No sentido de avaliar o tipo de interação (sinérgica, aditiva ou antagónica) resultante da combinação da carboplatina e do piroxicam, foi implementado no programa Matlab o método descrito por Chou e Talalay (1984). O tipo de interação entre os fármacos é avaliado através do IC. Os resultados obtidos pelo ensaio do MTT sugerem que, a interação entre os dois fármacos é nitidamente sinérgica na linha T24 (IC50=0,65) e na linha 5637 (IC50=0,17) com valores de
IC inferiores a 1 (Tabela 2). O índice de redução da dose (DRI50) representa a magnitude da
redução da dose obtida para 50% do efeito inibidor de crescimento da combinação dos fármacos comparando com os resultados em isolado. O DRI50 da carboplatina e do piroxicam na linha
celular T24 foi de 20 e 1,8 respetivamente. Na linha celular 5637 o DRI50 foi de 20 na
carboplatina e 8,6 no piroxicam.
Tabela 2 – Estudo da interação dos fármacos pelo método de Chou e Talalay.
Linhas celulares
Carboplatina (IC50 µM)
Piroxicam
(IC50 µM) IC50 DRI50 Interpretação
T24 1 500 0,65 Carboplatina = 20 Piroxicam = 1,8 Sinérgico
5637 1 500 0,17 Carboplatina = 20 Piroxicam = 8,6 Sinérgico
IC50 – índice de combinação; DRI50 – índice de redução da dose.
4.2. Imunocitoquímica
Com o intuito de avaliar a expressão da proteína Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, expostas aos dois fármacos estudados, realizou-se a técnica de imunocitoquímica. Os resultados foram analisados qualitativamente, utilizando para tal, uma escala em que – indica sem marcação; + indica marcação muito fraca; ++ indica marcação fraca; +++ indica marcação moderada e ++++ indica marcação elevada.
Os controlos positivos (células não expostas aos fármacos e expostas ao Ki-67) apresentaram uma elevada expressão do Ki-67. Os controlos negativos (células não expostas aos fármacos e sem exposição ao Ki-67) não apresentaram qualquer tipo de marcação. Nas células tratadas com os fármacos isoladamente verificou-se uma expressão moderada do Ki-67 nas duas linhas celulares. No entanto, nas células tratadas com a carboplatina e o piroxicam em
combinado verificou-se uma redução da expressão do Ki-67, assim como uma diminuição da densidade das células por campo de visualização (Tabela 3; Figura 13).
Tabela 3 – Expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, após a exposição à carboplatina e ao piroxicam, isoladamente e em combinado. Linhas celulares Controlo positivo Controlo negativo Carboplatina (0,05 μM) Piroxicam (333 μM) Carboplatina (0,05 μM) + Piroxicam (333 μM) T24 ++++ - +++ +++ ++ 5637 ++++ - +++ +++ ++
Figura 13 – Imagens representativas da expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. A e F
– controlo negativo; B e G – controlo positivo; C e H –
carboplatina (0,05 µM); D e I – piroxicam (333 µM); E e J – carboplatina (0,05 µM) em simultâneo com o piroxicam (333 µM); ampliação de 200X.
4.3. TUNEL
O ensaio do TUNEL foi realizado para avaliar a indução de apoptose pelos fármacos testados. As duas linhas celulares tiveram índices de apoptose elevados no controlo positivo. No controlo negativo (células não expostas aos fármacos) obteve-se valores inferiores a 10% sendo estas células consideradas não apoptóticas (Figura 14). Nas células expostas à carboplatina e ao piroxicam isoladamente não se verificaram alterações quanto ao índice de apoptose quando comparado com o controlo negativo. No entanto, quando conjugamos a carboplatina (0,05 µM) e o piroxicam (333 µM), verificou-se um efeito mínimo na apoptose nas duas linhas celulares, com aproximadamente três células positivas por campo de visualização (Figura 15).
Figura 14 – Índice apoptótico obtido nas linhas celulares T24 e 5637, pela técnica do TUNEL após 72 horas de exposição à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão).
0 10 20 30 40 50 60 70
Controlo + Controlo - Carboplatina
(0,05 μM) Piroxicam (333μM) Carboplatina (0,05μM) + Piroxicam (333μM) Índ ice a po ptó tico ( %) T24 5637
Figura 15 – Ensaio do TUNEL. Imagens representativas das linhas T24 e 5637 expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os núcleos foram contrastados com DAPI e a fragmentação é detetada pela cor verde (FITC); ampliação original: 1000X.
4.4. Coloração de MDC
A coloração de MDC foi realizada com o intuito de detetar a presença de vacúolos autofágicos. Nesse sentido, as linhas celulares T24 e 5637 foram expostas aos fármacos isoladamente e em simultâneo. As células do grupo controlo (células não expostas aos fármacos) não apresentaram vacúolos autofágicos. Nas células que foram tratadas com a carboplatina e o piroxicam isoladamente, observou-se a existência de vacúolos autofágicos (visíveis pela presença de partículas fluorescentes) nas duas linhas celulares. No entanto, verificou-se um aumento notório da presença de vacúolos autofágicos quando as células foram expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM), em simultâneo (Figura 16).
Figura 16 – Coloração de MDC. Imagens representativas das células T24 e 5637 expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM), isoladamente e em combinado. Os vacúolos autofágicos são representados pelas estruturas fluorescentes; ampliação original: 1000X.
4.5. Coloração de Leishman
Para avaliar as alterações morfológicas celulares induzidas pela carboplatina e pelo piroxicam, isoladamente e em simultâneo, realizou-se a coloração de Leishman. Após 72 horas de exposição aos fármacos verificou-se que o grupo controlo, cujas células não foram sujeitas a qualquer tipo de tratamento, apresentou células normais e com características morfológicas de divisão celular em ambas as linhas celulares. Com a aplicação da carboplatina e do piroxicam em separado, identificaram-se corpos apoptóticos (com exceção da linha 5637 quando exposta ao piroxicam) e citoplasma vacuolizado nas duas linhas celulares. Na combinação dos fármacos observou-se uma maior incidência de corpos apoptóticos, citoplasma vacuolizado e células em apoptose (Figura 17).
Figura 17 – Coloração de Leishman. Efeitos morfológicos da carboplatina (0,05 µM) e do piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado nas linhas celulares T24 e 5637. Foram visualizadas características morfológicas de células em divisão (seta de cor cinza), células em apoptose (estrela), citoplasma vacuolizado (triângulo) e corpos apoptóticos (seta preta); ampliação original: 1000X.
5. Discussão
Capítulo 5
Discussão
5. Discussão
O cancro da bexiga é uma doença que continua a atingir milhares de pessoas todos os anos. Na maioria dos casos, os doentes não morrem devido ao tumor inicial, mas sim devido às sucessivas recidivas (Serizawa et al., 2011). Deste modo, a investigação de novas abordagens terapêuticas que aumentem a qualidade de vida e a longevidade destes doentes é um desafio constante para os investigadores na área da oncologia.
Os modelos in vitro são muito utilizados na pesquisa de novas abordagens profiláticas e terapêuticas para o tratamento do cancro, assim como para estudar o comportamento e a biologia dos tumores (Arantes-Rodrigues et al., 2013). As linhas celulares humanas são sem dúvida um dos modelos mais utilizados nas pesquisas efetuadas ao nível do cancro (van Staveren et al., 2009), dadas as suas vantagens. Neste estudo utilizamos como modelo experimental linhas celulares humanas de cancro da bexiga, nomeadamente, uma linha celular musculo-invasivo (T24) e uma linha celular superficial (5637). Num estudo genómico realizado por Pinto-Leite e colaboradores (2014) verificou-se que a linha celular T24 representa a via
FGFR3/CCND1, enquanto a linha celular 5637 representa a via E2F3/RB1. Estas duas vias
celulares representam os subtipos mais frequentes de cancro da bexiga, sendo por isso consideradas modelos fidedignos utilizados em ensaios pré-clínicos (Pinto-Leite et al., 2014).
A abordagem terapêutica que recorre à associação de vários fármacos é um dos métodos mais utilizados para o tratamento das neoplasias malignas. Esta combinação pode ser benéfica no sentido em que podem ser compreendidos vários alvos celulares com o mesmo tratamento (Chou, 2010). A prática da quimioterapia combinada com a utilização de fármacos com diferentes mecanismos de ação pode também potenciar o efeito com um único alvo e desta forma tratar a doença de forma mais eficaz. A administração de mais do que um fármaco em simultâneo, mas em menores concentrações, pode manter ou mesmo aumentar a eficácia dos fármacos quando comparado com a sua administração isoladamente. Além disso, a utilização de concentrações mais baixas pode prevenir e diminuir o aparecimento de efeitos secundários, nomeadamente diminuir a toxicidade celular e ainda minimizar ou retardar o desenvolvimento de resistência aos fármacos (Chou, 2006).
Na presente dissertação foi avaliado o efeito de dois fármacos com mecanismos de ação diferentes. A carboplatina é um fármaco antineoplásico análogo à cisplatina. De todos os fármacos disponíveis análogos à cisplatina, a carboplatina é a única que apresenta vantagens
sobre a cisplatina, alcançando por isso a aprovação a nível mundial para o uso em doentes oncológicos (Dasari e Tchounwou, 2014). O motivo pelo qual a carboplatina foi escolhida em detrimento dos restantes análogos da cisplatina tem a ver com redução dos efeitos secundários por si provocados (Etienne et al., 2003). A carboplatina não é tão potente como a cisplatina podendo ser usada em concentrações mais elevadas e em doentes que sofram de falência renal (Yoneyama et al., 2014). Atualmente, este fármaco é utilizado em doentes com cancro da bexiga aos quais foi diagnosticado em simultâneo uma insuficiência renal. Também foi utilizado em doentes com carcinoma urotelial e metástico (Dogliotti et al., 2007; Dreicer et al., 2004; Hudson e Lester, 2009; Park et al., 2013).
Por outro lado, o piroxicam é um AINE que bloqueia a atividade tanto da COX-1 como da COX-2 (Mohammed et al., 2003). Este não é o primeiro fármaco AINE utilizado em ensaios pré-clínicos com o intuito de investigar terapias alternativas e de prevenir o desenvolvimento de tumores (Ding et al., 2003; Huang et al., 2011). De acordo com Mohammed e seus colaboradores (2006), a prescrição de inibidores da COX em doentes com cancro da bexiga resulta no aumento da duração da remissão, prolongando a duração e a qualidade de vida dos mesmos.
O efeito da combinação da carboplatina e do piroxicam foi apenas estudado em cães com dois tipos diferentes de carcinomas. Boria e seus colaboradores (2005) avaliaram a taxa de remissão em tumores das células uroteliais caninas. Este autor refere que a combinação da carboplatina com o piroxicam administrada nestes animais provocou uma taxa de remissão de 40%, enquanto que noutros estudos efetuados, estes fármacos apenas alcançaram taxas de remissão de 10% na carboplatina (Chun et al., 1997) e 18% no piroxicam (Knapp et al., 2000). Vos e seus colaboradores (2005) obtiveram 57% de taxa de remissão quando administraram a carboplatina e o piroxicam a cães com carcinomas de células escamosas da cavidade oral. Apesar dos resultados promissores obtidos por estes autores, até à data, não está descrito qual o efeito da combinação da carboplatina e do piroxicam em linhas celulares humanas de cancro da bexiga.
No presente trabalho, a eficácia da carboplatina e do piroxicam, isoladamente e em combinação, foi avaliada pela análise da viabilidade celular, interação entre os fármacos, proliferação celular, apoptose, autofagia e alterações morfológicas celulares. Para tal, realizaram-se os ensaios do MTT, método de Chou e Talalay, imunocitoquímica, ensaio do TUNEL, coloração de MDC e coloração de Leishman, respetivamente.
O ensaio do MTT é amplamente utilizado pela comunidade científica para avaliar a viabilidade celular, através da atividade metabólica das células. É quantificada a redução metabólica do brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio pela enzima succinato desidrogenase associada ao NADPH e ao NADH, resultando na produção de cristais de formazan de cor púrpura. Estes cristais apenas são formados nas células que se encontram metabolicamente ativas (Twentyman e Luscombe, 1987). A frequente utilização deste método deve-se ao facto de ser um ensaio rápido, simples e preciso que permite efetuar testes com diferentes compostos e diferentes concentrações em simultâneo (Nicolau et al., 2001). Após 72 horas de exposição às diferentes concentrações de carboplatina, verificou-se uma considerável diminuição da viabilidade celular nas duas linhas celulares. Com a exposição das duas linhas celulares ao piroxicam obtiveram-se resultados semelhantes. A utilização simultânea da carboplatina e do piroxicam nas linhas celulares T24 e 5637 resultou num efeito sinérgico, com um IC inferior a 1 nas duas linhas celulares.
Estes fármacos já foram testados em vários ensaios com outros fármacos como o mitoxantrone (Henry et al., 2003), a cisplatina (Baldi et al., 2011; Verdina et al., 2008) e a gencitabina (Wang et al., 2010).
A carboplatina tem vindo a ser testada em diversas linhas celulares de outros tipos de cancro e em concentrações mais elevadas do que as testadas no presente estudo. Em linhas celulares de cancro da mama e com a aplicação de 24 µM de carboplatina, He e seus colaboradores (2000) obtiveram valores de viabilidade celular de 9%.
Verdina e seus colaboradores (2008) avaliaram o efeito do piroxicam na concentração de 760 µM em duas linhas celulares do mesotelioma (MSTO-211H e NCI-H245) e obtiveram valores de viabilidade de 23 e 43%, respetivamente. Apesar de no nosso trabalho a concentração testada mais elevada ter sido apenas 500 µM, observamos uma inibição da viabilidade celular de 50%.
De modo a complementar os resultados obtidos pelo ensaio do MTT, foi realizada a técnica de imunocitoquímica, uma metodologia frequentemente utilizada na investigação biomédica para detetar a presença de proteínas nas células (Burry, 2011). Em particular neste estudo, foi avaliada a expressão do Ki-67, uma proteína sinalizadora da proliferação celular, utilizada no diagnóstico do cancro da bexiga. Esta proteína está presente em todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2 e M) exceto na fase G0 (Silva-Filho et al., 2005). A expressão do Ki-67
marcador para prever a recidiva de cancro da bexiga muscular não invasivo (Wang et al., 2014). Com esta técnica foi possível confirmar que a combinação da carboplatina e do piroxicam diminui a proliferação celular nas linhas T24 e 5637 quando comparado com as células não tratadas, o que vai de encontro aos resultados obtidos no ensaio do MTT.
Pelo ensaio do TUNEL investigou-se a possível indução de apoptose através da quantificação do ADN fragmentado (Ovadje et al., 2012). O TUNEL é considerado um ensaio de rápida execução, de elevada sensibilidade e que permite quantificar o ADN fragmentado (Ribeiro et al., 2006). As células tratadas apenas com o piroxicam apresentaram um aumento mínimo do índice de apoptose quando comparado com as células do grupo controlo nas duas linhas celulares. Este dado foi semelhante aos resultados obtidos nos carcinomas das células escamosas caninas (Vos et al., 2005) e em mesoteliomas malignos (Baldi et al., 2011). Com a combinação da carboplatina e do piroxicam obteve-se um índice apoptótico entre 13 e 10% nas linhas T24 e 5637, respetivamente. Resultados idênticos foram obtidos por Baldi et al., (2011) quando testou o piroxicam em conjugado com a cisplatina em células de mesotelioma maligno, com cerca de 14% de apoptose avaliada por citometria de fluxo.
O MDC é utilizado como marcador específico dos autofagolisossomas para analisar o nível molecular da maquinaria envolvida no processo autofágico (Munafó e Colombo, 2001). A autofagia é um processo fisiológico intracelular, denominado de via de degradação de macromoléculas, que envolve o sequestro numa membrana vacuolizada denominada autofagossoma de organelos intracelulares e de porções citoplasmáticas (Munafó e Colombo, 2001). Desempenha um papel fundamental na renovação de proteínas citoplasmáticas, RNA e de outras macromoléculas citoplasmáticas e na eliminação de organelos danificados ou envelhecidos em organismos multicelulares garantindo o equilíbrio homeostático (Yang et al., 2008). Apesar dos fármacos que induzem a apoptose serem os principais agentes quimioterápicos na oncologia (Liu e Ryan, 2012), nos últimos anos o papel da autofagia no cancro tem vindo a ser muito discutido (Liu e Ryan, 2012; Mathew et al., 2007; Rosenfeldt e Ryan, 2011). A autofagia é considerada como uma nova forma de morte celular programada do tipo II distinta da apoptose e da necrose (Kroemer et al., 2009). Apesar disto, o seu papel não é consensual não se sabendo ao certo se a autofagia mata as células neoplásicas ou sustenta a sua sobrevivência em condições de stresse (Chen et al., 2010). A controvérsia mantém-se apesar de se saber que a autofagia é um alvo complexo na terapia do cancro (Bruin e Madema, 2008; Maiuri et al., 2009). Pela coloração do MDC verificámos a existência de vacúolos autofágicos
nas células tratadas com os fármacos isoladamente. Contudo, da abordagem simultânea da carboplatina e do piroxicam verificou-se uma maior incidência desses vacúolos.
O corante de Leishman, um derivado do corante de Ramanowsky, utilizado na coloração celular foi aplicado para determinar a existência de alterações morfológicas nas células. É um método de fácil execução, de baixo custo e que fornece informações sobre a morfologia celular (Mendiratta et al., 2006). Esta coloração é considerada um método simples que permite identificar alterações morfológicas como resultado da ação de fármacos antineoplásicos (Arantes-Rodrigues et al., 2013a; Arantes-Rodrigues et al., 2013b; Cepa et al., 2008; Pinto- Leite et al., 2012). A realização desta coloração permitiu-nos confirmar uma maior presença de alterações morfológicas aquando da combinação dos dois fármacos e nas duas linhas celulares, o que está de acordo com as técnicas previamente realizadas.
6. Conclusão
Capítulo 6
Conclusão
6. Conclusão
O cancro da bexiga continua a ser uma das neoplasias malignas mais prevalente. Apesar das investigações realizadas, os fármacos testados em ensaios clínicos não têm demonstrado uma eficácia superior relativamente aos fármacos já utilizados. A elevada taxa de recidiva e o elevado risco de progressão levam à necessidade de um acompanhamento e vigilância frequentes e por esse motivo esta neoplasia é considerada uma das mais dispendiosas de tratar.
Após a realização deste estudo in vitro concluímos:
○ A combinação de 0,05 µM de carboplatina e de 333 µM de piroxicam inibe notoriamente a viabilidade celular das linhas T24 e 5637;
○ A combinação da carboplatina e do piroxicam resulta numa interação sinérgica. Este resultado sugere que a utilização dos fármacos em simultâneo é mais eficiente do que quando administrados em separado;
○ Ambos os fármacos reduziram a proliferação celular pela análise da expressão da proteína Ki-67, com um efeito mais pronunciado na abordagem conjugada;
○ A combinação da carboplatina e do piroxicam induziu um ligeiro aumento do índice apoptótico;
○ Ambos os fármacos induziram a autofagia, com uma incidência mais evidente na combinação dos fármacos;
○ A análise da morfologia celular permitiu detetar uma maior incidência de alterações na combinação dos fármacos.
É pois necessário realizar agora um ensaio in vivo, com recurso a um modelo animal, para avaliar a eficácia desta associação de fármacos no cancro da bexiga.
7. Referências bibliográficas
Capítulo 7
7. Referências bibliográficas
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