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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Laurent, G. (1979). Etude du mécanisme d'action d'agents anticancéreux: activité antileucémique d'un dérivé de diazafluoranthène et son effet sur le

métabolisme des phospholipides. Potentialisation par l'amphotéricine B de l'effet de la 1-(2-chloroéthyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourée sur l'épendymoblastome murin (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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INSTITUT JULES BORDET - CENTRE DES TUMEURS Laboratoire d'investigation Clinique H.Tagnon

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

ETUDE DU MECANISME D'ACTIDN D'AGENTS ANTICANCEREUX :

Activité antileucémique d'un dérivé de diazafluoranthène et son effet sur le métabolisme des phospholipides Potentialisation par l'amphotéricine B de l'effet de la 1-( 2-chloroéthyl)-3-cyclohexyl-1 - nitrosourée sur

l'épendymoblastome murin .

Thèse déposée pour l'obtention du titre de Docteur en Sciences Zoologiques

19 7 9

LAURENT Guy

INSTITUT JULES BORDET - CENTRE DES TUMEURS Laboratoire d'investigation Clinique H.Tagnon

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

ETUDE DU MECANISME D'ACTION D’AGENTS ANTICANCEREUX :

Activité antileucémique d'un dérivé de diazafluoranthène et son effet sur le métabolisme des phospholipides Potentialisation par l'amphotéricine B de l'effet de la 1- ( 2 - chloroéthyl)-3 -cyclohexyl-1 - nitrosourée sur

l'épendymoblastome murin .

S~9o.^i

L

Thèse déposée pour Docteur en Sciences

l’obtention du titre de Zoologiques

19 7 9

LAURENT Guy

III - Matériel et méthodes communs aux deux systèmes ' expérimentaiix.

1. Mesure de la radioactivité 2. Dosages biochimiques

3. Réactifs.

RESULTATS

I - Effets de l'AC-3579 sur les phospholipides hépatique Synthèse de la phosphatidylcholine.

Hydrolyse des phospholipides hépatiques 1. Phospholipases endogènes

a. Caractérisation des activités enzymatiques présentes dans le foie normal.

b. Effet de l'AC-3579 sur la phospholipase A endogène.

2. Phospholipase A2 exogène 3. Phospholipase C exogène.

II - Effet in vitro de l'AC-3579 sur la cellule de la leu cémie P 388.

1. Cytotoxicité.

2. Métabolisme des phospholipides a. Synthèse

b. Catabolisme.

TABLEAUX 1 à 3 FIGURES 1 à 17

DISCUSSION

I - Mécanisme d'action de l'AC-3579 sur le métabolisme des phospholipides hépatiques.

II - Effet in vitro de l'AC-3579 sur la leucémie P 388.

III - Conclusion

3

2ème PARTIE

LA POTENTIALISATION PAR L'AMPHOTERICINE B DE L'EFFET DU CCNU SUR L'EPENDYMOBLASTOME DE SOURIS

INTRODUCTION

L'amphotéricine B.

Structure et propriétés physico-chimiques de l'ampho- théricine B.

Effet de l'amphotéricine B sur la perméabilité cellu­

laire .

La 1-(2-chloroéthyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourée (CCNU).

Propriétés chimiquesdu CCNU.

BUT DU TRAVAIL

MATERIEL ET METHODES I - Animaux

II - Tximeur

1. Transplantation de 1'épendymoblastome.

2. Mesure de 1'épendymoblastome.

III - Médicaments

IV - Méthodes biochimiques

1. Pénétration du ( C) CCNU dans 1'épendymoblastome. 14 2. Isolement des membranes plasmatiques de 1'épendy­

moblastome .

a. Fractionnement subcellulaire.

b* Distribution subcellulaire de l'amphotéricine B tritiée

c. Dosages enzymatiques 5'-nucléotidase phosphodiestérase I

arylestérase

succinate deshydrogénase

3. Mesure d'incorporation de précurseurs radioactifs

dans les acides nucléiques et les protéines de

1'épendymoblastome.

a. Acide désoxyribonucléique b. Acide ribonucléique

c. Protéines

4. Dosages biochimiques V - Mesure de la radioactivité.

VI - Méthodes morphologiques.

1. Préparation des membranes d'épendymoblastome pour l'examen au microscope électronique.

2. Démonstration histochimique de la 5'-nucléotidase.

VII - Précurseurs radiocatifs et réactifs.

4

RESULTATS

I - Effets de 1'amphotéricine B et du CCNU sur la crois­

sance tumorale.

II - Mécanisme de la potentialisation de l'effet du CCNU par 1'amphotéricine B.

1. Effet de 1'amphotéricine B sur la perméabilité cellulaire de 1'épendymoblastome.

a. Isolement des membranes plasmatiques et

distribution subcellulaire de 1'amphotéricine B dans 1'épendymoblastome.

1®) Localisation cytochimique de la 5'-nucléotidase

2®) Purification des membranes plasmatiques de 1'épendymoblastome

3®) Caractéristiques de la fraction de mem­

branes plasmatiques

4®) Distribution subcellulaire de 1'ampho­

téricine B.

b. Effet de 1'amphotéricine B sur la pénétration du CCNU dans 1'épendymoblastome

1®) Mesure de la pénétration du< C-cyclo- 114 hexyl} CCNU et de ses produits de décom­

position.

2®) Mesure de la pénétration du[ ^C-chloro- ethyl) CCNU et de ses produits de décom­

position .

3®) Extraction et purification du CCNU

contenu dans 1'épendymoblastome. Mesure

de la concentration intratumorale de

CCNU.

5

2. Effet de 1'amphotéricine B et du CCNU sur la synthèse des acides nucléiques et des protéines.

a. Synthèse du DNA b. Synthèse du RNA

c. Synthèse des protéines

TABLEAUX 1 à 11

FIGURES 1 à 19

DISCUSSION

I - Interprétation immunologique de la potentialisation par 1'amphotéricine B.

II - Potentialisation par 1'amphotéricine B due à l'aug­

mentation de perméabilité cellulaire.

1. Distribution subcellulaire de 1'amphotéricine B dans 1'épendymoblastome.

2. Effet de 1'amphotéricine B sur la pénétration intratumorale du CCNU et de ses produits de dégra­

dation .

III - Effet du CCNU et de 1'amphotéricine B sur l'incorpora­

tion de précurseurs radioactifs dans les acides nuclé­

iques et les protéines.

IV - Conclusions.

REFERENCES

6

REMERCIEMENTS

Je tiens à exprijner ma profonde gratitude à l'égard du Professeur H.Tagnon, qui m'a accueilli dans le Service de Médecine Interne de l'Institut Jules Bordet et m'a permis de poursuivre cette étude. Les recherches menées dans le cadre de cette thèse ont été réalisées dans le Laboratoire d'investigation Clinique, sous la direction du Docteur

J.Hildebrand. Qu'il trouve ici la marque de mon estime et de ma reconnaissance pour les encouragements et les pré­

cieux conseils qu'il m'a prodigués tout au long de mes re­

cherches.

Le Docteur J.Urbain, du Laboratoire de Physiologie Animale de l'Université Libre de Bruxelles a accepté de revoir ce travail ; je lui en suis très reconnaissant.

L'expérimentation sur les tumeurs murines s'est déroulée en partie dans le Service de Screening Animal de 1'Institut Bordet. Je remercie vivement le Docteur G.Atassi, directeur de ce service, pour son précieux appui et la sympathie qu'il m'a témoignée. Je tiens aussi à remercier Monsieur J.Dumont et les autres personnes du Screening pour l'aide qu'ils m'ont apportée.

Je remercie Madame Dewerie-Vanhouche pour son assistance technique et je désire souligner ici sa compétence et son ef­

ficacité.

7

Les photos de microscopie électronique illustrant les alté­

rations morphologiques produites par l'AC-3579 m'ont été fournies par le Docteur O.Thys, qui en a autorisé la repro­

duction,

La démonstration cytochimique de la 5' -nucléotidase a été réalisée en collaboration avec Mademoiselle M.Doriaux, qui a mis au point les techniques morphologiques. Je garde un excellent souvenir de notre travail commun.

Je tiens à remercier la Firme Christiaens (Bruxelles) qui m'a procuré l'AC-3579 et les rats traités. Je n'oublierai pas l'esprit de collaboration cordiale témoigné par les per­

sonnes de ce laboratoire.

Les médicaments radioactifs utilisés dans ce travail ont été obtenus grâce à l'appui précieux des Docteurs Lecoq et

Calasse de la firme Squibb (Bruxelles) et du Docteur Engle du National Cancer Institute (Bethesda). Je remercie ces person­

nes pour la compréhension dont elles ont fait preuve.

Les frais du marquage radioactif ont été entièrement assumés par la firme Squibb et le National Cancer Institute.

Le travail a bénéficié de l'appui financier du Fonds

Cancérologique de la Caisse Générale d'Epargne et de Retraite.

Le manuscrit de la thèse a été préparé par Mesdames Duvocelle et Pauwels, que je remercie également.

En conclusion, j'aimerais dédier cette thèse à tous ceux

qui, dans une quelconque mesure, m'ont apporté leur aide ou

leurs idées.

AVANT-PROPOS

8

Le traitement du cancer fait intervenir des techniques qui varient selon la nature et le degré d'extension de la mala­

die. L'éxérèse chirurgicale, souvent suivie d'une radiothérapie, et d'une chimiothérapie, se pratique dans les cas de txameurs

localisées dont l'extirpation est possible. Pour traiter les cancers dont la généralisation est primaire (leucémies) ou secondaire (tumeur solide plus métastases), on recourt à la chimiothérapie et/ou l'immunothérapie. Ce dernier type de

traitement présente l'avantage d'une faible toxicité et, dès lors, semble plein de promesses. Néanmoins, son efficacité reste enco­

re à démontrer, du moins dans le cas de tumeurs hiomaines.

L'inconvénient majeur de la chimiothérapie anticancéreuse est son manque de spécificité et donc sa grande toxicité. Il existe bien sûr des différences entre cellules tumorales et cellules saines. Les modification morphologiques qui accompagnent la transformation néoplasique sont parfois importantes, suggérant une dédifférenciation des cellules. D'autre part, les cellules néoplasiques montrent in vivo et in vitro une prolifération anar­

chique, alors que la prolifération des cellules normales est contrôlée. Par contre, les analyses biochimiques n'ont jusqu'à présent fait apparaître que des différences quantitatives entre la composition des cellules tumorales et celle des cellules saines.

En outre, ces différences ne caractérisent pas l'état néoplasique, contrairement à la chimiothérapie des infections bactériennes

qui utilise certaines particularités biochimiques des cellules

bactériennes pour détruire sélectivement celles-ci, la chimio­

thérapie antitimorale est peu spécifique. Un des rares exemples d'une chimiothérapie exploitant une différence biochimique entre cellule tumorale et cellule saine est le traitement des leucémies par la L-asparaginase. Le principe de cette thérapie se base sur l'absence de synthèse d'asparagine dans les cellules tumorales.

Le traitement par 1'asparaginase a toutefois au niveau hépatique des effets secondaires indésirables qui en limitent l'utilisation.

Malgré la toxicité systémique des composés utilisés en chi­

miothérapie antitumorale, on a pu obtenir surtout durant la dernière décade des succès considérables dans le traitement de certaines tumeurs. L'exemple le plus frappant est celui de la leucémie lymphoblastique aiguë de l'enfant. La survie médiane des enfants atteints de cette maladie est passée de quelques mois à plus de cinq ans, avec une probabilité de guérison s'éle­

vant à 40%. Les résultats thérapeutiques obtenus par le traite­

ment des lymphomes de Hodgkin et de Burkitt ont montré une

évolution comparable. Par contre, en ce qui concerne les tumeurs solides plus fréquentes telles que le cancer du sein,du tube

digestif, du système respiratoire ou du système nerveux central, les progrès ont été beaucoup plus modestes, et ces tumeurs restent souvent peu sensibles à la chimiothérapie.’

Les recherches en chimiothérapie explorent actuellement

plusieurs voies pour rendre le traitement des tumeurs plus effica­

ce ; essai de différents schémas d'administration et de nouvelles associations de composés carcinostatiques; introduction de médi­

caments nouveaux en clinique, potentialisation de l'activité d'agent carcinostatique.

9

10

L'association d'agents carcinostatiques qui agissent par des mécanismes différents et n'ont pas nécessairement les mêmes effets secondaires s'est avérée plus efficace que l'ad­

ministration d'un seul agent. La poly-chimiothérapie est en grande partie responsable des succès obtenus dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë et des lymphomes. Il est probable que d'autres progrès pourront être réalisés par l'utili­

sation rationnelle des combinaisons d'agents chimiothérapiques.

Régulièrement, de nouveaux agents chimiothérapiques sont décou­

verts sur la base de leur activité thérapeutique vis-à-vis de diverses tumeurs expérimentales. Des programmes ont été mis en oeuvre, notamment au National Cancer Institute (Etats-Unis) pour sélectionner parmi un nombre considérable de composés chi­

miques ceux dont les propriétés carcinostatiques pourraient être exploitées en clinique. Les substances dont l'activité a été récemment découverte ont souvent un mode d'action peu connu et leur utilisation rationnelle en clinique n'est possible qu'après une meilleure connaissance de leurs propriétés pharmacologiques et biologiques. La première partie de notre travail est consa­

crée à l'étude de l'AC-3579, un dérivé de diazafluoranthène dont l'activité antileucémique a été démontrée à l'Institut Jules Bordet et qui par son mécanisme d'action diffère des médicaments traditionnels.

Le phénomène de potentialisation est observé dans une association de médicaments lorsque l'un d'entre eux augmente l'effet de

l'autre, de sorte que l'effet de la combinaison est supérieur

à l'addition des effets de chaque médicament.

11

La potentialisation se révèle particulièrement intéressante quand elle permet d'augmenter l'efficacité thérapeutique sans accroître la toxicité secondaire. Le CCNU, un des seuls agents actifs sur les tumeurs cérébrales, donne en clinique des résul­

tats assez modestes. Nous avons tenté d'augmenter son activité carcinostatique en l'associant à 1'amphotéricine B. La seconde partie de notre travail développe l'étude de cette potentialisa­

tion et de son mécanisme.

12

1ère PARTIE

EFFET DE L'AC-3579 SUR LE METABOLISME DES PHOSPHOLIPIDES

DANS LE FOIE DU RAT ET LA LEUCEMIE MURINE P 388

13

INTRODUCTION

PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DE L*AC-3579

L'AC-3579 est un N-oxyde du diazafluoranthène substitué en position 2 par un groupement N,N'-méthylpipérazinométhyle

(Figure 1.).

Le produit d'une masse molaire de 332,2 se présente sous la forme d'une poudre jaune. Il est peu soluble dans l'eau

(solubilité inférieure à 500 pg/ml) mais facilement soluble dans le méthanol, le chloroforme et d'autres solvants apolai- res. La molécule d'AC-3579 se compose d'une partie hydrophobe (cycles aromatiques) et d'une partie hydrophile (N-oxyde de la pyrimidine et pipérazine). Ce caractère amphipatique est respon­

sable des modifications ultrastructurelles induites par l'AC- 3579 dans l'hépatocyte (O. Thys, 1974) et pourrait être à l'ori­

gine de son activité antileucémique découverte dans le Labora­

toire d'investigation Clinique de l'Institut Jules Bordet (J. Hildebrand et coll., 1973-a). L'étude de ces deux propri­

étés a été développée dans la première partie du travail. Avant

de l'aborder, nous rappellerons succinctement les résultats des

travaux précédents.

14

EFFETS DE L'AC-3579 SUR LA CELLULE HEPATIQUE

Chez le rat traité par l'AC-3579, le poids du foie aug­

mente d'environ 75 %. Les causes de cette hépatomégalie ont été élucidées par 0. Thys (1974) , au cours d'une étude mor­

phologique détaillée des altérations du foie par l'AC-3579.

Nous résumons ici ses travaux réalisés sur des rats traités par une dose quotidienne de 250 à 500 mg d'AC-3579 par kg.

L'examen du foie au microscope photonique montre dès le 16ème jour du traitement l'apparition d'inclusions pigmentaires dans la région péribiliaire des cellules situées au centre des lobules. L'histochimie révèle dans les mêmes régions du tissu hépatique une forte activité de phosphatase acide. L'hépato­

mégalie due au traitement par l'AC-3579 ne résulte pas d'une stimulation de la prolifération cellulaire car les pourcentages de cellules en mitose sont équivalents dans les foies d'ani­

maux traités et témoins. Les altérations ultrastructurelles

observées au microscope électronique apparaissent très tôt dans

les hépatocytes. Dès le 2ème jour du traitement, on constate

un début d'hypertrophie du réticulum endoplasmique lisse et

l'apparition d'inclusions multilamellaires (figures pseudo-

myéliniques). L'hypertrophie s'accentue au cours du traitement

et donne naissance à des formations en spirale. La taille et

le nombre des inclusions multilamellaires augmentent avec la

durée du traitement (Figures 2, 3 et 4).

15

Ces altérations morphologiques sont réversibles : 16 jours après l'arrêt du traitement, le réticulum endoplasmique a repris un aspect normal dans la plupart des cellules et les

figures pseudo-myéliniques ont disparu. Sur le plan biochimi­

que, l'hépatomégalie est causée par une accumulation moyenne de 1 g de protéines et de phospholipides et de 2 g d'eau.

Les quantités totales de protéines et de phospholipides sont respectivement 1,7 et 4 fois supérieures à celles déterminées dans le foie témoin. l'AC-3579 modifie en outre les proportions relatives des phospholipides individuels car la phosphatidyl- choline s'accumule de manière préférentielle.

Bien que durant le 4 premiers jours du traitement, l'ad­

ministration de l'AC-3579 provoque dans le foie une accumula­

tion moyenne de 36 mg de phospholipides par jour, la vitesse d'incorporation de l'orthophosphate- P dans les phospholipides 32 est la même chez les animaux traités et témoins. D'autre part, l'hydrolyse des phospholipides hépatiques marqués par l'ortho- phosphate- P est moins rapide chez les rats traités par 32

l'AC-3579. Ces résultats indiquent que l'accumulation des

phospholipides hépatiques résulte d'une inhibition de leur

catabolisme plutôt que d'une stimulation de leur synthèse.

16

ACTIVITE ANTILEUCEMIQUE DE L'AC-3579

L'AC-3579 possède un effet cytotoxique sur les leucémies expérimentales P 388 et L 1210 inoculées dans la cavité péri­

tonéale de la souris. L'administration du médicament à des doses quotidiennes de 100 à 300 mg/kg augmente de 44 à 66 % la survie des souris portant la leucémie P 388. Dans une moin­

dre mesure, la leucémie L 1210 est également sensible à l'AC- 3579 puisque l'injection du produit augmente le temps de survie de 23 à 28 %.

L'AC-3579 provoque in vitro l'apparition d'altérations ultrastructurelles dans les cellules de la leucémie P 388.

En présence de 100 jag de produit par ml de milieu, les cellules montrent après 30 minutes d'incubation des inclusions cytoplas­

miques contenant du matériel amorphe ou des structures lamel­

laires (Figures 5 et 6). L'aspect de ces vacuoles rappelle les figures pseudo-myéliniques observées dans le foie et suggère une analogie entre le mécanisme d'action de l'AC-3579 sur.

1'hépatocyte et la cellule leucémique.

En résumé, la structure originale et le mécanisme d'action possible de l'AC-3579 le distinguent de tous les autres agents utilisés dans la chimiothérapie antitumorale. En effet, les propriétés carcinostatiques des médicaments actuels proviennent soit de l'altération structurelle des acides nucléiques (agents alkylants), soit de l'inhibition de la réplication, de la trans­

cription ou de la traduction, soit encore de la destruction

du fuseau mitotique (alcaloïdes de Vinca rosea).

17

Si le mécanisme impliqué dans les altérations hépatiques était aussi responsable de l'activité antinéoplasique, l'AC-3579 apparaîtrait comme le premier agent carcinostratique inter­

férant avec le métabolisme des phospholipides. La faible toxi­

cité systémique de l'AC-3579 rend possible son utilisation en clinique, mais son introduction dans la chimiothérapie des tumeurs humaines nécessite des études supplémentaires sur son mécanisme d'action.

Les études morphologiques et biochimiques sur les altéra­

tions du tissu hépatique par l'AC-3579 ont permis de dégager une hypothèse concernant le mécanisme d'action de ce composé.

C'est pourquoi, dans la première partie de notre travail, nous avons choisi le foie pour tenter d'élucider le mécanisme d'ac­

tion de l'AC-3579. La deuxième partie concerne l'effet du médi

cament sur le métabolisme des phospholipides dans la cellule

de la leucémie P 388 qui est la plus sensible à l'AC-3579.

18

BUT DU TRAVAIL

Confirmer que l'accumulation des phospholipides dans le foie est due à une dépression de leur catabolisme plutôt qu'à une stimulation de leur synthèse. Dans ce but, nous avons mesuré la synthèse de la phosphatidylcholine, phos- pholipide dont l'accumulation est la plus importante sous l'effet de l'AC-3579.

Elucider le mécanisme par lequel l'AC-3579 inhibe le cata­

bolisme des phospholipides dans le foie du rat.

Etudier in vitro 1 ' activité antileucémique de l'AC-3579, en relation avec son effet sur le métabolisme des phos­

pholipides dans la cellule leucémique.

19

MATERIEL ET METHODES

Nous décrirons séparément les méthodes expérimentales suivies dans l'étude du foie et celle de la leucémie murine et nous réunirons en fin de chapitre les méthodes communes aux deux systèmes expérimentaux.

I - METHODES APPLIQUEES A L'ETUDE DE L'EFFET DE L'AC-3579 SUR LE FOIE DU RAT

1. Animaux et traitement

Les rats utilisés dans ces expériences appartiennent à la race Sprague-Dawley et pèsent de 100 à 150 gr. L'AC-3579, suspendu dans l'eau distillée, est administré par intubation gastrique. Chaque animal reçoit quotidiennement 500 mg de médicament par kg de poids corporel. On donne aux animaux

témoins un volume équivalent d'eau distillée. Les rats sont sacrifiés huit jours après le début du traitement.

2. Mesure de la synthèse de la phosphatidylcholine

Le précurseur utilisé est la L-( C) méthionine, (Radio- 14 chemical Centre, Amersham, Grande-Bretagne) d'une activité spécifique de 50 mCi/mmole. Les rats sont sacrifiés 1 heure ou 3 heures après l'injection intrapéritonéale de 1 pCi de L-( C) méthionine par animal. Les foies sont prélevés et 14

homogénéisés à 0°C dans 4 volumes d'une solution de NaCl 0,9 %

à l'aide d'un appareil de Potter-Elvehjem.

Les phospholipides sont extraits en mélangeant vigoureusement 1 ml d'homogénat à 10 ml de chloroforme-méthanol 2 : 1 (V/V).

Après purification de la phosphatidylcholine par chromatographie, sa concentration et sa radioactivité sont mesurées suivant les méthodes décrites plus loin.

3. Marquage des phospholipides par l'orthophosphate P et 32 préparation de l'homogénat de foie.

L'orthophosphate P est fourni par l'Institut National 3 2 des Radioéléments (Mol) sous la forme d'une solution dans le sérum physiologique.

Pour marquer les phospholipides du foie, on injecte 250 jiCi de précurseur radioactif dans la cavité péritonéale du rat.

Seize à dix-huit heures après l'injection, l'animal est tué par décapitation. Le foie est rapidement prélevé et homogénéisé à 0®C à l'aide d'un appareil de Potter-Elvehjem dans 4 volumes d'une solution 0,25 M de saccharose dissous dans le tampon

utilisé pour mesurer 1 ' activité des phospholipases. L'homogénat est soit utilisé immédiatement, soit conservé à 0®C pendant 3 heures, temps nécessaire au dosage des phospholipides.

4. Fractionnement subcellulaire du foie

Pour étudier la répartition subcellulaire des phospholi­

pases endogènes, nous avons fractionné le foie suivant la mé­

thode de de Duve et coll. (1955). Environ 6 g de foie sont homogénéisés dans une solution de saccharose (0,25 M) et d'EDTA (2 mM), comme décrit précédemment.

20

21

Les différents composants cellulaires sont séparés par centri­

fugation différentielle. Toutes les manipulations se font à 0 - 4°C. L'homogénat est centrifugé à 500 xg pendant 11,5 min­

utes dans une centrifugeuse International. Le culot est lavé dans 25 ml du milieu d'homogénéisation, les surnageants sont réunis et centrifugés à 40.000 xg pendant 6,7 minutes dans une ultra-centrifugeuse Spinco L2-65B en utilisant le rotor angulaire type 65. On obtient un culot brun recouvert d'une couche gris clair (la fluffy-layer). Le surnageant est centrifugé à

100.000 xg pendant 30 minutes pour obtenir la sédimentation des microsomes. La fluffy-layer et les culots obtenus par les centri­

fugations à 500 xg, 40.000 xg et 100.000 xg sont suspendus dans un tampon TRIS-HCl 20 mM (pH 7,4), KCl 0,8 %.

5. Mesure de l'activité des phospholipases

L'activité enzymatique est mesurée à 30sous agitation constante dans 2 ml de tampon dont la composition varie suivant le type d'activité enzymatique mesurée.

a) L'activité de la phospholipase A endogène est mesurée dans un tampon TRIS-HCl 0,06 M, CaCl 2 0,01 M à pH 8,5. L'incuba­

tion dure 180 minutes (sauf indication contraire).

b) L'activité de la phospholipase A2 exogène (Vipera russelli) est mesurée dans un tampon acétate 0,06 M, CaCl 2 0,01 M à pH 5. On ajoute 2 pg d'enzyme par mg de phospholipides.

L'incubation dure 30 minutes.

c) L'activité de la phospholipase C exogène (Clostridium welchii) est mesurée dans un tampon TRIS-HCl 5 mM, CaCl 2

1 mM, à pH 7,4. On ajoute 8 ^g d'enzyme par mg de phospho­

lipides. Le temps d'incubation est également de 30 minutes.

22

Toutes les mesures de réactions enzymatiques débutent par l'addition de 0,25 ml d'homogénat de foie. Néanmoins, comme la concentration des phopholipides du foie double lors du traitement par l'AC-3579, le volume d'homogénat est ajusté de manière à ajouter la même quantité de phospholipides dans les expériences comparant le foie de rat traité et celui de témoin. On interrompt la réaction en ajoutant 10 ml de chloro- forme-méthanol 2 ; 1 (V/V).

6. Extraction et séparation des phospholipides

L'addition du chloroforme-méthanol aux homogénats permet l'extraction des phospholipides à la température ambiante.

Après une agitation vigoureuse, on laisse reposer pendant

12 heures. Le système montre alors une séparation en 2 phases : une phase supérieure (polaire) et une phase inférieure (apolaire).

Après élimination de la phase supérieure, la phase inférieure contenant les lipides est lavée en ajoutant un mélange chloro- forme-méthanol-eau 3 ; 48 : 47 (V/V/V) ("phase supérieure

théorique") dont la quantité est ajustée de manière telle que le volume total du système biphasique soit de 12 ml. Lors de chaque lavage, la phase supérieure est remplacée par une solu­

tion fraîche (Folch et coll., 1957).

Après 3 lavages, on porte à 10 ml le volume de la phase

inférieure et on y prélève des échantillons pour mesurer la

radioactivité des phospholipides totaux. Un autre volume de

3 à 4 ml de la phase inférieure est séché sous vide ou sous

courant d'azote.

23

Les lipides sont redissous dans 0,1 ml de chloroforme-

méthanol 2 : 1 (V/V) et la solution est déposée à l'aide d'une micropipette sur une couche mince de Silica gel (Merck). La chromatographie ascendante unidimensionnelle est développée par un mélange chloroforme-méthanol-eau 65 : 25 : 4 (V/V/V).

Après évaporation du solvant, les plaques sont exposées aux vapeurs d'iode pour localiser les phospholipides. Le Silica gel correspondant aux taches de phosphatidylcholine et de phosphatidyléthanolamine est recueilli dans des tubes et

mélangé à 9 ml du mélange chloroforme-méthanol-eau 65 ; 25 ; 4 (V/V/V). Après une agitation vigoureuse, le solvant contenant les phospholipides individuels est séparé du Silica gel par centrifugation, recueilli dans des fioles à scintillations et séché sous vide.

II - METHODES APPLIQUEES A L'ETUDE DE L'EFFET DE L'AC-3579 SUR LA LEUCEMIE P 388

1. Tumeur et animaux

La leucémie P 388, provoquée à l'origine par le badigeon­

nage de la peau de souris DBA/2 à l'aide de méthylcholanthrène, est maintenue in vivo dans la cavité péritonéale de souris DBA/2 par passages successifs tous les 7 jours. Le liquide d'ascite leucémique prélevé chez une souris malade est réinjecté à des souris saines par la méthode suivante. Une souris DBA/2 porteuse de cellules leucémiques est sacrifiée par dislocation cervicale.

Le liquide d'ascite est prélevé stérilement de la cavité péri­

tonéale à l'aide d'une seringue et conservé dans la glace.

24

Sa concentration cellulaire est déterminée par comptage des cellules dans un hémocytomètre. Il est alors dilué dans une

*

solution stérile de NaCl (0,9 %) à 0°C de manière à obtenir 7

une concentration de 10 cellules par ml. On injecte 0,1 ml de cette suspension (10^ cellules) dans la cavité péritonéale de souris saines. Pour étudier l'effet de l'AC-3579 sur le métabolisme des phospholipides dans les cellules P 388 nous avons inoculé la leucémie à des souris mâles CDF^^ où la tumeur se développe aisément.

2. Mesure de l'incorporation de l'orthophosphate P dans les 32 phospholipides de la cellule P 388

Pour obtenir une quantité suffisante de cellules, on uti­

lise par expérience 13 souris portant la leucémie P 388. Six jours après l'inoculation de la leucémie et une heure avant le sacrifice, chaque souris reçoit par injection intrapéritonéale 96 ^iCi d'orthophosphate- P en solution dans du sérum physio­ 32

logique (Institut National des Radioéléments, Fleurus).

Une suspension de cellules leucémiques est préparée à 0°C de la manière suivante. On obtient le liquide d'ascite par lavage des cavités péritonéales avec 1 ml de milieu de culture RPMI 1640 et on le centrifuge à 200 xg pendant 5 min. Après

2 lavages par 10 ml de milieu RPMI 1640, le culot est suspendu

dans 3-4 ml du même milieu et dilué dans du milieu RPMI 1640

contenant l'AC-3579 en solution, de manière à obtenir une

concentration de 3.10 cellules par ml. 7

Parallèlement, on prépare une suspension de cellules témoins

25

dans le milieu de culture sans AC-3579. Des échantillons de 1 ml de ces suspensions sont prélevés avant l'incubation et mélangés par agitation vigoureuse à 10 ml de chloroforme-

méthanol 2 : 1 (V/V) (temps zéro). Les suspensions cellulaires sont ensuite incubées en agitant dans un bain thermostatisé à 37®C. Après 30, 60, 120 et 180 minutes d'incubation, des échantillons de 1 ml sont prélevés et mélangés à 10 ml de

chloroforme-méthanol. On ajoute à chaque tube 1 ml de solution de KCl 0,88 % et on laisse se poursuivre pendant 24 heures

l'extraction des lipides à la température du laboratoire.

Les extraits sont lavés 3 fois par la phase supérieure théo­

rique comme décrit précédemment (voir page 22 ). Le volume des phases inférieures est ensuite porté à 10 ml par l'addition de chloroforme-méthanol 2 : 1 (V/V). Pour la détermination de la radioactivité des phospholipides totaux, on prélève 1 ml de chaque extrait lipidique qu'on mélange à 10 ml d'Aquasol (New England Nuclear, Boston, Mass., Etats-Unis). Un second échan­

tillon de 1 ml est séché sous vide pour le dosage des phospho­

lipides. Enfin 3 ml de chaque extrait destinés à la séparation des phospholipides sont séchés et le résidu, redissous dans 0,1 ml de chloroforme-méthanol 2 ; 1 (V/V), est déposé sur une couche mince de silica gel (Mackerey-Nagel, Düren, Allemagne).

Les phospholipides sont séparés par chromatographie ascendante comme décrit précédemment (voir page 23).

Pour déterminer la radioactivité de la phosphatidylcholine et de la phosphatidyléthanolamine, on recueille le silica gel contenant ces phospholipides et on le mélange à 10 ml d'Aquasol et 3 ml d'eau. Après agitation, il se forme un gel dont la radio­

activité peut être mesurée.

26

3. Etude du catabolisme des phospholipides dans la cellule de la leucémie P 388

On inocule la leucémie P 388 à 15 souris CDF^^ 6 jours avant l'expérience. Les phospholipides des cellules sont mar­

qués par une injection intrapéritonéale de 60 ^Ci d'orthophos- phate P par souris 24 heures avant le sacrifice. Après le 32

prélèvement du liquide d'ascite, les cellules leucémiques sont lavées 2 fois à 0®C dans le milieu de culture RPMI 1640 et comptées. On prépare ensuite une suspension de cellules leucé­

miques dans du milieu RPMI 1640 contenant 460 /ag d'AC-3579 par ml. Cette concentration élevée est choisie à dessein pour qu'une quantité suffisante d'AC-3579 pénètre dans les cellules avant que celles-ci soient transférées dans le tampon où on mesure la dégradation des phospholipides. Une suspension cellulaire témoin est préparée dans le milieu sans AC-3579. La concentra-

7

tion de ces suspensions cellulaires est de 3.10 cellules par ml. On incube pendant une heure en agitant à 37®C.

A la fin de l'incubation, les deux suspensions cellulaires sont centrifugées à 200 xg pendant 5 min. et les cellules sont lavées à 4®C dans 10 ml de tampon TRIS-HCl 60 mM (pH 7,5)

contenant du saccharose à une concentration de 0,25 M. On re­

suspend ensuite les 2 culots de cellules dans un volume de tampon calculé de manière à obtenir une concentration cellu-

7

laire de 1,5.10 cellules par ml. Les 2 suspensions cellulaires sont ensuite incubées en agitant dans un bain thermostatisé à 37®C. A des intervalles de 30, 60, 90 et 120 min. des échantil­

lons de 2 ml des suspensions cellulaires sont prélevés et mélan­

gés par agitation vigoureuse à 10 ml de chloroforme-méthanol

2 ; 1 pour interrompre toute réaction enzymatique et extraire

les phospholipides selon la méthode que nous avons détaillée dans la rubrique précédente. Les phospholipides sont purifiés et leur radioactivité est mesurée par les mêmes techniques que celles suivies dans l'étude de l'incorporation de l'orthophos- phate- P. 32

4. Etude de la toxicité in vitro de l'AC-3579 vis-à-vis des cellules P 388

Le principe de ces expériences est de mesurer l'activité antinéoplasique de l'AC-3579 en incubant les cellules leucémi­

ques en présence du médicament avant de les injecter à des souris saines. Si l'AC-3579 rend un certain nombre de cellules incapables de se multiplier dans la cavité péritonéale des souris receveuses, la survie des animaux sera augmentée par rapport à celle de souris témoins recevant le même nombre de cellules non traitées.

En pratique, deux souris DBA/2 portant la leucémie P 388 depuis 7 jours sont sacrifiées. Les cellules leucémiques obte­

nues par ponction du liquide d'ascite sont lavées 2 fois à 0“C dans 10 ml de milieu RPMI 1640. Après comptage, les cellules sont resuspendues dans du milieu RPMI 1640 contenant 50, 100, 200 ou 500 ;ug d'AC-3579 par ml. La concentration cellulaire de

7

ces suspensions est ajustée à 10 cellules par ml.

Après 2 heures d'incubation à 37®C (sauf indication contrai­

re) sous agitation, les suspensions cellulaires sont centrifu­

gées à 200 xg pendant 5 min. Les culots sont suspendus dans une solution saline de Hanks (J. Banks et R. Wallace, 1949) dont le volume est calculé pour obtenir une concentration de 10 cellules par ml. 7

27

Au cours des manipulations, les précautions de stérilité sont prises pour éviter la contamination microbienne des sus­

pensions de cellules leucémiques.

On injecte 0,1 ml de suspension (10^ cellules) dans la cavité péritonéale de souris CDF^. Pour chaque concentration d'AC-3579, on utilise un groupe de 8 souris. Les animaux sont examinés chaque jour pour dénombrer les souris tuées par la leucémie. La survie du groupe est exprimée par la survie médi­

ane, c'est-à-dire le jour de la mort de l'animal médian corrigé par un facteur tenant compte de la dispersion des morts au

cours du temps. On utilise la formule suivante : survie médiane = L + J/fM

(G. Atassi, communication personnelle).

L est calculé en ajoutant 0,5 au nombre de jours pendant les­

quels survit l'animal médian.

J = nombre de souris du groupe divisé par 2, moins le nombre de souris mortes avant le jour du décès de l'animal médian.

fM = nombre d'animaux morts le jour du décès de la souris médiane.

III - MATERIEL ET METHODES COMMUNS AUX DEUX SYSTEMES EXPERI­

MENTAUX

1. Mesure de la radioactivité

Pour la mesure de la radioactivité de résidus secs, nous avons utilisé comme liquide scintillant une solution contenant 4 gr de 2,5-diphenyloxazole et 0,1 gr de 1,4-bis-[ 2 -(5-phenyl- oxazolyl)] -benzène par litre de toluène.

28

La radioactivité est mesurée dans des compteurs de scintil­

29

lations liquides de marque Amersham Searle (Arlington Heights, I 11., Etats-Unis). L'efficience du comptage est évaluée par la méthode du standard interne.

2. Dosages biochimiques

Le phosphore est dosé par la méthode de Fiske et Subbarow (1925) et la quantité de phospholipides correspondante est cal­

culée en multipliant par 25 le résultat du dosage. Les protéines sont dosées par la méthode de Lowry (1951).

3. Réactifs

L'AC-3579 est synthétisé dans les laboratoires A. Chris- tiaens (Bruxelles).

La phospholipase du venin de Vipera russelli et la phospholipase C de Clostridium welchii proviennent de la firme Sigma (Saint-Louis, Mo, Etats-Unis). Cette firme nous a égale­

ment fourni le tampon TRIS tris(hydroxymethyl)-aminométhanel.

Le milieu de culture RPMI 1640 est préparé par la firme Gibco (Paisley, Ecosse).

Le 2,5-diphenyloxazole et le 1,4-bis-|^2-( 5-phenyloxazolyl) benzène sont vendus sous les noms respectifs de PPO et POPOP par la firme Packard Inst. (Downers Grove, 111., Etats-Unis).

L'Aquasol est un liquide scintillant prêt à l'emploi pro­

duit par la firme New England Nuclear (Boston, Mass., Etats- Unis) .

Les autres réactifs proviennent de la firme Merck

(Darmstadt, Allemagne).

30

RESULTATS

I - EFFETS DE L'AC-3579 SUR LES PHOSPHOLIPIDES HEPATIQUES

Synthèse de la phosphatidylcholine

Le Tableau 1 montre que la quantité de radioactivité incor porée dans la phosphatidylcholine du foie après injection de

[^14cj-méthionine n'est pas supérieure chez les rats traités par l'AC-3579 comparés aux témoins.

La radioactivité spécifique plus faible de la phosphatidyl choline chez les animaux traités provient du fait que dans le

foie de ces derniers la concentration de phosphatidylcholine est 1,4 fois plus élevée que dans le foie témoin.

Hydrolyse des phospholipides hépatiques

Nous avons étudié l'hydrolyse des phospholipides totaux et celle des 2 phospholipides majeurs du foie, la phosphati­

dylcholine et la phosphatidyléthanolamine qui représentent respectivement 60% et 20% des phospholipides totaux du foie.

1. Phospholipases endogènes

a) Caractérisation de^ activités en£ymati£ues_présentes_

dans_le ^oie_normal

- Dans nos conditions expérimentales, nous avons observé l'activité in vitro de deux phospholipases distinctes :

une phospholipase A et une lysophospholipase.

La phospholipase A hydrolyse une liaison ester entre

le glycérol et un acide gras :

phosphatidyléthanolamine ^ lysophosphatidyl éthanolamine + 1 acide gras.

phosphatidylcholine Phospholipase lysophosphatidyl choline + 1 acide gras.

Les lysophospholipides apparaissant au cours de l'incuba­

tion sont solubles dans la phase inférieure de la parti­

tion de Folch (phase apolaire contenant les phospholipides totaux) et sont mis en évidence après séparation des

phospholipides par chromatographie.

L'hydrolyse par la phospholipase A des phospholipides marques par l'orthophosphate- P ne modifie donc pas 32

la radioactivité de la phase apolaire. Par contre, l'acti­

vité des lysophospholipases qui hydrolysent le lien ester entre le glycérol et l'acide gras des lysophos­

pholipides explique la décroissance observée

lysophosphatidyléthanolamine lysopho^hoj.ipase^ glycéro- phosphoryléthanolamine + 1 acide gras

lysophosphatidylcholine lysophospholipas^^i phosphorylcholine + 1 acide gras.

Les esters d'acide glycérophosphorique radioactifs sont éliminés de la phase apolaire lors des lavages.

L'étude de l'hydrolyse des phospholipides dans des milieux de pH différents montre que l'activité de la phospholipase A est maximale à pH 8,5 (Figure 7).

Le tableau 2 donne la distribution subcellulaire de l'activité de la phospholipase A mesurée à pH 8,5. La comparaison des vitesses d'hydrolyse mesurées dans les différentes fractions est possible car la radioactivité spécifique des phospholipides varie peu d'une fraction

31

à l'autre. L'activité de la phospholipase A est la plus élevée dans le culot P (100.000 x g) qui contient les fragments du réticulum endoplasmique. L'enrichissement par rapport à l'homogénat total est de 6,7 fois quand on considère l'hydrolyse de la phosphatidylchollne et de 15 fois quand on considère celle de la phosphatidyl- êthanolamine.

b) Ef^et de_l_^AC-^529_sur_la phospholipase A endopène_

- La figure 8 compare l'hydrolyse in vitro des phospholi­

pides des foies de rats traités et témoins. L'hydrolyse dans l'homogénat de foie d'animal traité est significati­

vement plus lente, que ce soit au niveau des phospholipides totaux, de la phosphatidylchollne ou de la phosphatidyl- éthanolamine. Comme la concentration des phospholipides est plus élevée (environ le double) dans le foie de rat traité par l'AC-3579, nous avons également mesuré l'acti­

vité de la phospholipase A endogène en veillant que chaque série de tubes contienne une quantité équivalente de

phospholipides. Dans cette série d'expériences, l'hydro­

lyse des phospholipides est également moins rapide dans l'homogénat de foie provenant d'animaux traités que dans l'homogénat témoin.

- Par contre la présence de 100 jug d'AC-3579 par ml dans les incubations d'un homogénat de foie provenant d'ani­

maux non traités n'affecte pas l'hydrolyse des phospho­

lipides totaux, ni celle des deux phospholipides majeurs (Figure 9).

32

33

- De même la vitesse d'hydrolyse des phospholipides d'un foie normal n'est pas affectée par l'addition d'homogénat de tissus hépatique provenant de rats traités par l'AC-3579 (Figure 10).

2. Phospholipase A2 exogène

Nous avons mesuré l'activité de la phospholipase A2 exogène à pH 5 en présence d'ions Ca^^ car dans ces conditions nous avons montré que les phospholipases endogènes ne sont pas actives (Figure 7).

Comme le montre la figure 11, la phospholipase A2 exogène hydrolyse plus lentement les phospholipides totaux, la phosphatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine dans un homogénat de foie provenant de rats traités.

Le test de Student portant sur les quantités moyennes de phospholipides non hydrolysés montre que la différence

observée entre foies traités et foies témoins est significa tive à 2% pour les phospholipides totaux et à

pour la phosphatidylcholine et la phosphatidyléthanolamine.

- Par contre, l'hydrolyse dans 1'homogénat de foie normal des phospholipides totaux, de la phosphatidylcholine et de la phosphatidyléthanolamine n'est affectée ni par

l'addition de 100 ;ag d'AC-3579 par ml (figure 12), ni par celle d'homogénat provenant de foie d'animal traité

(figure 13) .

- En résumé, les phospholipides hépatiques des rats traités par l'AC-3579 semblent plus résistants à l'hydrolyse par les phospholipases A endogène ou exogène.

3. Phospholipase C exogène

La figure 14 montre que l'hydrolyse des phospholipides par la phospholipase C se poursuit à la même vitesse dans les homogénats de foies provenant d'animaux traités et témoins.

34

II - EFFET IN V itro

L'AC-3579

LEUCEMIE P 388

1. Cytotoxicité

Le tableau 3 donne la survie médiane des souris qui ont reçu une inoculation de 10^ cellules leucémiques traitées au préalable par des quantités croissantes d'AC-3579.

Les animaux témoins ont une survie médiane de 10 à 12 jours.

Identique à celle donnée dans la littérature[cancer Chemother.

Rep., part 3,3 : 9 (1972)j . On peut donc en conclure que les cellules leucémiques non traitées par l'AC-3579 ne souffrent pas des manipulations subies avant leur réinjection.

Le traitement in vitro des cellules leucémiques par l'AC-3579 prolonge la survie médiane des souris-hôtes.

L'augmentation de la survie est fonction de la concentration d'AC-3579 et du temps d'incubation. Pour une incubation

de 2 heures, l'augmentation de survie va de 24% pour une

concentration de 50 ^g/ml à 246% pour une concentration

de 500 pg/ml.

35

La survie n'est augmentée que de 27% quand on incube les cellules 1 heure en présence de 500 d'AC-3579 par ml.

A 0°C, la cytotoxicité de 1' AC-3579 in vitro est réduite environ 10 fois.

2. Métabolisme des phospholipides a) Synthèse_

- En incubant des cellules leucémiques prélevées chez les souris 1 heure après l'injection d'orthophosphate- 32 P nous avons observé pendant les 3 heures d'incubation une augmentation de la radioactivité spécifique des

phospholipides due à l'incorporation du précurseur radioactif (Figure 15). Durant les 2 premières heures, le phénomène est pratiquement linéaire. La figure 16 montre que L'incorporation du précurseur dans la phos- phatidylcholine est plus rapide que dans la phospha- tidyléthanolamine.

- La présence de 75 /ig d'AC-3579 par ml stimule l'incor- poration de l'orthophosphate- P dans les phospholipides 32

(figure 15). Pendant les 2 premières heures d'incuba­

tion, on calcule à partir des droites de régression que la vitesse d'incorporation est de 2318 dpm/mg de phospho lipides/minute dans les cellules traitées et de 1781 dpm/mg de phospholipides/minute dans les cellules témoins. L'AC-3579 augmente donc de 30% la vitesse de synthèse des phospholipides. La différence observée

est statistiquement significative à moins de 5% (Test t)

36

- Si on considère la synthèse des deux phospholipides individuels principaux, phosphatidylcholine et phospha- tidyléthanolamine, on constate que seule la synthèse de la phosphatidylcholine est stimulée (figure 16).

;

Au cours de ces deux premières heures, la vitesse d'in- corporation de l'orthophosphate- P dans ce phospholipide 32

7

est de 244 dpm/min.lO cellules pour les cellules trai- 7

tées et 190 dpm/10 cellules pour les cellules témoins, soit une augmentation de 28%. La différence est statis­

tiquement significative à moins de 2%.

Par contre, la synthèse de la phosphatidyléthanolamine n'est pas affectée par l'AC-3579.

b) Catabo^i^e

- Quand on incube dans un milieu isotonique tamponné à pH 7,5 des cellules leucémiques dont les phospholi­

pides ont été marqués par une injection d'orthophosphate- 32 P 24 heures avant le sacrifice, l'hydrolyse des phos- .■

pholipides peut être observée (figure 17). En 2 heures, 35% des phospholipides totaux sont hydrolysés. On observe une hydrolyse de 25% de la phosphatidylcholine et de

30% de la phosphatidyléthanolamine.

Il n'y a pas d'augmentation significative des lysophospho lipides au cours de l'incubation.

La préincubation des cellules en présence de 460 fig d'AC-3579 par ml n'affecte pas la vitesse d'hydrolyse des phospholipides mesurée dans nos conditions expéri­

mentales.

TABLEAU 1 - INCORPORATION DU METHYLE DE LA METHIONINE DANS LA PHOSPHATIDYLCHOLINE DU FOIE DE RATS TRAITES PAR L'AC-3579

ANIMAUX TRAITES ANIMAUX TEMOINS TEST DE STUDENT

Protéines (mg/g tissus frais) 218,1 + 16,5* 218,7 + 13,5 NS

Phosphatidylcholine (mg/g tissus frais) 14,1 + 2,0 10,6 + 1,2 p<0,001

Radioactivité de la phosphatidylcholine cpm/mg de phosphatidylcholine

(1 heure)

863 + 312 1271 + 185 NS

Radioactivité de la phosphatidylcholine cpm/mg de phosphatidylcholine

(3 heures)

1024 + 272 1136 + 109 NS

Les rats traités ont reçu une dose quotidienne de 500 mg d'AC-3579 par kg pendant 8 jours.

Les groupes d'an|j[iaux traités et témoins se composent chacun de 12 rats.

La quantité de [ cj méthionine injectée est de 1 yuCi par rat.

Six animaux de chaque groupe sont sacrifiés 1 heure et 3 heures après l'injection,du précurseur marqué.

*Moyenne + écart-type NS ; Non significatif

G)

TABLEAU 2 - DISTRIBUTION SUBCELLULAIRE DE L'ACTIVITE DE LA PHOSPHOLIPASE A ENDOGENE DANS LE FOIE DE RAT

Fractions Protéine mg/ml de fraction

Phospholipides mg/ml de fraction

Radioactivité Activité de la spécifique cpm/mg phospholipase sur

phospholipides la phosphatidyl- totaux choline

Enrichissement

Activité de la phospholipase sur la phosphatidyl-

éthanolamine

Enrichissemen

Homogênat total

H 38,4 4,75 7598 1,0 - 2,2

Culot 500 g

N 19,5 3,13 8201 1,1 1,1 3,8 1,7

Fluffy-layer 40.000 g

FL 8,6 2,26 7663 3,1 3,1 11,9 5,4

Culot 40.000 g

ML 25,9 4,52 9612 1,2 1,2 3,8 1,7

Culot 100.000 g

P 3,38 1,02 6618 6,7 6,7 32,5 14,8

Les fractions sont obtenues en suivant la méthode décrite dans le chapitre MATERIEL ET METHODES .

L'activité de la phospholipase est exprimée en % de phospholipide hydrolysé par heure et mg de protéines.

L'enrichissement est le rapport activité dans la fraction considérée/activité dans l'homogénat total.

G)

00

TABLEAU 3 - MESURE DE LA TOXICITE IN VITRO DE L'AC-3579 VIS-A-VIS DES CELLULES LEUCEMIQUES P 388 PAR LA SURVIE DES SOURIS RECEVANT UNE GREFFE DE CELLULES LEUCEMIQUES TRAITEES

Concentration de l'AC-3579

(;jg/ml)

Temps d'incubation (heures)

Température du milieu d'incubation

Survie médiane (jours)

T/C

%

Nombre de souris survivant plus

de 60 jours

0 2 37°C 10,4 (a) - 12,4 (b)

0

50 2 37®C 12,9 (a) 124 0

100 2 37°C 17,8 (b) 144 0

200 2 37°C 28,0 (b) 226 1

500 2 37°C 36,0 (a) 346 4

500 1 37°C 15,7 (b) 127 0

500 2 0°C 13,1 (a) 126 0

Le liquide d'ascite contenant les cellules P 388 provient d'une souris DBA/2 qui a reçu 7 jours auparavant une injection intrapéritonéale de 10^ cellules leucémiques. Les cellules leucémiques sont récoltées, lavées à 0°C dans le milieu RPMI

1640 et ensuite suspendues dans le même milieu contenant des concentrations croissantes d'AC-3579. Après l'incubation dans les conditions indiquées, on a centrifugé la suspension cellulaire et on a suspendu les cellules dans le milieu salin de Hanks (10^ cellules/ml). Chaque souris a reçu 0,1 ml (10^ cellules) par injection intrapéritonéale. Les groupes expérimentaux comprennent chacun 8 animaux.

Les indices a et b signifient que les données proviennent d'expériences distinctes.

T/C : rapport des survies médianes des souris portant les cellules traitées et témoins.

Q

(O

40

Fig. 1 - AC-3579 : 2-N-méthylpipérazino-méthyl-l,3-diazafluoranthène

1-oxyde (masse molaire : 332,2)

41

Fig. 2 - Hépatocyte de rat témoin (x 24.000)

42

Fig 3 - Hépatocyte après 4 jours de traitement par AC-3579 (500 mg/kg.jour).

Le réticulum endoplasmique hypertrophié prend une conformation spi­

ralée ( X 20.000).

43

Fig. 4 - Hépatocyte après 8 jours de traitement par AC-3579

(500 mg/kg,jour). On aperçoit de nombreuses figures

pseudo-myêliniques (flèches) ( x 20.000).

44

Fig 5 - Cellule leucémique P 388 maintenue pendant 120 minutes dans le

milieu de culture 199 ( x 17.500).

45

Fig 6 - Cellule leucémique P 388 maintenue pendant 30 min. dans le milieu de culture 199 contenant 100 pg d'AC-3579 par ml. On observe des vacuoles cytoplasmiques dont certaines contiennent des structures

lamellaires (flèche) ( x 19.000).

46

Temps d'incubation (min)

Fig. 7 - Effet du pH sur l'hydrolyse par les phospholipases endogènes des phospholipides du foie in vitro. La radioactivité des phospholi­

pides est exprimée en % de la radioactivité mesurée au temps 0 (début de 1'incubation).

Signification des symboles : 0 = phospholipides totaux;

□ = phosphatidylcholine; = phosphatidyléthanolamine.

Chaque symbole représente la moyenne de 2 échantillons.

Les conditions de l'incubation sont données dans les "Matériels et

Méthodes".

47

Temps d'incubation (min)

Fig. 8 - Hydrolyse in vitro par les phospholipases endogènes des phospholi­

pides du foie de rat traité par 1'AC-3579(500 mg/kg par jour pendant 8 jours). La radioactivité des phospholipides est exprimée en % de la radioactivité mesurée au temps 0 (début d’incubation).

Signification des symboles : # , O = phospholipides totaux;

■, □ = phosphatidylcholine;^ = phosphatidyléthanolamine.

Les symboles pleins se rapportent à l'animal traité et les symboles

vides à l'animal sain. Chaque symbole correspond à la moyenne de

2 échantillons. Les conditions précises de l'incubation sont données

dans le chapitre Matériel et Méthodes .

48

Ftg. 9 - Hydrolyse des phospholipides du foie normal par les phospholipases endogènes en présence d'AC-3579. On incube l’homogénat de foie en presence de 100 /ig d’AC-3579 par ml de milieu d'incubation (barres hachurées) ou dans le tampon exempt d'AC-3579 (barres vides). Les résultats sont la moyenne de 3 échantillons (^écart-type).

Les conditions d'incubation sont détaillées dans Matériel et

Méthodes .

49

Fig. 10 - Effet d’un homogénat de foie provenant d'un rat traité par l'AC-3579 sur l'hydrolyse des phospholipides d'un foie normal par les phospholipases endogènes. Chaque tube contient 80 mg de tissu frais provenant d'un foie normal dont les phospholipides ont été au préalable marqués in vivo. Pour étudier l'effet du foie traité, on introduit 50 mg de foie provenant d'un rat traité par l'AC-3579 (barres hachurées). On ajoute aux échantillons témoins

150 mg de foie provenant d'un animal non traité (barres vides) pour compenser la concentration plus faible des phospholipides dans le foie normal. Les résultats sont la moyenne de 4 échantillons (^écart-type). Les conditions d'incubations sont détaillées dans

Matériel et Méthodes .

50

totaux choline ethanolamine

Fig. 11 - Hydrolyse par la phospholipase A2 exogène des phospholipides d'un foie de rat traité à l'AC-3579 (barres hachurées) comparée à celle d'un foie témoin (barres vides). Chaque tube contient une quantité de foie correspondant à 2,4 mg de phospholipides. Les résultats sont la moyenne de trois échantillons (j^ écart-type). Les condi­

tions d'incubation sont détaillées dans le chapitre Matériel et

Méthodes .

51

Fig. 12 - Hydrolyse des phospholipides du foie normal par la phospholipase A2 exogène en présence d'AC-3579. Chaque tube contient 100 mg de foie.

Pour étudier l'effet de l'AC-3579 in vitro on dissout 100 yug de médicament par ml de milieu d'incubation (barres hachurées).

L'hydrolyse des phospholipides est mesurée dans les mêmes conditions en l'absence d'AC-3579 (barres vides). Les résultats sont la moyenne de 3 échantillons (j+ déviation standard). Les conditions d'incuba­

tion sont détaillées dans le chapitre Matériel et Méthodes .

52

Fig. 13 - Effet d'un homogénat de foie provenant d'un rat traité à l'AC-3579 sur l'hydrolyse des phospholipides d'un foie normal par las phos­

pholipase A2 exogène. Chaque tube contient 80 mg de tissus frais provenant d'un foie normal dont les phospholipides ont été préala­

blement marqués in vivo. L'effet du foie traité est étudié en ajou­

tant à chaque tube 100 mg de foie provenant d'un rat traité par l'AC-3579 (barres hachurées). On ajoute dans les tubes témoins

150 mg de foie provenant d'un animal non traité (barres vides) pour

compenser la concentration plus faible des phospholipides dans le

foie normal. Les résultats sont la moyenne de 4 échantillons

(^ écart-type). Les conditions d'incubation sont détaillées dans

le chapitre Matériel et Méthodes .

53

Fig. 14 - Hydrolyse par la phospholipase C exogène des phospholipides d'un

foie de rat traité par l'AC-3579 (barres hachurées) comparée au

foie témoin (barres vides). La quantité d'homogénat ajoutée à

chaque tube correspond à 2,7 mg de phospholipides. Les résultats

sont la moyenne de 4 échantillons (j^ écart-type). Les conditions

d'incubation sont données dans le chapitre Matériel et Méthodes .

54

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• 32

Fig. 15 - Effet de l'AC-3579 sur l'incorporation de l'orthophosphate P dans les phospholipides totaux des cellules P 388. Les cellules prélevées chez des souris CDFj 1 heure après l'injection intra­

péritonéale de 96 ^CI d'orthophosphate 32p par souris, ont été

maintenues dans le milieu de culture RPMI 1640 contenant 75 p.g

d'AC-3579 par ml (H). Les cellules témoins ont subi les mêmes

manipulations sans AC-3579 (Q). Chaque valeur est la moyenne

de 2 ou 3 mesures.

55

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Fig. 16 - Effet de l'AC-3579 sur l'incorporation de l'orthophosphate P 32 dans les 2 phospholipides majeurs des cellules P 388. Les condi­

tions expérimentales sont les mêmes que celles décrites à la figure 15.

Symboles pleins : cellules traitées, symboles vides : cellules témoins, f, 0, phosphatidylcholine; A, A, phosphatidyléthanolamine.

Chaque valeur est la moyenne de 2 ou 3 mesures.