Abscisse : intervalle de temps entre l'injection d'uridine tritiée et celle de CCNU. Chaque valeur représente la moyenne des mesures

réalisées chez 8 animaux. La signification statistique (test de

Student) de la différence entre animaux traités par la combinaison

et le CCNU seul est donnée entre parenthèse.

127

Fig. 1

800.

.100 ^,104

600j

_C O U

en 400.

E Ê a "D

l72 ^.74

200.

Oj

20 40 60

Temps (en heures)

80

14

- Effet du CCNU sur l'incorporation de ( C)-leucine dans les proté­

ines de 1'épendymoblastome de souris. Le CCNU est injecté par voie

intramusculaire à raison de 10 mg/kg de poids corporel. Les animaux

sont sacrifiés à différents intervalles de temps apres l'adminis­

tration du médicament et une heure après l'injection intrapérito­

néale de 2,5 ;uCi de (^4c)-leucine par souris. Les mesures corres­

pondant au temps zéro ont été réalisées chez des animaux non traités.

Les chiffres accompagnant les symboles indiquent le pourcentage de

radioactivité spécifique des protéines calculé par rapport aux

animaux témoins. Chaque valeur est la moyenne de 4 mesures réalisées

chez des souris distinctes. Les droites verticales représentent

1'écart-type.

128

0

» *

"

N - C - NH

I

NO

1-(2-chloroéthyl-U-¹⁴C)-3-cyclohexyl-l-nitrosourée

O

a-CHj,-CH^-N -C - NH

NO

1-(2-chloroéthyl)-3-(cyclohexyl-1-¹⁴C)-l-nitrosourée

Fig. 18 - Structure des deux types de CCNU radioactifs utilisés dans les

mesures de pénétration. L'astérisque localise l'endroit de la

molécule substituée par le-14Q^

129

CICH,CH-NCONH-R

I

NO OH"

' O

//

CICH,CH,N7C-tN-R 2 2 |V V| N H

Ik X

R = -CH2CH2CI BCNU = trans

O"’

CCNU METHYL CCNU

CICH,CH,N + OCN-R (ISOCYANATE)

■^ll N-OH + OH~ OCN-R HOOCNH-R RNHCONHR gOPOjH”

Fig. 19 - Réactions de décomposition du CCNU (d'après D.J. Reed et coll.,

1975).

130

DISCUSSION

Les tumeurs cérébrales présentent deux caractéristiques

dont il faut tenir compte dans le choix d'une chimiothérapie

efficace. D'une part, leur localisation les rend peu accessibles aux médicaments qui ne franchissent pas la barrière hémato-encé­ phalique. D'autre part, on trouve dans ces tumeurs une proportion

très faible de cellules en prolifération, théoriquement les plus

sensibles aux agents chimiothérapiques. Pour être utilisable dans la chimiothérapie des tumeurs cérébrales, un agent carcinostatique

doit donc traverser facilement la barrière hémato-encéphalique et tuer les cellules tumorales indépendamment du fait qu'elles se

multiplient ou restent au repos.

Le CCNU réunit ces 2 conditions. En effet, Levin et coll. 14 (1970) ont montré qu'après l'injection intrapéritonéale de ( C) CCNU aux souris, on retrouve le composé marqué dans le cerveau. En outre, l'activité thérapeutique du CCNU sur divers types de tumeurs cérébrales expérimentales indique que cetfae .nitrosourée traverse la barrière hémato-encéphalique. D'autre part, le CCNU est toxique pour les cellules proliférantes et les cellu­ les non proliférantes (J.P. Wheeler, 1974a). C'est pourquoi le CCNU, avec d'autres nitrosourées, fait partie des médicaments les plus utilisés dans la chimiothérapie des tumeurs cérébrales.

Le CCNU est un des agents les plus actifs sur les tumeurs cérébrales expérimentales (F.M. Schabel, 1976). De grands espoirs ont été fondés sur ce médicament lors de son introduction en

131

clinique en 1969. Néanmoins, les études contrôlées récentes

(M.L. Rosenblum, 1973; T.J. Reagan, 1976; EORTC, 1976, 1978), tout en confirmant 1'efficacité du CCNU dans le traitement des

tiomeurs cérébrales humaines, ont montré que ce médicament a des effets thérapeutiques assez modestes. Dans le but d'améliorer

le traitement chimiothérapique des tumeurs cérébrales, nous avons cherché un moyen d'accroître l'effet cytotoxique du CCNU sur la cellule tumorale.

Dans le domaine des maladies infectieuses, il est relativement facile d'étudier in vitro l'activité d'un médicament sur les cel­ lules cibles (exemple ; cultures bactériennes et antibiogrammes). Au contraire, pour les tumeurs, il n'existe actuellement aucun moyen sûr de recréer in vitro un système dont l'étude et les résul­

tats peuvent être transposés en clinique. En effet, on peut difficilement comparer la cinétique cellulaire d'une culture de cellules tumorales, dont la proportion de cellules en prolifération

est très élevée, à celle d'une tumeur solide in vivo, où la plu­ part des cellules ne prolifèrent pas. De plus, il existe dans l'organisme de nombreuses barrières physiologiques qui limitent la diffusion d'un agent chimiothérapique alors que ces barrières sont naturellement absente in vitro.

Il faut donc recourir à un modèle plus complexe comme la tumeur maintenue chez l'animal par transplantations successives. L'épen- dymoblastome de la souris est actuellement la tumeur la plus utili­ sée dans l'étude de nouvelles chimiothérapies des tumeurs cérébra­ les (R.J. Geran, 1974).

132

Trois raisons ont motivé ce choix. Primo, l'utilisation expéri­

mentale de la souris pose moins de problèmes techniques que celle du chien ou du singe. Secundo, 1'épendymoblastome est une tumeur

d'origine gliale, et est donc plus proche des tumeurs cérébrales humaines que la leucémie L1210 intracérébrale, d'origine hématolo­

gique. Tertio, 1'épendymoblastome fait preuve d'une certaine stabilité phénotypique, ce qui n'est pas le cas, par exemple, du glioblastome de la souris. (J.I. Ausman, 1970). Bien que certains expérimentateurs utilisent 1'épendymoblastome intracé­ rébral dans leur recherche de nouveaux composés carcinostatiques, nous avons préféré réaliser nos expériences sur 1'épendymoblastome

sous-cutané qui, pour des raisons techniques évidentes, se prête mieux à la manipulation biochimique et aux mesures consécutives. Les travaux récents de Muller et Tator (1978) justifient d'ailleurs notre choix car ces auteurs utilisant 1'épendymoblastome murin

intracérébral,ont confirmé les résultats thérapeutiques que nous

avons obtenus.

L'étude que nous avons réalisée sur 1'épendymoblastome murin démontre clairement une potentialisation du CCNU par l'arophotéri- cine B, puisque 1'amphotéricine B augmente l'effet du CCNU sur la tumeur sans faire preuve elle-même d'activité thérapeutique. La similitude qui existe entre 1'épendymoblastome et les tumeurs cérébrales humaines, suggère l'application clinique possible de

cette observation. Comme 1'amphotéricine B ne traverse pas la barrière hématoméningée, on peut l'administrer par voie intrathé cale (N.P. Alazraki et coll., 1974) sans qu'elle diffuse dans tout l'organisme. Cela offre la possibilité d'augmenter l'action

133

de ce médicament, surtout d'origine hématologique, soit simulta­

nément accrue.

l4'ÎJitéfêt de la potentialisation du CCNU par l'amphotéricine

B nous a conduit à poursuivre son étude pour en comprendre le

mécanisme

Deux types de mécanisme ont été proposés pour expliquer la potentialisation par 1'amphotéricine B de l'activité de diver­ ses substances.

Ils reposent sur 2 propriétés distinctes de 1'amphotéricine B : d'une part, son effet immunostimulant, d'autre part, sa faculté

d'accroître la perméabilité cellulaire.

I - INTERPRETATION IMMUNOLOGIQUE DE LA POTENTIALISATION PAR L'AMPHOTERICINE B

Cette théorie est soutenue par G. Medoff et ses collabora­ teurs (1974) qui ont démontré la potentialisation par 1'amphoté­ ricine B de l'effet du BCNU sur la leucémie murine AKR.

Ils observent, en effet, que la potentialisation par 1'amphotéri­ cine B de l'effet du BCNU sur cette leucémie dépend étroitement de la séquence suivie pour l'administration des 2 composés

(J. Medoff et coll. 1974b, 1977). De plus, les souris survivant à la leucémie AKR après le traitement par la combinaison ampho­ téricine B + BCNU résistent à une nouvelle inoculation de cellule

leucémiques. Enfin, la potentialisation ne s'observe pas chez les animaux traités par un agent immunodépresseur tel que la cyclophosphamide.

134

L'amphotéricine B stimule en effet certaines cellules du

système immunologique. Chez la souris, elle provoque le rejet du plasmacytome et retarde l'apparition du lymphome AKR spontané

(F. Valériote et coll., 1976). Elle stimule également la réaction

hiomorale des souris à l'haptène trinitrophényle combinée à la

sérum-albumine humaine(J.R. Little, 1978; S.H. Stein, 1978). Actuellement, trop peu d'expériences ont été réalisées pour

qu'on puisse préciser le mécanisme de l'effet adjuvant de 1'am­ photéricine B. L'effet immunostimulant de 1'amphotéricine B

n'est observé que dans certaines races de souris. On ne l'a pas observé chez les souris de race C57 Bl mâles (J.R. Little et coll., 1978) que nous avons utilisées dans notre étude.

C'est pourquoi, bien que nous n'ayons pas exploré cette possibi­ lité, il est peu probable que la potentialisation du CCNU par 1'amphotéricine B soit due à un mécanisme immunologique.

II - POTENTIALISATION PAR L'AMPHOTERICINE B DUE A L'AUGMENTA­ TION DE PERMEABILITE CELLULAIRE

La plupart des auteurs admettent que l'augmentation de la perméabilité cellulaire est la cause de la potentialisation par 1'amphotéricine B de l'effet d'autres substances. On sait en effet que la formation de complexes entre 1' amphotéricine B et les stérols des membranes cellulaires (A.W. Norman, 1972; B. De Kruijff, 1974) rend la membrane plasmatique plus perméable à

divers solutés (B. Deuticke, 1973). Dans son étude, J. Medoff (1974) a établi de manière directe que la potentialisation par 1'amphotéricine B provient de son effet sur la membrane cellulaire.

135

utilisant une lignée de cellules HéLa résistantes à l'actino- mycine D, cet auteur a montré que 1'amphotéricine B rend les

cellules sensibles à 1'actinomycine D en augmentant la pénétration

intracellulaire de cet inhibiteur.

Il est donc raisonnable de chercher la cause de la poten­

tialisation de l'effet du CCNU dans une perméabilité accrue de la tumeur à ce composé ou ses dérivés. Cette hypothèse nous amène à considérer deux questions :

- 1'amphotéricine B s'accumule-t-elle de manière spécifique dans la membrane plasmatique des cellules tumorales ?

- 1'amphotéricine B augmente-t-elle la pénétration intratumorale du CCNU ou de ses produits de dégradation ?

1. Distribution subcellulaire de 1'amphotéricine B dans l'épendy- moblastome

Pour estimer l'affinité de 1'amphotéricine B pour les

membranes plasmatiques, nous avons purifié celles-ci à partir de 1'épendymoblastome.

La répartition des différents organites subcellulaires au cours du fractionnement a été étudiée en mesurant l'activité d'enzymes marqueurs, spécifiquement localisés sur les princi­

paux organites cellulaires.

La 5'-nucléotidase est couramment utilisée comme marqueur

enzymatique des membranes plasmatiques. Néanmoins, sa distribu­ tion subcellulaire varie selon le tissu étudié. Si dans les lympho­ cytes du rat, on ne trouve la 5'-nucléotidase qu'au niveau de la

136

les hépatocytes, l'enzyme a une distribution plus hétérogène

puisqu'il se trouve non seulement dans la membrane plasmatique, mais aussi dans le réticulum endoplasmique (C.C. Widnell, 1972)

et l'appareil de Golgi (M.G. Farquhar et coll., 1974).

Pour cette raison, nous avons utilisé une méthode cytochimique pour démontrer que l'activité de la 5'-nucléotidase n'est déce­

lable que dans la membrane plasmatique. En outre, pour plus de sûreté, nous avons utilisé un> second enzyme, la phosphodiestéra- se I,considéré par Touster (1970) comme un enzyme spécifiquement associé à la membrane plasmatique,du moins dans 1'hépatocyte.

Cela semble aussi être le cas pour 1'épendymoblastome puisque l'enrichissement de l'activité de la phosphodiestérase I est équivalent à celui de la 5'-nucléotidase dans la fraction de

membranes plasmatiques. Pour suivre la distribution des autres structures cellulaires au cours du fractionnement, nous avons

mesuré l'activité d'autres enzymes dont la localisation sub­ cellulaire est décrite dans la littérature. Il a été démontré que la succinate déshydrogénase est présente dans les mitochon­ dries (C. de Duve, 1962) et 1'arylesterase dans le réticulum endoplasmique (Amar-Costesec, 1974). La-glucuronidase se trouve surtout dans les lysosomes (C. de Duve, 1962) mais est également présente dans les microsomes.

La première étape de la méthode que nous avons développée s'inspire de la technique suivie par Neville (1960) et Ray (1970)

pour purifier les membranes plasmatiques du foie de rat. Ces auteurs conseillent en effet l'utilisation de l'appareil de Dounce pour l'homogénéisation du tissu, de même que l'addition

137

similitude entre leur méthode et la nôtre s'arrête là. En effet, Neville et Ray font sédimenter les membranes plasmatiques avec les noy^uXf en centrifugeant à basse vitesse, alors que les

membranes plasmatiques d'épendymoblastome sédimentent avec les

mitochondries à une vitesse de centrifugation beaucoup plus élevée. De plus, 2 centrifugations en gradient de densité iso-

pycnique sont nécessaires pour séparer les membranes plasmatiques des mitochondries et des lysosomes.

La purification des membranes plasmatiques suivant notre méthode donne des résultats reproductibles, puisque au cours de

6 expériences, la valeur moyenne de l'enrichissement en 5'-

nucléotidase varie de 15% seulement. La fraction de membranes plasmatiques montre un enrichissement de 15 fois en 5'-nucléoti-

dase et de 17 fois en phosphodiestérase I. Elle est peu contaminée par les lysosomes et les fragments du réticulum endoplasmique, puisque dans cette fraction, l'activité spécifique de la/^-

glucuronidase est enrichie deux fois alors que l'activité spéci­ fique de 1'arylestérase est similaire à celle de l'homogénat. Le succinate déshydrogénase n'est pas décelable dans la fraction de membranes, ce qui indique l'absence des mitochondries.

Au point de vue de sa composition en lipides, la fraction de membranes plasmatiques d'épendymoblastome se caractérise par un

rapport molaire phospholipides/cholestérol de 0,6, valeur simi­ laire à celles mesurées dans les fractions de membranes plasma­

tiques provenant d'autres tissus (J.L. Steck et coll., 1970). Le grand enrichissement en membranes plasmatiques de la fraction que nous avons préparée a été confirmé par un examen au micros­ cope électronique et démonstration cytochimique de la 5'-nucléo- tidase.

138

Distribution_subce^lulaire_de ^'^£hotér^cIne B trit^ée

Si 1'amphotéricine B forme avec le cholestérol des complexes stables et s'accumule dans la membrane plasmatique, la répartition

de la radioactivité au cours du fractionnement subcellulaire de

1'épendymoblastome doit être parallèle à celle de la 5'-nucléoti- dase, marqueur de cette structure.

Ce n'est manifestement pas le cas dans 1'épendymoblastome puisque 15% du matériel radioactif seulement se retrouvent dans le culot

contenant 62% de la 5'-nucléotidase.

En outre, la concentration de matériel radioactif par mg de

protéines est similaire dans la fraction de membranes plasmatiques et l'homogénat total, ce qui indique que 1'amphotéricine B ne

s'accumule pas de manière sélective dans les membranes plasma­ tiques de ces cellules tumorales. Connaissant la radioactivité spécifique de 1'amphotéricine B tritiée, on peut calculer la concentration d'amphotéricine B dans la membrane plasmatique et l'estimer à une molécule d'amphotéricine B pour 16.000 molécules de cholestérol.

Il faut néanmoins garder à l'esprit que la quantité d'ampho­

téricine B présente dans les membranes peut être sous-estimée quand on la mesure après fractionnement subcellulaire. En effet, les complexes amphotéricine B-cholestérol sont fragiles car leur cohésion est principalement assurée par des liaisons de type hydrophobes (B. De Kruijff et R.A. Demel, 1974) . Il n'est donc

pas exclu qu'ils se dissocient au cours de l'homogénéisation ou

139

Nous avons donc poursuivi la vérification de l'hypothèse concer­

nant une éventuelle augmentation de la perméabilité cellulaire en étudiant l'effet de 1'amphotéricine B sur la pénétration Intratumorale du CCNU et de ses produits de décomposition.

2. Effet de 1'amphotéricine B sur la pénétration intratumorale du COro et de ses produits de dégradation

L'ensemble des études sur les effets cytotoxiques du CCNU

indiquent qu'ils sont dus à ses produits de dégradation plutôt qu'au médicament lui-même.

La figure 19 donne un aperçu des réactions chimiques impliquées dans la décomposition du CCNU. Ce schéma a été

proposé par Reed et coll., (1975) après séparation et iden­

tification des produits apparaissant quand le CCNU se décompose

in vitro dans les conditions physiologiques (pH 7,4, 37° C). Lors de la décomposition du CCNU 2 séries de composés apparais­

sent, dérivant d'une part de la partie chloroéthyle, et d'autre part, de la partie cyclohexyle. On peut déterminer l'origine de ces composés en utilisant comme nous l'avons fait dans ce travail, du CCNU radioactif marqué respectivement au niveau de la partie chloroéthyle ou de la partie cyclohexyle de la

molécule (figure 18).

Des produits provenant de la partie chloroéthyle, c'est-à- dire le chlorure de vinyle, l'ion chloroéthyl carbonium et le chloroéthanol qui en dérive, ont un pouvoir alkylant. En effet, en incubant de l'acide polycytidylique et de l'acide polyguan-

ylique en présence de CCNU radioactif, Cheng (1972) a démontré une fixation aux polynucléotides synthétiques des composés

140

radioactifs provenant de la partie chloroéthyle du CCNU. La

réaction d'alkylation du BCNU, une nitrosourée voisine du CCNU, avec l'acide polycytidylique, aboutit à la modification du

4 noyau pyrimidigue avec formation de 3-hydroxyéthyl-CPM et 3, N - éthano-CMP (B.G. Kramer et coll., 1974). In vivo et in vitro,

les produits alkylants dérivant du CCNU se fixent a\ix acides

nucléiques des cellules de la leucémie murine L1210 (Cheng et coll., 1972). Il est probable que les altérations du DNA produi

tes par le CCNU sont causées par ces réactions d'alkylation. L'incubation de DNA purifié en présence de CCNU provoque la formation de liaisons intercaténaires (K.W. Kohn, 1977).

Le traitement des cellules de la leucémie L1210 par le CCNU

produit dans le DNA de ces cellules des ruptures et des liaisons intercaténaires (J. Hilton et coll., 1977; R.A.G. Ewig et coll.,

1978). Ces lésions du DNA ont été également observées in vivo (P.H. Gutin et coll., 1977) dans le glioblastome intracérébral de rats traités par le CCNU.

A côté de composés alkylants, le CCNU donne naissance à un dérivé capable de se combiner aux protéines : il s'agit de l'iso cyanate de cyclohexyle qui réagit avec les fonctions amines. Wheeler et coll. (1975) ont démontré que pendant l'incubation de lysine avec le CCNU ou l'isocyanate de cyclohexyle, il se forme de la cyclohexylcarbamoyllysine (N2 ou Ng). L'isocyanate de cyclohexyle dérivant du CCNU se combine in vitro par carba­ moylation avec des polypeptides synthétiques ou des protéines

comme l'albumine ou l'insuline (B. Schmall et coll., G.P. Wheeler et coll., 1975).

141

14

L'addition de ( C-cyclohexyl)-CCNU à des cultures cellulaires

a en outre apporté la preuve de la fixation de l'isocyanate de cyclohexyle aux protéines des cellules. L'isocyanate de

cyclohexyle radioactif dérivant du CCNU se combine in vitro avec les protéines des cellules de la leucémie L1210 (Cheng et

coll., 1972), du lymphome TLX5 (T.A. Connors et coll., 1974) ou des cellules HéLa (K. D. Tew et coll., 1978). Il présente

une affinité particulière pour les protéines nucléaires (T.A. Connors et coll., 1974), histones (P.V. Woolley et coll., 1976)

ou non-histones (K.D. Tew et coll., 1978). La fixation de l'isocyanate de cyclohexyle aux protéines des cellules L1210

a également été démontrée in vivo, après administration de 14

( C-cyclohexyl)-CCNU aux souris (C.J. Cheng et coll., 1972).

On peut s'attendre à ce que l'isocyanate de cyclohexyle bloque

l'activité de certains enzymes. Babson et coll. (1977) ont décrit l'inhibition de l'activité de la chymotrypsine due à la combinaison irréversible de l'isocyanate de cyclohexyle avec la sérine du site actif. Malheureusement, les études manquent pour déterminer quels sont les enzymes cellulaires qui pour­ raient être les plus sensibles à une telle inhibition.

En résumé, le CCNU a une double action par la libération des produits de décomposition présentant des propriétés chimi­ ques distinctes : a) modification des protéines et des acides nucléiques par alkylation et b) altération des protéines par

carbamoylation. Ces produits se forment très vite après l'ad­ ministration du CCNU puisque la demi-vie de ce dernier in vitro

est évaluée à 1 heure. La radioactivité intratumorale que l'on

142

de la pénétration intracellulaire du CCNU lui-même, et d'autre

part, de la pénétration de ses produits de décomposition radio­ actifs.

Le traitement par 1’amphotéricine B n'affecte pas la pénétration intratumorale du CCNU lui-même. La quantité de CCNU extrait et purifié de la tumeur est équivalente chez les

animaux traités par 1'amphotéricine B comparés aux témoins.

La mesure de la radioactivité intratumorale après injection de 14

( C-chloroéthyl)CCNU (figures 13 et 18) montre que le traitement par 1'amphotéricine B n'influence pas la pénétration des compo­ sés marqués dérivant de la partie chloroéthyle.

14

Par contre, quand on injecte le ( C-cyclohexyl) CCNU (figures 12 et 18), on constate que la radioactivité intratumorale est plus

élevée chez les souris traitées par 1'amphotéricine B. Ce poly-

ène favorise donc la pénétration intratumorale des produits déri­ vant de la partie cyclohexyle du CCNU. En raison des effets cellulaires multiples des produits de décomposition du CCNU, il est difficile de prévoir les altérations cellulaires qui peuvent résulter d'une perméabilité accrue des cellules tximorales à cer­ tains de ces produits. Dans le cas précis de 1'épendymoblastome, nous avons abordé le problème en mesurant, in vivo, l'effet

du traitement par 1'amphotéricine B et le CCNU sur l'incorporation de précurseurs radioactifs dans les acides nucléiques et les

143

III - EFFET DU CCNU ET DE L ' AMPHOTERICINE B SUR L ' INCORPOR?^TION DE PRECURSEURS RADIOACTIFS DANS LES ACIDES NUCLEIQUES ET LES PROTEINES

L'effet du CCNU sur l'incorporation de thymidine tritiée dans le DNA a été mesuré 24 heures après l'injection du médica­ ment, puisque Shapiro (1972) a montré que l'inhibition produite

par le CCNU est maximale à ce moment. Nous avons confirmé les résultats de Shapiro, en montrant que le CCNU inhibe l'incor­

poration de thymidine tritiée dans le DNA de 1'épendymoblastome. La relation entre la dose et le degré d'inhibition montre que

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