64
et du temps d'incubation. Tenant compte de la durée du cycle
cellulaire et de la quantité de cellules leucémiques léthale pour les souris-hôte. De Vita (1973) donne la relation entre
la survie de 1'animal et le nombre de cellules leucémiques
capables de se multiplier in vivo. D'après ses données, nous pouvons estimer que, après 2 heures d'incubation en présence de 50 et 100 pg d'AC-3579 par ml, respectivement 10% et 1 %
des cellules leucémiques sont encore capables de survivre chez la souris-hôte.
A partir de 200 ;ug/ml, le nombre de cellules leucémiques se multipliant in vivo est très bas (de l'ordre de 1/10^ cellules) car un certain nombre d'animaux survit à l'inoculation de la leucémie.
La méthode que nous avons choisie pour mesurer la toxicité de
l'AC-3579 est beaucoup plus sensible que le test d'exclusion du bleu trypan car nous avons constaté que 60 % des cellules
excluent encore le colorant après 2 heures d'incubation en présence de 500 pg d'AC-3579 par ml. Hofer (1974), utilisant la leucémie L 1210, a montré la même divergence entre la via bilité donnée par le test du bleu trypan et celle mesurée in vivo.
Dans les conditions expérimentales où l'AC-3579 tue une large proportion des cellules leucémiques, il a peu d'effet
sur le métabolisme des phospholipides puisqu'il produit une faible stimulation de la synthèse de la phosphatidylcholine
65
En deux heures d'incubation dans un milieu où la synthèse des
phospholipides est impossible, 30 % de ce derniers sont hydro- lysés dans les cellules P 388. L'hydrolyse des phospholipides
n'est pas affectée par une préincubation des cellules en pré
sence de 500 d'AC-3579 par ml, bien que dans ces conditions,
les cellules montrent déjà des inclusions lamellaires après
30 minutes d'incubation. Il est donc peu probable que les alté rations morphologiques observées dans les cellules leucémiques proviennent d'une inhibition de l'hydrolyse des phospholipides et que le mécanisme d'action de l'AC-3579 à l'égard de la cel lule P 388 soit analogue à celui démontré dans 1'hépatocyte.
III - CONCLUSIONS
Les résultats obtenus dans cette partie du travail permet tent d'apporter aux deux questions que nous nous sommes posées au début de cette études, les réponses suivantes :
- Dans 1'hépatocyte, l'AC-3579 forme avec les phospholipides des complexes dont la cohésion est assurée par des liaisons hydrophobes. La formation de complexes résistant à l'hydro lyse par la phospholipase A explique le ralentissement du catabolisme des phospholipides qui s'accumulent dans 1'hépa
tocyte sous forme de membranes hypertrophiées.
- L'AC-3579 montre à l'égard de la cellule P 388 un effet cyto toxique qui ne paraît pas lié à l'altération du métabolisme
2ème PARTIE
LA POTENTIALISATION PAR L'AMPHOTERICINE B DE L'EFFET
67
INTRODUCTION
Comparativement à d'autres cancers, peu de progrès ont été
réalisés dans le traitement des tumeurs cérébrales. Walker
(1976), en calculant la fréquence relative des différents types de tumeurs cérébrales, a démontré que 43% de celles-ci sont des
gliomes malins, dont l'issue est toujours fatale après une
survie moyenne de 23 semaines. Bien que l'ablation chirurgicale reste la méthode de choix pour supprimer la majeure partie du tissu tumoral, un traitement post-chirurgical par radiothérapie
et/ou chimiothérapie doit intervenir pour tuer les cellules tumorales qui persistent après l'exérèse.
Dans le traitement des tumeurs cérébrales, les nitrosourées
sont les médicaments qui donnent actuellement les meilleurs résultats. Néanmoins, les études contrôlées comme celles de
l'E.O.R.T.C (1978) ont montré que son efficacité en clinique est plus limitée que le laissaient prévoir les études expéri mentales. En vue d'une chimiothérapie plus efficace des
tumeurs cérébrales, il faut trouver des moyens d'augmenter l'effet thérapeutique du CCNU.
Pour répondre à cette nécessité, nous avons associé 1'amphotéricine B au CCNU, en espérant augmenter son effet
thérapeutique sur 1'épendymoblastome de souris, modèle expé rimental couramment utilisé pour des tumeurs cérébrales
68
L'AMPHOTERICINE B.
L'amphotéricine B est un composé antifongique produit par certaines souches du genre Streptomyces. Utilisé pour traiter des mycoses, ce médicament ne possède pas lui-même d'activité
carcinostatique. Néanmoins, 1'amphotéricine B augmente l'effet d'une série de composés comprenant des agents carcinostatiques.
Structure et propriétés physico-chimiques de 1'amphotéricine B On classe 1'amphotéricine B dans le groupe des polyènes, qui comprend également la filimarisine, la nystatine et d'autres com posés de structure similaire.
L'amphotéricine B a une masse molaire de 960,1. Au point de vue structural, sa molécule se compose d'une chaîne de 37 atomes de carbone formant un macrocycle (figure 1). La présence
de 7 doubles liaisons alternant avec des simples liaisons justifie
son appellation de polyène. La molécule d'amphotéricine B possè
de un groupe mycosamine, une fonction carboxyle et 8 fonctions hydroxyles.
La longue chaîne carbonée de la molécule d'amphotéricine B lui confère un caractère hydrophobe. A pH 7, ce polyène est in soluble dans l'eau. Par contre, il est soluble dans le méthanol, le propylène glycol et surtout le diméthylsulfoxide.
Par la présence d'une partie hydrophobe (chaîne carbonée) et d'une partie hydrophile (carboxyle et mycosamine), la molécule
d'amphotéricine B rappelle celle d'un phospholipide (C.E. Andreoli, 1973). Cette similitude pourrait expliquer l'affinité particu
69
Effet de 1'amphotëricine B sur la perméabilité cellulaire
L'amphotéricine B se combine avec les stérols libres
{A.VI.
Norman et coll., 1972) ou intégrés dans des membranes artificiel les. La formation de complexes entre 1'amphotéricine B et les
stérols est responsable d'une augmentation de la perméabilité des membranes traitées par 1'amphotéricine B. On a en effet ob
servé qu'elle diminue la résistance électrique des membranes
artificielles planes constituées de phospholipides et de choles térol (V.W. Dennis, 1970). Elle augmente également la perméabilité
des membranes artificielles planes (C.E. Andreoli, 1973) et celle des liposomes (M.A. Singer, 1975; M.P.N. Gent, 1976) aux solutés de faible poids moléculaire. Partant de ces observations,
Andreoli (1973), de Kruijff (1974) et Van Hoogevest (1978) sug gèrent que 1'amphotéricine B forme avec les stérols des pores
permettant le passage d'ions et de molécules plus petites que celle du saccharose. Ces auteurs ont proposé des modèles molé culaires de ces pores.
Comme l'a démontré Deuticke (1973), 1'amphotéricine B aug mente également la perméabilité de la membrane plasmatique. Les érythrocytes traités par 1'amphotéricine B deviennent plus per méables aux anions, aux cations et aux solutés non ionisables. L'effet du polyène sur les érythrocytes devient négligeable lors que ceux-ci sont appauvris en cholestérol.
On considère que l'augmentation de perméabilité produite par 1'amphotéricine B est responsable de sa cytotoxicité. En effet, 1'amphotéricine B provoque la mort des cellules d'eucaryote
(et particulièrement de champignons), mais est dépouvue de toxi cité vis-à-vis des bactéries dont la membrane ne contient pas
70
On admet généralement que la potentialisation par l'amphoté- ricine B d'une série d'inhibiteurs provient d'une perméabi lité cellulaire accrue à ces derniers.
En effet, J. Medoff (1975) a montré que 1'amphotéricine B faci
lite la pénétration de 1'actinomycine D dans les cellules HéLa. Dans les conditions où elle n'affecte pas le métabolisme cellu
laire, 1 'amphotéricine B augmente également l'action de l'CX,- amanitine (M. Kuwano et coll., 1973-a), de l'acide fusidique
(M. Kuwano et coll., 1973-b), de la 5-fluorocytosine (A. Polak, 1978), de la rifamycine et de ses dérivés (A.J. Racket, 1972; G. Medoff, 1974-a). Une des substances dont l'activité est aug
mentée par 1'amphotéricine B a particulièrement retenu notre
attention, il s'agit du BCNU, nitrosourée carcinostatique voisine du CCNU. L'observation que 1'amphotéricine B accroît l'efficacité thérapeutique du BCNU vis-à-vis de la leucémie AKR (G. Medoff et coll. 1974-b et 1977) permet d'envisager une éventuelle potentia
71
LA l-(2-CHL0R0ETHYL)-3-CYCLOHEXYL-l-NITROSOUREE (CCNü)
Le CCNU (Lomustine) est une des 250 nitrosourées dont l'Ins
titut National Américain du Cancer a examiné l'activité carcino-
statique. C'est un des rares composés actifs sur les tumeurs cérébrales expérimentales : leucémie murine L1210 injectée dans le cerveau (F.M. Schabel et coll., 1976), gliomes de la souris
(V.A. Levin et coll., 1970) et du rat (H. Waldbaur et coll.,
1978). En raison de son aptitude à traverser la barrière hémato méningée, ce médicament est, depuis 1969, utilisé en clinique dans le traitement des tumeurs cérébrales.
Depuis son introduction en clinique, on a essayé d'élucider le mécanisme de la toxicité du CCNU vis-à-vis des cellules saines et tumorales. Bien que le mode d'action reste encore controversé,
les données expérimentales permettent de supposer que la cyto toxicité du CCNU est due à la réactivité de certains de ses pro duits de dégradation. Nous résumons certaines propriétés chimi ques du CCNU qu'il est indispensable de connaître pour comprendre l'effet du CCNU sur la cellule.
Propriétés chimiques du CCNU
Le CCNU est unenitrosourée de masse molaire égale à 233,7 substituée en position 1 par un groupe chloroéthyle et en posi tion 3 par un groupe cyclohexyle. Il est représenté à la figure 2 avec 2 composés carcinostatiques de structure voisine et de propriétés chimiques similaires : le BCNU et le méthyl-CCNU.
72
En milieu aqueux, le CCNU a une demi-vie d'environ 1 heure
(G.P. Wheeler et coll., 1974-b). En séparant et en identifiant les produits de dégradation, Reed (1975 et Colvin (1976) ont pu
établir une séquence probable des réactions de décomposition
(figure 19). Par suite de la réaction de la fonction nitroso-et
d'une fonction amine avec les ions hydroxyles, il y a rupture
du lien amide 1-2, avec apparition d'isocyanate de cyclohexyle (I) et d'hydroxyde de chloroéthyldiazène (II). Ce dernier, très instable, donne du chlorure de vinyle (III) ou des ions chloro- éthylcarbonium (IV) réagissant immédiatement avec les ions hydro
xyles pour former du chloroéthanol. Lorsque les ions chloroéthyl carbonium apparaissent au voisinage de molécules d'acide nuclé
ique ou de protéines, ils se fixent aux sites nucléophiles par réaction d'alkylation. D'autre part, l'isocyanate de cyclohexyle réagit par carbamoylation avec les fonctions amines des protéines
L'effet du CCNU sur la cellule saine ou tumorale peut donc
être dû à des produits distincts de décomposition et impliquer des réactions chimiques et des molécules-cibles différentes. Les altérations cellulaires provoquées par le CCNU et d'autres nitrosourées seront détaillées dais le cadre de notre discussion
73
BUT DU TRAVAIL
Etablir une éventuelle potentialisation, par l'amphoté-
ricine B, de l'effet du CCNU sur 1'épendymoblastome de
souris.
Essayer de comprendre le mécanisme d'une telle potentia lisation en étudiant l'effet de 1'amphotéricine B sur la
pénétration intracellulaire du CCNU et de ses produits de décomposition, ainsi que leurs effets sur le métabolisme cellulaire de 1'épendymoblastome de souris.
74
MATERIEL ET METHODES
I - ANIMAUX
Nous avons utilisé au cours de ce travail des souris
mâles de race C57B1 ou C57B1 X DBA2F1. Les animaux proviennent
des Laboratoires Charles River (Wilnington, Mass
.,
Etats-Unis).II - TUMEUR
L'épendymoblastome est une tumeur solide provoquée initiale ment chez la souris C57B1 par l'implantation intracérébrale d'un
fragment de méthylcholanthrène (H.M. Zimmerman et coll., 1941)
et conservée in vivo par transplantations successives dans les souris C57B1. Les animaux portant la tumeur sous-cutanée provien nent des Laboratoires Hazleton (Vienna, Va., Etats-Unis)
ou Arthur D. Little (Cambridge, Mass., Etats-Unis).
1. Transplantation de 1'épendymoblastome
Dans notre laboratoire, l'épendymoblastome est transplanté tous les quinze jours suivant la méthode de Ausman et Shapiro
(1970). Une souris portant un épendymoblastome sous la peau du flanc est sacrifiée. L'animal est disséqué sans détacher
la tumeur de la peau du flanc (figure 3).
La tumeur est débarrassée de sa capsule conjonctive et coupée
en tranches d'environ 1 mm d'épaisseur qui sont placées dans le 3
milieu salin de Hanks. Chaque fragment de 5-10 mm découpé
dans les tranches de tissu, est aspiré dans un trocart de gauge 14 et implanté à l'aide du trocart et de son mandrin sous la peau du flanc droit des souris receveuses.
75
2. Mesure de 1'épendymoblastome
Dix à douze jours après la transplantation, les tumeurs sont mesurées et ensuite les souris réparties de manière à ce
que les tailles des tumeurs soient distribuées de manière com parable dans les groupes d'animaux recevant des traitements différents. Après l'injection des médicaments, les tumeurs
sont mesurées 2 fois par semaine. En assimilant leur forme à celle d'un ellipsoïde de révolution, on calcule leur volume
2
par la formule 471A.B /3 dans laquelle A et B sont respectivement le grand et le petit axe de 1'épendymoblastome.
On considère que les tumeurs ont subi une régression totale lorsqu'elles ont cessé d'être palpables pendant 2 semaines. Une guérison se définit comme une régression totale durant au moins 2 mois.
III - MEDICAMENTS
La 1-(2-chloroéthyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourée, la i- 14
(2-chloroéthyl-U- C)-3-cyclohexyl-l-nitrosourée (12 mCi/mmole) 14
et la 1-(2-chloroéthyl)-3-(cyclohexyl-1- C)-1-nitrosourée
(12 mCi/mmole) proviennent du National Cancer Institute (Bethes-da, Md, Etats-Unis).
La nitrosourée est dlssoite dans l'huile de sésame au maximum
12 heures avant son administration. La solution huileuse est injectée par voie intramusculaire dans la cuisse gauche.
L'isocyanate de cyclohexyle est fourni par la firme Merck- Schuchardt (Hohenbrunn bei München, Allemagne). On prépare une solution extemporanée du produit dans l'huile de sésame et on l'injecte par voie intramusculaire.
L'amphotéricine B provient de la firme E.R. Squibb & Sons
(Princeton, N.J. Etats-Unis). Le médicament est fourni sous
la forme d'un mélange hydrosoluble comprenant 0,8 mg de désoxy-
cholate par mg d'amphotéricine B. Après dissolution dans une
solution de glucose 5 %, le médicament est donné aux souris par injection intrapéritonéale. Les animaux témoins reçoivent une
quantité équivalente de désoxycholate.
L'amphotéricine B tritiée (0,2 Ci/mmole) a été préparée par
l'Institut National des Radioéléments (Fleurus). Immédiatement avant l'injection, le produit marqué est dissous dans une solu tion de glucose 5% contenant 2 mg de désoxycholate par ml.
IV - METHODES BIOCHIMIQUES
Les expériences décrites ci-dessous ont été réalisées sur
les épendymoblastomes sous-cutanés, 12 à 15 jours après leur
transplantation. Le poids des tumeurs utilisées varie de 0. 5 à Ig.
14
1. Pénétration du ( C) CCNU dans 1'épendymoblastome
On injecte par souris 10,4 ^#C!i de CCNU radioactif. Les souris sont sacrifiées après un intervalle de temps variant de 30 min à 30 heures selon l'expérience. Chaque tumeur est pré levée et pesée. Pour la mesure de la radioactivité totale, une
partie de 1'épendymoblastome est traitée par le ^oluène, à rai son de 1 ml par 100 mg de tissus, et porté à 50°C jusqu'à disso
lution complète du tissu. Après refroidissement à température ambiante, le mélange est dilué dans 10 ml de mélange scintillant.
77
Le CCNU et ses dérivés radioactifs sont extraits en mélan
geant vigoureusement la tumeur émincée à 20 ml de chloroforme-
méthanol 2 : 1 (v/v) et en laissant reposer 12 heures à tempé
rature ambiante. L'extrait est filtré et séché sous vide. Le
résidu est redissous dans 10 ml de chloroforme-méthanol 2:1,
qui sont ensuite mélangés par agitation vigoureuse à 2 ml de solution de KCl 0,88% (Folch et coll., 1957). Cette opération
permet de séparer le CCNU qui reste dans la phase inférieure
apolaire de ses produits de décomposition hydrosolubles qui passent dans la phase supérieure polaire. Après séparation des phases à température ambiante, des échantillons de 0,5 ml de chaque phase sont prélevés pour mesurer la radioactivité.
Pour la purification du CCNU par chromatographie sur couche mince, 3 ml de phase inférieure sont séchés sous vide et le ré
sidu, redissous dans 100 ^1 de chloroforme-méthanol 2 : 1 (v/v), est déposé en même temps que 40 ug de CCNU pur sur une couche mince de Silica gel imprégné d'indicateur fluorescent. Les
plaques sont développées par migration ascendante d'un mélange chloroforme-méthanol-eau 65 ; 25 ; 4 (v/v/v). La tache contenant le CCNU radioactif, identifiée sous lumière ultraviolette grâce à la position d'un standard, est grattée et le Silica gel est recueilli dans \ine fiole. La radioactivité du CCNU est mesurée après le mélange de la silice à un gel formé de 3 ml d'eau et 10 ml d'Aquasol.
2. Isolement des membranes plasmatiques de 1'épendymoblastome Toutes les manipulations se font à 0-4°C. La préparation des membranes est réalisée à partir d'environ 8 g de tissu tumoral.
a. Fractionnement_subce^lulaire_
Les épendymoblastomes sont émincés dans 10 vol. d'une solu
tion de NaHCO^ ImM, CaCl2, 0,5 mM tamponnée à pH 7,5 (tampon bicarbonate) et homogénéisés par 20 coups de piston d'un
horaogénéisateur de Dounce (Kontes Glass Co., Vineland, N.J., Etats-Unis).
L'homogénat est filtré à travers 4 couches de gaze et dilué dix fois.
Les différents composants subcellulaires sont séparés par
centrifubation suivant la méthode résumée dans la figure 7. L'homogénat est réparti dans 2 tubes de 0,5 1. et centrifugé
dans une centrifugeuse International à 800 x g pendant 5 minutes. Le surnageant est recueilli dans 8 tubes de 95 ml placés dans un rotor angulaire Spinco modèle 21. Après une centrifugation de 30 min. à 16.000 x g dans une ultra-
centrifugeuse Spinco L2-65B, les culots
P2
sont réunis etsuspendus dans 16 ml de tampon bicarbonate.
La suspension est pesée et mélangée à un poids équivalent d'une solution de saccharose 46 %. Le mélange est étalé à la surface de 4 gradients coTitinus de 26 ml formés par une solution de saccharose dont la densité varie dans chaque gradient de 1, 12 à 1,25. Les gradients sont centrifugés
à 64.000 X g pendant 2 heures dans un rotor SW27 à tubes
oscillants. Après la centrifugation, on distingue dans chaque gradient une bande correspondant à une densité approximative de 1,13 (Fig. 9). Cette fraction du gradient est prélevée à la seringue et mélangée à une solution de saccharose 65 % dont le volume est calculé de manière à obtenir une concentration finale de 45 % (densité = 1,21).
Le mélange est réparti en quantités égales dans 2 tubes et
est recouvert successivement par 8 ml de solution de saccha
rose 41 % (densité = 1,19),
7
ml de solution de saccharose33 % (densité =1,15) et 7 ml de solution de saccharose 23 %
(densité = 1,10).
Les 2 gradients discontinus ainsi préparés sont centrifugés dans le rotor SW 27 à 64.000 x g pendant 12 à 15 heures.
La partie des gradients apparaissant sous la forme d'une
bande à l'interface des densités 1,10 et 1,15 est aspirée à la seringue, diluée environ 5 fois avec du tampon bicar
bonate et centrifugée à 76.000 x g pendant 50 minutes.
Le culot contenant les membranes plasmatiques est suspendu
dans 7 ml de tampon bicarbonate.
b. Di^tribution_subcellulaire_de 1'^£hotéricine B tritiée
Les souris sont sacrifiées 10 heures après l'injection intra péritonéale de 100 ^Ci d'amphotéricine B tritiée par animal.
Les membranes plasmatiques des épendymoblastomes sont puri fiées selon la méthode décrite précédemment.
Deux échantillons de 250 £l de chaque fraction sont traités à 50°C par 1,5 ml de NCS(Nuclear Chicago Solubilizer) jus qu'à complète solubilisation. Après refroidissement, 10 ml
de mélange scintillant sont ajoutés au mélange.
c. Dosages en^ymatic[ues_
Les activités de la 5'-nucléotidase (EC 3.1.3.5), de la phosphodiestérase I (EC 3.1.4.1), de la succinate déshydro- génase (EC 1.3.99.1), de la^ -glucuronidase (EC 3.2.1.31)
et de l'arylesterase (EC 3.1.1.2) mesurées dans
80
l'homogénat d'épendymoblastome ou les différentes fractions subcellulaires immédiatement après la préparation de
celles-ci. Lors de chaque dosage, le volume d'homogénat ou
de fraction où on mesure l'activité enzymatique est ajusté
de manière que l'enzyme soit le facteur limitant de la réac
tion. Les méthodes suivies dans ces dosages enzymatiques ont
été décrites dans la littérature. Nous nous bornerons donc à résumer ci-dessous leurs principes et les modifications éventuellement apportées aux techniques développées par
d'autres auteurs.
“ (Marique et coll., 1973)
La 5'-nucléotidase hydrolyse le lien ester unissant le phosphate au ribose dans 1'adénosine-5'-monophosphate. Pour mesurer l'activité de l'enzyme présent dans 1'épendy
moblastome, on ajoute une quantité de tissu tumoral équi valent à 1,5 mg de protéines à une solution d'adénosine-
5'-monophosphate et on dose par la méthode du Fiske et
Subbarow ( 1925 ), le phosphate libéré au cours d'une heure d'incubation à 37°C. La comparaison avec une solution de phosphate standard permet d'évaluer la quantité de substrat hydrolysé.
“ (Touster et coll., 1970)
On utilise pour mesurer l'activité de la phosphodiestérase I, un substrat synthétique, l'ester p-nitrophényle de la
2'-desoxythymidine-5'-phosphate. Cette enzyme hydrolyse le lien ester reliant le phosphate au p-nitrophénol et libère ce dernier qui peut directement être dosé par colo rimétrie après précipitation par l'acide trichloracétique.
81
L'activité enzymatique est calculée par comparaison à une solution standard de p-nitrophénol. Nous avons modifié la
méthode de Touster en portant le temps d'incubation à 37°C de 10 à 60 minutes.
_^_“2lucuronidase (Michell et coll., 1970)
On mesure l'activité de la /3-glucuronidase sur un substrat synthétique, l'acide 1-p-nitrophényl-/? -D-glucopyranosi-
duronique. La quantité de p-nitrophénol libérée par l'en
zyme après 3 heures d'incubation à 37°C est mesurée par rapport à une solution stahdard.
L'arylestérase hydrolyse le lien ester de l'acétate d'o-nitrophényle. Nous avons mesuré son activité à la
température ambiante à l'aide d'un spectrophotomètre
Beckman modèle 25-K, dans un volume de 2,95 ml de mélange
réactionnel contenant 54 ^oles de KH2PO^ tamponné à pH 7,4
2,7 /amoles d'EDTA, 2,7 ^1 de Triton X-lOO et une quantité de tissu tumoral correspondant à 0,4 mg de protéines. La réaction enzymatique débute par l'addition de 50 ^1 d'une solution d'acétate d'o-nitrophényle 180 itiM dans l'éthanol.
L'absorption de 1'o-nitrophénol libéré à 420 nm est mesurée