercalatum(2) (200) Schistosoma haematobium(2, 4) (150) Cahier couleur : figure 10.7
Fasciola gigantica(2) (180) Fasciola hepatica(2) (130) Fasciolopsis buski(2) (125)
Petite
100
Petit éperon : Schistosoma japonicum(2) (80) Schistosoma mekongi(2) (65)
Marron :
Dicrocaelium dendriticum(2) (45)
Striée, marron : Taenia saginata(2) (40) Taenia solium(2) (35)
Symétrique : ankylostome(3) (60–70) Jaune ou brun clair :
Paragonimus westermani(2, 5) (90) Asymétrique :
oxyure(2) (50) Diphyllobathrium latum(3) (70)
Clonorchis sinensis(2) (30) Opistorchis sp.(2) (30) Heterophyes sp.(2) (25)
Mamelonnée, marron : Ascaris lumbricoïdes(3) (60) Avec 2 bouchons muqueux polaires :
Trichocéphale(3) (55) Claire avec filaments : Hymenolepis nana(2) (45) Claire sans filaments : Hymenolepis diminuta(2) (70) (1) La taille indiquée entre parenthèses correspond une valeur moyenne du grand diamètre de l’œuf.
(2) Œufs embryonnés.
(3) Œufs non embryonnés.
(4) Retrouvé dans les urines.
(5) Retrouvé dans les expectorations.
Examen direct
L’examen direct peut se faire à l’état frais, ou après adjonction d’éclaircissant (ex. : potasse ou lactophénol pour les cheveux, squames, poils, ongles) et/ou coloration (Giemsa ; Grocott, principalement pour les prélèvements biopsiques). Il permet de noter la morphologie du champignon (levures et/ou filaments, spores ; caracté-ristiques des filaments : septés ? fins ?…) et d’évaluer la quantité d’éléments fon-giques dans le prélèvement.
Cet examen direct est particulièrement intéressant dans le diagnostic des teignes du cuir chevelu, permettant de différencier les aspects de parasitisme des cheveux, selon la disposition des filaments et des spores au niveau du cheveu infesté :
n endothrix (T. tonsurans, T. soudanense) : nombreuses chaînes de grosses spores remplissant le cheveu ;
n endo-ectothrix :
l microsporique (Microsporum) : rares filaments à l’intérieur du cheveu, agglo-mérat de petites spores en surface,
l microïde (T. mentagrophytes) : quelques filaments à l’intérieur du cheveu, petites spores en surface,
l mégaspore (T. verrucosum) : filaments à l’intérieur du cheveu, grosses spores en surface ;
n favique (T. schoenleinii) : nombreux filaments dans le poil, filaments mycéliens enchevêtrés au niveau des godets.
Culture
La culture sur milieu de Sabouraud, éventuellement modifié (pour éliminer les contaminants bactériens ou fongiques), ou sur milieux spéciaux enrichis, permet de préciser l’espèce en cause, en évaluant les caractéristiques macroscopiques (aspect des colonies…) et microscopiques de la culture.