Faculté de Pharmacie

Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques

Contribution à la recherche de nouveaux agents antibactériens actifs sur les

biofilms de P. aeruginosa

Carole NAGANT

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur et co-promoteur :

Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique)

Michel VANDENBRANDEN (Structure et Fonction des Membranes Biologiques)

Composition du jury :

Véronique MATHIEU (Présidente) Véronique FONTAINE (Secrétaire) Stéphanie POCHET

Franck MEYER

Philippe COURTOIS (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Thierry BERNARDI (Membre du groupe européen de recherche COATIM)

2013

Faculté de Pharmacie

REMERCIEMENTS

Avant tout, je tiens particulièrement à remercier le Professeur Jean-Paul Dehaye qui, par sa grande compétence scientifique, ses précieux conseils et son implication assidue m’a aidée et soutenue tout au long de ce travail de recherche. Je le remercie très sincèrement pour son immense disponibilité, son dynamisme et son écoute constante, attentive et constructive.

Je remercie le Professeur Michel Devleeschouwer et le Docteur Marie Tré-Hardy de m’avoir initiée à l’étude des biofilms lors de la réalisation de mon mémoire de fin d’études.

Ils m’ont transmis leur enthousiasme, leur curiosité et m’ont convaincue de poursuivre la recherche sur les biofilms, prometteuse dans le développement de voies thérapeutiques innovatrices.

J’exprime vivement mes remerciements au Professeur Michel Vandenbranden pour ses conseils et sa contribution à l’analyse des spectres infrarouges. Je le remercie ainsi que le Professeur Philippe Courtois, pour l’intérêt qu’ils ont manifesté tout au long de ce travail comme membres du comité d’accompagnement.

Mes remerciements s’adressent également à tous les membres du Département de Biopharmacie, dont le Laboratoire de Chimie Biologique Médicale et de Microbiologie Pharmaceutique, qui ont contribué au cadre de travail agréable dans lequel j’ai pu effectuer ma thèse. Je remercie en particulier Malika, Michèle, Catherine, Jean-Marie et Anar pour le partage de moments conviviaux et pour nos fructueux échanges durant la réalisation des expérimentations. Merci également à Sara, Naïma, Delphine et Charaf pour leur aide et leur sympathie.

Toute ma gratitude va au Professeur Philip S. Stewart et à Betsey Pitts pour m’avoir accueillie au sein de leur laboratoire, lors d’un séjour au Center for Biofilm Engineering à Bozeman (Montana, Etats-Unis). Je les remercie vivement pour leur accueil très chaleureux,

Remerciements les nombreux échanges scientifiques et le partage de leur expertise technique en microscopie confocale.

Je remercie le Fonds de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS) pour son soutien financier et la Fédération Wallonie-Bruxelles pour m’avoir nommée lauréate du Concours de Bourse de Voyage qui m’a permis d’effectuer le séjour de trois mois aux Etats-Unis.

J’adresse mes remerciements au Docteur Olivier Denis de l’Hôpital Erasme et au Docteur Mario Vaneechoutte de l’Université de Gent pour les souches cliniques de P.

aeruginosa. Je remercie également vivement le Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir fourni les cellules HUVEC.

J’exprime aussi toute ma gratitude et mes remerciements, et non des moindres, à l’ensemble du corps professoral et scientifique de la Faculté de Pharmacie de l’Université libre de Bruxelles pour la qualité de l’enseignement et de la formation au cours du master en sciences pharmaceutiques.

À titre plus personnel, j’adresse d’immenses remerciements à mes parents et mes soeurs qui m’ont toujours soutenue et qui étaient d’une aide plus que précieuse tout au long de ce parcours.

Enfin, toutes mes pensées vont à Clément que je remercie pour le bonheur et le soutien qu’il m’apporte au quotidien.

RESUME

Les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose sont colonisées par de nombreux pathogènes, parmi lesquels la bactérie P. aeruginosa est prédominante. Après des épisodes répétés d’infections du tractus respiratoire principalement liées à P. aeruginosa, les patients développent une insuffisance pulmonaire associée à un déclin du statut clinique et à une aggravation du pronostic puisqu’elle est souvent responsable du décès de ces patients. Les infections chroniques à P. aeruginosa affectent 80 à 90 % des patients atteints de mucoviscidose et, une fois ces infections installées, les associations actuelles d’antibiotiques sont incapables d’éradiquer la bactérie des voies aériennes de ces patients. La chronicité des infections est liée au développement de la bactérie sous un mode de vie particulier, le biofilm.

Les bactéries s’assemblent en communautés complexes et organisées, entourées par la sécrétion d’une matrice extracellulaire polymérique. Ce mode de vie procure aux bactéries présentes dans le biofilm un environnement dense et protecteur, augmentant la résistance du pathogène au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques conventionnels.

Dans la première partie de notre travail, nous avons caractérisé différentes souches de P. aeruginosa, comprenant des souches de référence et des souches cliniques isolées des expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les propriétés d’adhésion, de développement des biofilms, de mobilité, de production de rhamnolipides, l’activité protéolytique et la production d’acylhomosérine lactones se sont avérées très différentes au sein des souches. De plus, les caractéristiques phénotypiques des souches ne constituaient pas une valeur prédictive de la sensibilité des bactéries à un antibiotique, soulignant la nécessité d’étudier un panel large de souches pour caractériser l’effet d’un agent antimicrobien.

Dans la lutte pour combattre les infections et l’apparition de souches multirésistantes, de nouvelles stratégies thérapeutiques sont développées. Les céragenines sont une famille de molécules synthétisées dans le but de mimer la structure amphipatique des peptides antimicrobiens responsable de leur activité bactéricide importante. Contrairement à ces derniers, les céragenines maintiennent leur activité dans des conditions physiologiques.

Résumé Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié l’effet d’un composé antimicrobien appartenant à la famille des céragenines, le CSA-13, sur les différentes souches de P. aeruginosa. Nous avons confirmé le potentiel bactéricide du CSA-13 sur des cultures planctoniques de P. aeruginosa. Nous avons démontré qu’une concentration très faible et non cytotoxique de CSA-13 (10 fois inférieure à la CMI), inhibait la formation d’un biofilm de 3 souches de P. aeruginosa sur les 8 testées. L’étude du potentiel zêta des souches nous a permis de proposer un mécanisme basé sur des interactions électrostatiques pour expliquer l’action préventive du CSA-13 sur le développement du biofilm. Une concentration plus importante de CSA-13 a éradiqué l’entièreté d’un biofilm âgé de 24 h pour 7 des 8 souches étudiées. Six souches ont été évaluées dans un biofilm mature et toutes ont répondu au composé avec des concentrations croissantes ou un temps d’exposition du composé au biofilm plus important. Aucune résistance au CSA-13 n’est apparue durant le traitement. L’usage de la microscopie confocale à balayage laser a confirmé la rapidité et l’efficacité d’action du CSA-13 sur un biofilm robuste et complexe de P. aeruginosa par visualisation dans le temps et dans l’espace de l’effet du CSA-13 sur le biofilm. L’ensemble des observations de ce travail nous a permis de conclure que 7 sur les 8 souches de P. aeruginosa étaient sensibles au CSA-13, soit à un stade initial de la formation du biofilm, soit après maturation du biofilm.

Ces résultats soulignent le potentiel thérapeutique important, envers tous les stades de formation et de développement du biofilm, de composés à structure amphiphile comme le CSA-13, avec une face cationique favorisant les interactions avec les membranes bactériennes chargées négativement et une face hydrophobe contribuant à la perturbation de ces membranes.

Le traitement de référence actuel envers les infections à P. aeruginosa, chez les patients souffrant de mucoviscidose, consiste en l’administration par inhalation de tobramycine commercialisée sous le médicament TOBI^®. Nous avons investigué l’intérêt d’une administration combinée de l’aminoglycoside avec le CSA-13. Un bénéfice évident de la combinaison de CSA-13 et de tobramycine est apparu dans cette étude aussi bien sur biofilm jeune que mature. Dans certaines conditions, le CSA-13 semblait même prévenir la résistance à la tobramycine. Il sera cependant indispensable de concevoir des expériences in vivo pour confirmer l’intérêt du CSA-13 ou d’une co-administration de CSA-13 et de la tobramycine dans le traitement d’infections chroniques à P. aeruginosa chez des patients atteints de mucoviscidose.

Nos études in vitro sur cellules eucaryotes humaines ont mis en évidence une toxicité membranaire et mitochondriale provoquée par le CSA-13 lors de l’administration de concentrations importantes. L’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a permis de réduire significativement la toxicité du composé sur les membranes. Cependant, l’association n’a pas diminué les effets délétères exercés par le CSA-13 sur l’activité mitochondriale. Les études devront donc se poursuivre afin d’affiner la compréhension du mécanisme d’action des céragenines et de pouvoir déceler des dérivés moins toxiques.

L’évaluation de l’activité in vivo du composé devrait nous éclairer quant à la fenêtre thérapeutique utilisable en clinique.

Dans la troisième partie de ce travail, nous avons investigué le potentiel anti- Pseudomonas du peptide antimicrobien LL-37, appartenant à la famille des cathélicidines. Les peptides antimicrobiens partagent quelques caractéristiques communes ; leur cationicité, une structure amphiphile et un nombre de résidus compris entre 10 et 50. L’intérêt pour ces peptides dans le but de combattre les infections s’est fortement développé ces dernières années face à l’émergence fulgurante de souches multirésistantes à l’antibiothérapie conventionnelle. En effet, ces peptides possèdent un très large spectre antimicrobien et sont très peu susceptibles d’induire une résistance. Malgré le haut pouvoir antibactérien du peptide LL-37, l’utilisation clinique de ce peptide doit contourner certains inconvénients majeurs avant de tirer pleinement profit de la molécule. Dans ce but, nous avons étudié une librairie de fragments dérivés du peptide initial pour leur activité sur les différents stades de développement du pathogène. Dans ce travail, nous avons caractérisé de plus petits fragments, notamment les peptides LL7-37 et LL7-31, possédant une activité antibactérienne et antibiofilm considérable sur P. aeruginosa. Ils inhibaient la croissance de cultures planctoniques du pathogène et prévenaient le développement d’un biofilm par cette souche.

Cette étude est également la première à avoir investigué l’activité des différents fragments dérivés du LL-37 sur un biofilm préformé de P. aeruginosa : nous avons ainsi souligné l’efficacité de ces peptides sur des biofilms préformés avec une architecture tridimensionnelle complexe. Nous avons également mis en évidence un avantage essentiel à l’utilisation de ces deux dérivés : leur toxicité réduite sur les cellules eucaryotes. Des études de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée ont identifié une structure secondaire en hélice-α pour les peptides actifs sur P. aeruginosa. La liaison des peptides aux lipopolysaccharides de P. aeruginosa pour exercer leur activité, a également été proposée dans ce travail. Le mécanisme d’action complet de ces peptides antimicrobiens n’est pas

Résumé encore entièrement élucidé et semble impliquer différentes cibles, comme souligné par nos expérimentations de perméabilisation des membranes internes et externes des bactéries.

L’expérimentation in vivo sera indispensable pour concrétiser le potentiel de ces dérivés peptidiques.

En conclusion, ce travail démontre que les stéroïdes cationiques antimicrobiens dérivés de l’acide cholique ainsi que les fragments LL7-37 et LL7-31 dérivés de la cathélicidine humaine, offrent de nouvelles perspectives pour l’éradication de souches résistantes de P. aeruginosa se développant dans un biofilm. Ils sont un modèle de composés prometteurs aussi bien pour le traitement d’infections aiguës que pour le traitement d’infections chroniques provoquées par ce pathogène et qui sont si fréquentes et souvent fatales chez les patients souffrant de mucoviscidose.

LISTE DES ABREVIATIONS

3-oxo-C12-HSL : N-(3-oxododecanoyl)-L- homosérine lactone

A. tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens

A. xylosoxidans : Achromobacter xylosoxidans

AB : Agrobacterium

ABC : ATP Binding cassette ADN : acide désoxyribonucléique ADP : adénosine diphosphate aGM1 : récepteur asialoGM1 AHL : acylhomosérine lactone

AMPc : adénosine 5’-monophosphate cyclique

ANOVA : analyse de variance ARN : acide ribonucléique

ASTM : American Society for Testing and Materials

ATCC : American Type Culture Collection

ATP : adénosine 5’-triphosphate

ATR-FTIR : spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée

B. cepacia : Burkholderia cepacia B. pseudomallei : Burkholderia pseudomallei

B. thailandis : Burkholderia thailandis BBM : Bouillon Biofilm Modifié BFRT^® : Biofilm Ring Test^® BHI : Brain Heart Infusion BM2 : Biofilm Modifié

C. albicans : Candida albicans

C4-HSL : N-butyryl-L-homosérine lactone CAMHB : Mueller Hinton Broth ajusté en ions Ca²⁺ et Mg²⁺

CAMP : Cathelicidin Antimicrobial peptide

CCM : chromatographie sur couche mince CDC : Center for Disease Control

CFF : Cystic Fibrosis Foundation

CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

CMB : concentration minimale bactéricide CMI : concentration minimale inhibitrice CSA : Cationic Steroid Antibiotics CV : cristal violet

DDAO : 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9- dimethylacridin-2-one)

DMSO : diméthylsulfoxide DO : densité optique E. coli : Escherichia coli ECR : élastine congo rouge EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique

EGM : Endothelial Growth Medium EGTA : acide éthylène glycol-bis(2- aminoéthyléther)-N,N,N’,N’-tétraacétique ENaC : Epithelial Na⁺ Channel

ExoS : exoenzyme S ExoT : exoenzyme T ExoU : exoenzyme U ExoY : exoenzyme Y

F. novicida : Francisella novicida FDA : Food and Drug Administration FPRL-1 : Formyl Peptide Receptor Like-1 FTIR : spectroscopie infrarouge à

transformée de Fourier

GFP : green fluorescent protein

H. influenzae : Haemophilus influenzae H. pylori : Helicobacter pylori

hBD : β-défensine humaine

hCAP18 : human cationic antimicrobial peptide

HDP : host defence peptide

hEGF : facteur de croissance épidermique humain

HEPES : acide N-[2-hydroxyéthyl]

pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]

HIV : Human Immunodeficiency Virus HNP : Human Neutrophil Peptide

Abréviations HPLC : chromatographie en phase liquide

à haute performance HSL : homosérine lactone HSV : Herpes Simplex Virus HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells

IFB : indice de formation du biofilm IFN : interféron

IL : interleukine

IP : iodure de propidium

K. pneumoniae : Klebsiella pneumoniae L. monocytogenes : Listeria

monocytogenes LB : Luria Bertani

LDH : lactate déshydrogénase LPO : lactoperoxydase

LPS : lipopolysaccharides

LRP : LDL receptor-related protein MCBL : microscopie confocale à balayage laser

MCT : mercure cadium tellure

MDR-PA : P. aeruginosa multirésistant MH : Mueller Hinton

MRSA : S. aureus résistant à la méthicilline

MS : Mineral Salt

MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol- 2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium

MU : 4-méthylumbelliférone MUG : 4-méthy-lumbelliféryl β-D- galactopyranoside

N. gonorrhoeae : Neisseria gonorrhoeae NADH/NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide réduit/oxydé

NDA : New Drug Application NIH : National Institute of Health NO : monoxyde d’azote

NPN : 1-N-phénylnaphtylamine ONP : o-nitrophénol

ONPG : orthonitrophényl-β-galactoside ORCC : Outward rectifying Cl^- Channel P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis : Proteus mirabilis

PAM : peptide(s) antimicrobien(s) PB : Pseudomonas Broth

pb: paires de base

PBS : tampon phosphate salin PC : Lα-Phosphatidylcholine

PCR : réaction en chaîne par polymérase PKA : protéine kinase AMPc dépendante

PM : poids moléculaire PMB : polymyxine B

POPG : Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3- [Phospho-rac-(1-glycerol)]

PPGAS : Proteose Peptone-Glucose- Ammonium Salts

PQS : Pseudomonas quinolone signal QS : quorum sensing

R² : coefficient de corrélation RFP : red fluorescent protein

RMN : résonance magnétique nucléaire ROS : espèces réactives de l’oxygène S. aureus : Staphylococcus aureus S. epidermidis : Staphylococcus epidermidis

S. maltophilia : Stenotrophomonas maltophilia

S. pyogenes : Streptococcus pyogenes S. typhimurium : Salmonella typhimurium SBI : solution bactérienne initiale

SD : déviation standard

SEM : écart étalon de la moyenne

SEP : substrat extracellulaire polymérique SIC : inhibiteur streptococcique du

complément

SP-A : protéine A du surfactant pulmonaire

t_1/2 : temps de demi-vie TCA : acide trichloroacétique TFA : trifluoroacétate

TMRE : tétraméthylrhodamine éthyl ester TNF : facteur de nécrose tumorale

tpm : tours par minute

TRIS : tris(hydroxyméthyl)-aminométhane TSA : Tryptic Soy Agar

TSB : Tryptic Soy Broth

TTSS : système de sécrétion de type III u.a. : unités d’absorbance

u.a.f. : unités arbitraires de fluorescence ufc : unité formant colonies

V. fischeri : Vibrio fischeri

X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactopyranoside

1

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION

I. LA MUCOVISCIDOSE ... 6

I.1ASPECTSGENETIQUES ... 6

I.2LAPROTEINECFTR ... 7

I.3PREDISPOSITIONAUXINFECTIONSRESPIRATOIRES... 8

I.4COLONISATIONBACTERIENNEDESPOUMONS ... 10

I.5PATHOGENESEDUDECLINPULMONAIREPARP.AERUGINOSA ... 11

I.6PRISEENCHARGEACTUELLEDELAMUCOVISCIDOSE ... 16

II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA ... 18

II.1MICROBIOLOGIEGENERALE ... 18

II.2PATHOGENICITEDEP.AERUGINOSA ... 19

II.2.1 Facteurs de virulence cellulaires ... 19

II.2.2 Facteurs de virulence sécrétés ... 21

II.3LEQUORUMSENSING ... 25

II.3.1 Quorum sensing de type LuxI/LuxR ... 25

II.3.2 Quorum sensing chez P. aeruginosa ... 26

III. LE BIOFILM ... 29

III.1LEBIOFILM :UNMODEDEVIEPARTICULIER ... 29

III.2LAMATRICEDUBIOFILMDEP.AERUGINOSA ... 30

III.3LESETAPESDELAFORMATIONDUBIOFILMDEP.AERUGINOSA ... 31

III.4LESMECANISMESDERESISTANCEDUBIOFILMDEP.AERUGINOSA ... 35

III.4.1 La résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens ... 35

III.4.2 La résistance du biofilm envers les défenses de l’hôte ... 38

IV. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS ... 40

IV.1DESPEPTIDESCOMMENOUVELLESSTRATEGIESTHERAPEUTIQUES ... 40

IV.2LL-37,UNPEPTIDEANTIMICROBIENHUMAIN ... 40

IV.3MECANISMESD’ACTIONANTIMICROBIENNEDESPAM ... 42

IV.3.1 Attraction peptide-membrane ... 43

IV.3.2 Liaison peptide-membrane ... 43

IV.3.3 Interaction peptide-membrane ... 44

IV.3.4 Cibles intracellulaires ... 46

IV.3.5 Mécanismes d’action antimicrobienne du LL-37 ... 46

IV.3.6 Sélectivité cellulaire ... 49

IV.4DESPEPTIDESQUICONTOURNENTLARESISTANCEBACTERIENNE ... 49

IV.5DESPEPTIDESMULTIFONCTIONNELS ... 51

IV.6MECANISMESDERESISTANCEAUXPAM ... 53

IV.6.1 Protéases ... 54

IV.6.2 Molécules extracellulaires liant les PAM ... 54

IV.6.3 Pompes à efflux ... 54

IV.6.4 Altération des propriétés de la surface cellulaire ... 55

IV.7APPLICATIONCLINIQUEDESPAM :OBSTACLESETAVANCEES ... 56

IV.7.1 Coût de la production ... 56

IV.7.2 Sensibilité aux conditions physiologiques et aux protéases ... 57

IV.7.3 Profil toxicologique ... 60

Table des matières

2

IV.7.4 Développement clinique actuel des PAM ... 61

V. LES CERAGENINES ... 62

V.1PROPRIETESANTIBACTERIENNESDUCSA-13 ... 62

V.2CSA-13ETMUCOVISCIDOSE ... 63

BUT DU TRAVAIL MATERIEL ET METHODES

I.1SOUCHESBACTERIENNES ... 68

I.2AGENTSANTIBACTERIENS ... 69

II. METHODES ... 70

II.1FORMATIONDESBIOFILMS ... 70

II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT^® ... 70

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV) ... 71

II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ... 71

II.2MOTILITEDESSOUCHES ... 72

II.3PRODUCTIONDERHAMNOLIPIDES ... 72

II.4SENSIBILITEAUNANTIBIOTIQUE ... 73

II.5ACTIVITEPROTEOLYTIQUE... 73

II.6ACTIVITEELASTOLYTIQUE ... 74

II.7PRODUCTIOND’AHL... 75

II.7.1 Production des C_n≥6-HSL ... 75

II.7.2 Production des C₄-HSL ... 78

II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ... 79

II.8POTENTIELZETA ... 80

II.9ETUDESURDESCULTURESPLANCTONIQUES ... 81

II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB ... 81

II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine (NPN) ... 161

II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa ... 82

II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement ... 83

II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP) ... 83

II.10ETUDESURLAFORMATIOND’UNBIOFILM ... 84

II.11ETUDESURUNBIOFILMPREFORME ... 84

II.11.1 Etude par dénombrement sur un biofilm préformé ... 84

II.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé ... 86

II.12TOXICITESURCELLULESEUCARYOTES(HUVEC) ... 90

II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) ... 90

II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ... 181

II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT) ... 92

II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial ... 93

II.13ETUDEDESSTRUCTURESSECONDAIRESDESPEPTIDESAL’AIDEDELASPECTROSCOPIE INFRAROUGEATRANSFORMEEDEFOURIERAREFLEXIONTOTALEATTENUEE(ATR-FTIR) 94

II.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls... 94

II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ... 95

II.14FIXATIONDESPEPTIDESAUXLPS ... 96

II.14.1 Synthèse de la dansyl-PMB ... 96

II.14.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation... 97

II.14.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS ... 97

II.15PERMEABILISATIONDESMEMBRANESDEE.COLIML-35P ... 98

II.16ANALYSESSTATISTIQUES ... 99

3

CHAPITRE I : CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES SOUCHES

I. INTRODUCTION ... 101

II. RESULTATS ... 102

II.1FORMATIONDESBIOFILMS ... 102

II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT^® ... 102

II.1.2 Formation des biofilms par coloration au CV ... 103

II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ... 104

II.2MOTILITEDESSOUCHES ... 105

II.3PRODUCTIONDERHAMNOLIPIDES ... 106

II.4SENSIBILITEAUNANTIBIOTIQUE ... 106

II.5ACTIVITEPROTEOLYTIQUE... 107

II.6ACTIVITEELASTOLYTIQUE ... 107

II.7PRODUCTIOND’AHL... 108

II.7.1 Production des C_n≥6-HSL ... 108

II.7.2 Production des C₄-HSL ... 110

II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ... 110

II.8CORRELATIONSENTRELAPRODUCTIOND’AHLETDESCARACTERISTIQUES PHENOTYPIQUES ... 112

III. DISCUSSION ... 113

CHAPITRE II : ETUDE DU CSA-13

II. RESULTATS ... 124

II.1EFFETDUCSA-13SURDESCULTURESPLANCTONIQUES ... 124

II.1.1Détermination de la CMI et de la CMB ... 124

II.1.2Effet du CSA-13 sur la perméabilité au NPN... 124

II.2EFFETDUCSA-13SURLAFORMATIOND’UNBIOFILM ... 125

II.2.1Effet d’une faible concentration en CSA-13 sur la formation d’un biofilm ... 125

II.2.2Etude de la cinétique d’interaction du CSA-119 avec 8 souches de P. aeruginosa ... 126

II.2.3Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides ... 127

II.2.4Etude du potentiel zêta ... 128

II.3EFFETDUCSA-13SURUNBIOFILMPREFORME ... 130

II.3.1Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par dénombrement ... 130

II.3.2Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par MCBL ... 135

II.4TOXICITEDUCSA-13SURCELLULESEUCARYOTES ... 138

II.4.1Evaluation de la libération de la LDH ... 138

II.4.2Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ... 138

II.5EFFETDEL’ASSOCIATIONCSA-13ETACIDEPLURONIQUEF-127 ... 139

II.5.1Activité antibactérienne de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 ... 139

II.5.2Toxicité de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 sur cellules eucaryotes ... 140

III. DISCUSSION ... 143

Table des matières

4

CHAPITRE III : ETUDE DU PEPTIDE LL-37 ET DE SES DERIVES

I. INTRODUCTION ... 157

II. RESULTATS ... 158

II.1SEQUENCESETCARACTERISTIQUESDESPEPTIDES ... 158

II.2EFFETDESPEPTIDESSURDESCULTURESPLANCTONIQUES ... 159

II.2.1 Determination de la CMI et de la CMB ... 159

II.2.2 Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP ... 159

II.2.3 Relation entre perméabilité membranaire et mort cellulaire ... 161

II.3EFFETDESPEPTIDESSURLAFORMATIOND’UNBIOFILM ... 162

II.4EFFETDESPEPTIDESSURUNBIOFILMPREFORME–ETUDEPARMCBL ... 163

II.4.1 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans une microplaque ... 163

II.4.2 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC ... 165

II.5ETUDEDESSTRUCTURESSECONDAIRESDESPEPTIDESAL’AIDEDELASPECTROSCOPIE INFRAROUGEATRANSFORMEEDEFOURIERAREFLEXIONTOTALEATTENUEE(ATR-FTIR) 170 II.5.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls... 170

II.5.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ... 172

II.6FIXATIONDESPEPTIDESAUXLPS ... 173

II.6.1 Synthèse de la dansyl-PMB ... 173

II.6.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation... 173

II.6.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS ... 174

II.7EFFETDESPEPTIDESSURLAPERMEABILISATIONDESMEMBRANESDEE.COLIML-35P 175 II.8TOXICITEDESPEPTIDESSURCELLULESEUCARYOTES ... 176

II.8.1 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ... 176

II.8.2 Evaluation de la libération de la LDH ... 177

II.8.3 Evaluation de l’activité mitochondriale ... 177

III. DISCUSSION ... 178

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES LISTE BIBLIOGRAPHIQUE

ANNEXES

5

INTRODUCTION

Figure 1 : Classification des mutations du gène CFTR

Classe I : absence de synthèse de la protéine ou arrêt prématuré menant à la production d’une protéine aberrante, tronquée ; Classe II : maturation défectueuse de la protéine et dégradation prématurée de la protéine malformée dans le système réticulo-endoplasmique – appareil de Golgi ; Classe III : mutation affectant la régulation de la protéine CFTR notamment au niveau des interactions entre l’ATP et les sites de fixation des nucléotides ; Classe IV : altération de la conduction ionique par une ouverture du canal défectueuse diminuant la perméabilité au chlore ; Classe V : réduction de la synthèse de CFTR due à une anomalie de l’épissage du transcrit ; Classe VI : transfert acceléré de la surface cellulaire vers le cytoplasme réduisant l’expression membranaire du canal CFTR ou sa stabilité (Boyle et De Boeck, 2013).

6

I. LA MUCOVISCIDOSE

La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies génétiques graves dans les populations d’origine caucasienne. Elle touche approximativement 1 sur 3500 naissances aux Etats-Unis (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). L’affection héréditaire est présente sur l’entièreté du globe, mais sa prévalence varie en fonction des régions du monde. L’incidence est beaucoup plus faible en Afrique et en Asie.

I.1 ASPECTS GENETIQUES

La mucoviscidose est une maladie à transmission autosomique récessive causée par le dysfonctionnement d’un seul gène, le gène CFTR, codant pour la protéine transmembranaire CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) (Riordan et al., 1989). Le gène CFTR comprend environ 180000 paires de bases (pb) situées sur le bras long du chromosome 7 et est exprimé dans de nombreuses cellules épithéliales et sanguines. La protéine CFTR, de 1480 acides aminés, appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) et fonctionne principalement comme un canal chlore à la membrane apicale de cellules épithéliales des organes cibles (poumon, intestin et glandes sudoripares). A ce jour, plus de 1900 mutations distinctes du gène CFTR associées à la maladie ont été décrites.

Les mutations peuvent être classées en 6 catégories sur base du mécanisme par lequel elles affectent la protéine CFTR (atteinte de la synthèse, du transport, de la fonction ou de la stabilité du canal CFTR) (Rowe et al., 2005 ; Amaral et Kunzelmann, 2007 ; Boyle et De Boeck, 2013). Les conséquences fonctionnelles de toutes les mutations recensées ne sont pas clairement établies et la majorité de ces mutations sont rares (The Cystic Fibrosis Mutation Database). Les mutations des classes I, II et III auraient des conséquences phénotypiques plus importantes liées à une maladie plus sévère. La mutation la plus fréquente est la mutation ΔF508 (mutation de classe II) qui correspond à la délétion de la phénylalanine en position 508 de la protéine due à une délétion de 3 nucléotides au niveau du gène. Elle touche plus de 80 % des patients. Sept % des patients sont victimes des mutations de classe I et 3 % des mutations de classe III. Les classes IV et V sont liées à un taux de mortalité plus faible et à un phénotype clinique plus doux (McKone et al., 2003).

Figure 2 : Modèle de la structure de la protéine CFTR

La protéine CFTR est composée de deux motifs répétés, formés chacun de 6 domaines transmembranaires (TM1 et TM2) et d’un site de fixation aux nucléotides (SFN1 et SFN2), séparés par un domaine régulateur (R). Les domaines TM forment un pore dans la cellule. Le pore est maintenu fermé par le domaine R sous sa forme non phosphorylée. La phosphorylation par une protéine kinase AMPc dépendante (PKA) permet un changement morphologique et l’interaction entre les SFNs et l’ATP. Cette phosphorylation est nécessaire pour l’ouverture du pore. L’ouverture du pore requiert l’hydrolyse de l’ATP après la phosphorylation du domaine R. Adapté d’après Davidson et Dorin, 2001.

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I.2 LA PROTEINE CFTR

La protéine CFTR est exprimée principalement au niveau du pôle apical de l’ensemble des cellules épithéliales de l’organisme recouvrant notamment les voies aériennes, le tractus digestif, l’appareil génital et les glandes sudoripares. La protéine est également exprimée dans d’autres types cellulaires comme les lymphocytes, les polynucléaires ou les macrophages (McDonald et al., 1992 ; Yoshimura et al., 1991 ; Di et al., 2006). Il s’agit d’un canal ionique dont la fonction principale est de permettre le passage des ions chlore (Bear et al., 1992) et qui est régulé par l’AMPc et l’ATP. La protéine agit également comme régulateur des canaux sodium ENaC (Epithelial Na⁺ Channel) et potassium. La protéine CFTR possède deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) composés chacun de six régions transmembranaires, deux sites de fixation des nucléotides (SFN1 et SFN2) et un domaine régulateur cytoplasmique (R). L’interaction de l’ATP avec le domaine régulateur entraîne sa phosphorylation par l’intermédiaire d’une protéine kinase AMPc dépendante (PKA). L’ATP se fixe au SFN1 et, après hydrolyse, modifie la conformation de la protéine ce qui provoque l’ouverture du canal chlore (Cheng et al., 1991 ; Hwang et al., 1994 ; Zeltwanger et al., 1999).

La sortie des ions chlore entraîne un gradient électrochimique. S’ensuit la déphosphorylation et l’interaction de l’ATP avec le SFN2 qui conduit à la fermeture du canal chlore.

Chez les patients souffrant de mucoviscidose, le dysfonctionnement du canal CFTR entraîne une perturbation du transport des ions. Les anomalies de la sécrétion d’eau et d’ions affectent principalement l’arbre trachéo-bronchique et les canaux de différents organes dont ceux du pancréas exocrine, de l’intestin, des tubes séminifères et des glandes sudoripares. Au niveau pulmonaire, les cellules épithéliales expriment les protéines CFTR et ORCC (Outward Rectifying Cl^- Channel), responsables du flux des ions chlore, et des canaux sodiques ENaC intervenant dans le transport transépithélial du sodium. Dans le poumon, la protéine CFTR active indirectement l’ouverture du canal ORCC qui permet la sortie des ions chlore et inhibe le canal ENaC, qui permet l’entrée des ions sodium (Stutts et al., 1997). Chez les patients atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement ou l’absence de la protéine CFTR, entraîne une absorption excessive de sodium par le canal sodium épithélial. Le chlore accompagne le sodium non pas via le CFTR mais plutôt par voie paracellulaire. L'augmentation du gradient transépithélial de chlorure de sodium contribue à une réabsorption importante d'eau avec la formation d’un mucus visqueux et épais tapissant l’arbre trachéo-bronchique. La

Figure 3 : « Hypothèse du faible volume »

Figure A : Illustration de l’ « hypothèse du faible volume » avec un transport des électrolytes et un volume de liquide de surface des voies aériennes normal chez les sujets sains (gauche) en contraste avec une déplétion du volume du liquide de surface suite à une altération du transport des électrolytes chez les sujets malades (droite) (Wine, 1999). Figure B : Représentation de la déplétion de volume du liquide des voies aériennes observée chez les sujets sains (gauche) et atteints de mucoviscidose (droite). Chez les sujets sains les cils des cellules épithéliales éliminent efficacement les particules ou les microorganismes qui sont piégés dans le mucus fin et fluide (un processus appelé clairance mucociliaire). Chez les patients atteints de mucoviscidose, les cils ne sont plus capables d’éliminer la couche de mucus visqueux et déshydraté ; il en résulte la colonisation par des bactéries comme P.

aeruginosa (Matsui et al., 1998).

8 déshydratation des sécrétions et du mucus est responsable de l’obstruction progressive des bronches et de l’apparition de l’infection et de l’inflammation conduisant à une insuffisance respiratoire. Au niveau des glandes sudoripares, on retrouve une concentration en sel élevée dans la sueur chez les patients atteints de mucoviscidose. Cette caractéristique est à l’origine du « test à la sueur », pratiqué dans le dépistage de la mucoviscidose.

I.3 PREDISPOSITION AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES

Le mécanisme exact liant le dysfonctionnement de la protéine CFTR à la maladie clinique reste incertain. Plusieurs mécanismes sont proposés pour expliquer la prédisposition des patients atteints de mucoviscidose aux infections respiratoires (Davies, 2002 ; Hiemstra, 2007 ; Hauser et al., 2011).

(1) L’hypothèse la plus acceptée pour expliquer comment les mutations au niveau de la protéine CFTR mènent à la colonisation des voies respiratoires par les bactéries est l’« hypothèse du faible volume » (Sequeiros et Jarad, 2013).

La clairance mécanique du mucus est considérée comme un mécanisme de défense inné primordial dans les voies respiratoires (Knowles et Boucher, 2002). Le mucus recouvre l’épithélium respiratoire et constitue, avec la présence des cils à la surface de l’épithélium, un mécanisme essentiel de défense de l’hôte par son rôle de piège des bactéries et des particules. L’action des cils permet ensuite leur expulsion. La clairance mucociliaire requiert un système fonctionnel à deux couches de mucus composé d’une couche de liquide périciliaire de faible viscosité et d’une couche superficielle de mucus. Ces deux couches forment le liquide de surface des voies respiratoires. Le fluide périciliaire fournit un environnement aqueux qui permet le battement des cils et la propulsion du mucus loin vers les voies aériennes supérieures.

La clairance appropriée de l'appareil respiratoire nécessite une interaction coordonnée du mucus et de la couche de liquide périciliaire ainsi qu’une hydratation adéquate de la surface des voies respiratoires.

L’« hypothèse du faible volume » a été avancée par Matsui et ses collègues. Dans ce modèle la diminution du transport des ions chlore, liée à une protéine CFTR absente ou altérée, entraîne l’hyperabsorption de sodium (augmentation de l’activité du canal

Figure 4 : Hypothèses expliquant la prédilection de P. aeruginosa dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose

(1) La clairance mucociliaire entravée liée au mucus épais et visqueux et à la déshydratation de la surface des voies respiratoires ; (2) La forte teneur en sel du liquide de surface des voies respiratoires entraînant l’inhibition de l’activité des PAM ; (3) L’augmentation de la disponibilité des récepteurs de surface liant le pathogène (aGM1 = asialoGM1) ; (4) L’internalisation défectueuse de P. aeruginosa par les cellules épithéliales ; (5) Les taux faibles de molécules de défense comme le NO, le glutathion et la LPO (Davies, 2002).

9 ENaC) et d’eau et réduit ainsi le volume du liquide périciliaire à la surface des cellules épithéliales des voies respiratoires. Le battement des cils et, par conséquent, la clairance mucociliaire y sont entravés. Ce modèle favorise le contact du pathogène avec les cellules épithéliales (Matsui et al., 1998).

(2) La stérilité des voies aériennes inférieures est rendue possible par un mécanisme de défense efficace impliquant la clairance mécanique mais aussi la sécrétion de molécules effectrices du système immunitaire inné. Les peptides antimicrobiens (PAM) et les protéines sont des composants essentiels de ce système immunitaire. Les classes principales de PAM produites par les poumons sont les β-défensines et les cathélicidines (LL-37) (Hiemstra, 2007). L’activité de ces médiateurs antimicrobiens est limitée en présence de fortes concentrations en sel.

Par opposition au modèle « du faible volume », Smith et ses collègues proposent l’ « hypothèse de la forte teneur en sel ». D’après ces auteurs, le liquide de surface des voies respiratoires présente une concentration en sel élevée liée à une réabsorption restreinte des ions chlore et par conséquent une rétention des ions sodium dans le liquide de surface des voies respiratoires (Smith et al., 1996 ; Zabner et al., 1998). Ce niveau élevé en sel est responsable de l’inhibition de l’activité des PAM, dont les β- défensines et le peptide LL-37/hCAP-18, qui ne parviennent plus à tuer le pathogène (Goldman et al., 1997 ; Bals et al., 1998a et 1998b).

D’autres hypothèses expliquent la susceptibilité augmentée aux infections chez les patients atteints de mucoviscidose liée à une fonction inadéquate des médiateurs antimicrobiens. La présence dans les poumons des patients souffrant de mucoviscidose de concentrations importantes de protéases est responsable de la dégradation des PAM et contribue à leur inactivation (Taggart et al., 2003). Bucki et ses collègues ont montré la présence dans les expectorations de molécules comme l’ADN et la F-actine, qui se lient aux PAM et entraînent leur inhibition (Bucki et al., 2007a).

(3) Les récepteurs asialoGM1 lient le pathogène P. aeruginosa. Chez les patients atteints de mucoviscidose, on a montré une augmentation de leur expression à la surface des cellules épithéliales des voies respiratoires. Ceci accroît la liaison de la bactérie à la surface épithéliale contribuant à la colonisation bactérienne (Saiman et Prince, 1993).

Figure 5 : Prévalence en fonction de l’âge de plusieurs pathogènes respiratoires dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose

Rapport des données annuelles de la CFF (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). MRSA = S.

aureus résistant à la méthicilline ; MDR-PA = P. aeruginosa multirésistant.

10 (4) Chez les sujets sains, la protéine CFTR joue un rôle de récepteur pour P. aeruginosa au niveau des cellules épithéliales. La liaison de P. aeruginosa sur CFTR provoque son internalisation et sa clairance du tractus respiratoire, participant à la défense pulmonaire de l’hôte. Dans les cellules épithéliales pulmonaires exprimant un canal CFTR muté, ces fonctions sont défectueuses et la clairance du pathogène entravée (Pier et al., 1996 ; Pier et al., 1997).

(5) Le dysfonctionnement de la protéine CFTR entraîne une diminution de la production de la NO synthase chez les patients souffrant de mucoviscidose. Le monoxyde d’azote (NO) possédant des propriétés antibactériennes, son absence prédispose à la colonisation bactérienne pulmonaire (Kelley et Drumm, 1998). La sécrétion de glutathion, aux propriétés antioxydantes, est également défectueuse chez les patients atteints de mucoviscidose (Gao et al., 1999).

La lactoperoxidase (LPO) intervient dans les mécanismes de défense de l’hôte des voies aériennes. L’enzyme utilise l’H2O2 pour catalyser l’oxydation du thiocyanate (SCN^-) en produit antibactérien (OSCN^-). Chez les sujets sains, la protéine CFTR entraîne l’efflux de SCN^- à la surface apicale des cellules épithéliales. Chez les sujets atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement de la protéine CFTR empêche l’accumulation de SCN^- et altère l’activité antibactérienne de la LPO (Conner et al., 2007).

I.4 COLONISATION BACTERIENNE DES POUMONS

La prédisposition à une infection par un pathogène spécifique change avec l’âge pour les patients atteints de mucoviscidose. Chez les enfants et les adolescents, S. aureus est le pathogène le plus fréquemment isolé, bien que P. aeruginosa et H. influenzae soient aussi prévalents. La fréquence de cultures positives pour P. aeruginosa augmente avec l’âge.

D’après le Registre des Patients du CFF, environ la moitié des patients en dessous de 18 ans sont colonisés par P. aeruginosa et à la fin de la vingtaine, le pathogène est isolé chez 80 % des patients malades (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). B. cepacia est moins fréquent mais colonise malgré tout les poumons d’une minorité substantielle d’adultes. D’autres microorganismes comme A. xylosoxidans et S. maltophilia sont représentés avec des

Introduction

11 fréquences plus élevées que B. cepacia (Razvi et al., 2009 ; Millar et al., 2009). Mais ce sont les infections à P. aeruginosa et B. cepacia qui sont associées à un déclin de la fonction pulmonaire et une morbidité et mortalité importantes chez les patients atteints de mucoviscidose (Emerson et al., 2002 ; Nixon et al., 2001 ; Courtney et al., 2007). Les infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa sont celles qui causent les obstructions les plus prononcées des voies respiratoires et consistent en des processus critiques dans la détérioration de la fonction pulmonaire chez les patients adultes atteints de mucoviscidose (Lopes et al., 2012).

I.5 PATHOGENESE DU DECLIN PULMONAIRE PAR P. AERUGINOSA

Bien que le mécanisme précis de prédisposition à une infection ne soit pas clairement établi, il est évident que certains microorganismes sont capables d’infecter les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose menant à un déclin de la fonction pulmonaire. La bactérie P. aeruginosa est le pathogène le plus fréquemment identifié dans les sécrétions des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose. Le processus menant à la détérioration pulmonaire lors de cette infection a été l’objet de recherche intense.

Acquisition de P. aeruginosa

La première étape dans le développement d’une infection à P. aeruginosa dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose est l’acquisition du pathogène. Des analyses génétiques ont montré que les souches initiales de la colonisation bactérienne proviennent de réservoirs environnementaux (Burns et al., 2001). Le pathogène est omniprésent dans les sols humides, les lacs, les ruisseaux et sur les légumes et un contact avec ces sources environnementales naturelles peut induire l’acquisition de la bactérie (Römling et al., 2005). La transmission de P. aeruginosa à partir d’autres personnes infectées ou par d’autres patients atteints de mucoviscidose est également possible.

Adhésion

L’entrée du pathogène dans l’organisme hôte est suivie de l’infection. Les bactéries colonisent d’abord les voies respiratoires supérieures puis, atteignent les voies respiratoires inférieures (Mainz et al., 2009). Chez les patients atteints de mucoviscidose, la clairance

12 mucociliaire, responsable de l’élimination bactérienne chez les sujets sains, est entravée. La couche épaisse et visqueuse limite le mouvement ciliaire des cellules de l’épithélium pulmonaire empêchant l’évacuation des particules et des bactéries vers le nasopharynx. Les bactéries peuvent alors adhérer au mucus épais des bronches et coloniser le poumon. Chez P.

aeruginosa, le processus d’adhésion à l’hôte fait intervenir des interactions spécifiques de la bactérie avec les mucines des sécrétions pulmonaires. Le flagelle et les pili de type IV de P.

aeruginosa participent également aux interactions initiales avec la surface de l’épithélium bronchique, notamment par leur liaison aux récepteurs asialoGM1 (Feldman et al., 1998 ; Saiman et Prince, 1993 ; Gupta et al., 1994). Il a également été suggéré que le pathogène se lie préférentiellement au mucus pulmonaire plutôt qu’aux cellules épithéliales (Worlitzsch et al., 2002 ; Hall-Stoodley et Stoodley, 2009) et que les mucines stimulent l’agrégation et la formation du biofilm (Landry et al., 2006).

Infection précoce ou transitoire

Lors des stades précoces de l’infection, celle-ci est généralement transitoire et son éradication est possible par un traitement antibiotique agressif et une réponse importante de la défense immunitaire de l’hôte (Rosenfeld et al., 2001). A ce stade, les souches isolées des expectorations des patients atteints de mucoviscidose sont acquises de sources environnementales. Le succès du traitement de l’infection est lié à la faible densité bactérienne, au phénotype non mucoïde des souches et à leur faible résistance aux antibiotiques (Burns et al., 2001). Le patient peut être négatif pour P. aeruginosa pendant plusieurs années, l’infection chronique étant généralement acquise dans la fin de la vingtaine (Folkesson et al., 2012).

Infection chronique

Les infections chroniques et persistantes de P. aeruginosa sont associées à un déclin important de la fonction pulmonaire et du pronostic vital. L’installation de la chronicité de l’infection est associée à de nombreux changements génétiques et phénotypiques de la bactérie (Spencer et al., 2003 ; Smith et al., 2006). La plupart de ces changements sont liés à la colonisation bactérienne dans un environnement « stressant ». Cet environnement stressant est créé dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose, par le stress oxydatif et la présence d’antibiotiques, auxquels le pathogène doit faire face. Dans ces conditions, une modification importante de l’expression des gènes apparaît et le taux de mutations des

Figure 7 : Souche mucoïde de P. aeruginosa

La croissance d’une souche de P. aeruginosa de phénotype mucoïde est fortement associée au diagnostic de la mucoviscidose (Pritt et al., 2007).

13 bactéries augmente (Folkesson et al., 2012). Les souches cliniques isolées de patients chroniquement infectés sont typiquement caractérisées par une croissance lente, une résistance aux antibiotiques, une perte de la mobilité et une surproduction d’alginate. Ces changements sont avantageux pour la bactérie (processus adaptatif) et lui permettent de survivre dans l’environnement pulmonaire des malades.

L’établissement de l’infection chronique est corrélé avec la transition de la bactérie vers un phénotype mucoïde résultant en la production excessive et constitutive du polysaccharide extracellulaire alginate (Govan et Deretic, 1996). Cette transition est également corrélée avec une perte de la mobilité des souches mucoïdes, par perte du flagelle (Garrett et al., 1999). Les bactéries motiles de l’environnement pénètrent dans la zone hypoxique du mucus épais et échappent ainsi aux polynucléaires neutrophiles et aux macrophages alvéolaires. Le micro-environnement anaérobique présent dans le mucus des patients atteints de mucoviscidose entraîne la production d’alginate dans lequel P. aeruginosa est intégré. La formation du biofilm commence alors (Worlitzsch et al., 2002). L’organisation des bactéries sous forme d’un biofilm est un caractère phénotypique particulièrement important dans la persistance de la colonisation bactérienne par P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose et chroniquement infectés (Bjarnsholt et al., 2009). Dans ce mode de vie, les bactéries sont très résistantes aux antibiotiques (Xu et al., 2000) et à l’éradication par le système immunitaire de l’hôte (Meluleni et al., 1995 ; Leid, 2009).

Les infections à P. aeruginosa et la destruction du tissu pulmonaire sont liées à l’apparition de bactéries mucoïdes se développant en agrégats (biofilms). L’observation microscopique de ces structures révèle la présence de leucocytes polynucléaires entourant le biofilm mucoïde (Bjarnsholt et al., 2009). Les rhamnolipides et la matrice riche en alginate (Hentzer et al., 2001) des biofilms mucoïdes contribuent à la résistance des bactéries à la phagocytose. Les biofilms de P. aeruginosa entraînent la nécrose des polynucléaires qui sont un élément majeur de la première ligne de défense de l'hôte. Cette nécrose est provoquée par les rhamnolipides dont la production est contrôlée par le système de quorum sensing (QS) (Jensen et al., 2007 ; Christensen et al., 2008). En accord avec ce modèle, Bjarnsholt et ses collègues observent de nombreux polynucléaires dans les tissus entourant le biofilm mucoïde de P. aeruginosa alors qu’aucun polynucléaire n’est détecté à l’intérieur du biofilm

Introduction

14 (Bjarnsholt et al., 2009). P. aeruginosa s’adapte donc au système de défense immunitaire du tractus respiratoire par la formation de biofilms mucoïdes (Høiby et al., 2011).

Il a été souligné que les lésions tissulaires et la diminution de la fonction pulmonaire observées dans des stades plus avancés de la colonisation par P. aeruginosa ne sont pas provoquées par les toxines et enzymes bactériennes mais plutôt par un cycle inflammatoire prononcé, dominé par les polynucléaires qui entourent le biofilm (Goldstein et Döring, 1986;

Lyczak et al., 2000). Après l’entrée de la bactérie dans l’hôte, une réponse inflammatoire accrue est observée dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose en comparaison avec un poumon normal (Dakin et al., 2002). La pathogenèse des dommages tissulaires est liée à l’inflammation provoquée par les complexes immuns présents dans l’arbre trachéo-bronchique. Ils activent la voie du complément et donc le chimiotactisme et l’inflammation. Le recrutement et la présence prolongée des polynucléaires neutrophiles résultent en des lésions significatives du tissu pulmonaire et en une diminution de la fonction pulmonaire. Des taux importants de cytokines et autres facteurs pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8), avec des taux diminués en cytokine anti-inflammatoire IL-10, ont été détectés à des stades précoces de la colonisation dans les voies respiratoires de l’épithélium des patients malades (Rosenfeld et al., 2001; Bonfield et al., 1999; Kirchner et al., 1996).

L’inflammation intense est caractérisée par la séquestration des polynucléaires neutrophiles dans les voies aériennes. Ces polynucléaires neutrophiles libèrent de nombreux composés pro- inflammatoires et notamment des protéases qui, exprimées à des taux aberrants, peuvent causer des dégâts. La libération par les polynucléaires neutrophiles d’élastase (Birrer et al., 1994), de collagénase et d’agents oxydants (radicaux hydroxyles, ion superoxyde) provoque la dégradation de la matrice extracellulaire et de l’élasticité des bronches et des bronchioles.

Les protéases, et en particulier les sérines protéases comme l’élastase du polynucléaire neutrophile, peuvent exacerber l’inflammation, dégrader des protéines structurales et provoquer des dommages tissulaires (bronchiectasies) (Quinn et al., 2010 ; Weldon et al., 2009 ; Jensen et al., 2010). Le résultat est une augmentation de l’expression d’IL-8 et un influx additionnel de neutrophiles créant un cycle inflammatoire. La persistance de l’accumulation des polynucléaires neutrophiles implique également la libération par les neutrophiles nécrotiques d’ADN et d’actine responsables de l’augmentation de la viscosité du mucus. L’enrichissement des expectorations en ADN et en actine est impliqué dans la

Figure 8 : La cascade physiopathologique de la mucoviscidose

D’après Boas et McColley (2007).

Introduction

15 pathogenèse de la maladie pulmonaire (Perks et Shute, 2000) en favorisant également la formation initiale de biofilm à P. aeruginosa (Walker et al., 2005; Parks et al., 2009). L’effet nuisible des facteurs dérivés des neutrophiles est aggravé par la production de composés toxiques par P. aeruginosa. L’élastase de P. aeruginosa clive des facteurs antimicrobiens (lysozyme, surfactant, transferrine). P. aeruginosa échappe à son éradication et atteint des densités cellulaires importantes (Haase et al., 2004). Récemment, Bomberger et ses collègues ont mis en évidence une toxine sécrétée par P. aeruginosa, Cif, qui réduit la sécrétion des ions chlore liée au canal CFTR par les cellules épithéliales des voies aériennes, une force motrice essentielle à la clairance mucociliaire. En contribuant à l’inhibition de la clairance mucociliaire, le pathogène échappe à son éradication (Bomberger et al., 2011).

En résumé, un véritable cercle vicieux (obstruction-infection-inflammation) s’installe dans les poumons, associé à une réponse inflammatoire inefficace et exubérante (Cohen et Prince, 2012 ; Hänsch, 2012). Le défaut génétique de la protéine CFTR permet la persistance de P. aeruginosa. La présence bactérienne permanente dans les voies respiratoires provoque une augmentation de l’inflammation, par stimulation de façon permanente des mécanismes de défense, qui à son tour mène à une augmentation de la densité bactérienne (Moss, 2009). La spirale inflammatoire perpétuelle mène progressivement à des lésions pulmonaires irréversibles. Les voies aériennes se dilatent et l’apparition de bronchiectasies aggrave le phénomène. Une majorité des personnes malades décèdent d’infections respiratoires.

Figure 9 : Augmentation de l’âge médian de survie au cours des années chez les patients atteints de mucoviscidose

D’après Davis, 2006.