Faculté de Pharmacie

Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques

Développement et évaluation in vitro et in vivo de gels

hydrolipidiques injectables à libération prolongée pour le traitement

de pathologies articulaires

Jonathan REEFF

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur(s) et co-promoteur(s):

Prof. Karim AMIGHI (Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie) Prof. Carine DE VRIESE (Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie) Prof. Jonathan GOOLE (Laboratoire de Pharmacie Galénique et de Biopharmacie)

Composition du jury :

Prof. Jean NEVE (Président)

Prof. Frédéric COTTON (Secrétaire) Prof. Pierre DUEZ

Prof. Juergen SIEPMANN (Lille, Institut national de la santé et de la recherche médicale) Prof. Brigitte EVRARD (ULg, Laboratoire de Pharmacie Galénique)

Dr. Anne PERETZ (CHU-Brugmann, Rhumatologie)

Tout d’abord, je tiens à remercier mon promoteur, le Professeur Karim AMIGHI, de m’avoir donné cette opportunité de réaliser une thèse au sein de son service. Je ne vous remercierai jamais assez de m’avoir fait confiance et de m’avoir donné la possibilité de choisir ce projet qui me tient à cœur depuis le début. Au cours de ces différentes années, le Professeur AMIGHI a toujours su faire preuve de compréhension, d’enthousiasme, de conseils avisés et surtout de disponibilité malgré les nombreuses tâches qui lui étaient imposées par la Faculté en tant que Doyen. Je remercie également le Professeur AMIGHI de m’avoir soutenu afin que je puisse obtenir les deux mandats d’assistant pour lesquelles j’avais postulés. Enfin, je remercie le Professeur AMIGHI pour sa grande générosité ainsi que les importants moyens qu’il a mis en œuvre pour contribuer à l’aboutissement de ce travail.

Je suis évidemment très reconnaissant du soutien financier octroyé par la Région Wallonne, qui m’a permis de réaliser ce travail dans le cadre du projet BIOWIN - JOINT-AIC Je tiens ensuite à remercier chaleureusement Carine DE VRIESE. Très sympathique et toujours à l’écoute que ce soit dans les moments forts ou difficiles que j’ai rencontrés au cours de ces années de doctorat. Elle a toujours pris le temps de me répondre et de me conseiller judicieusement pour mener à bien l’issue de ce travail. Partager son bureau et travailler avec elle pendant ces nombreuses années fut un réel plaisir tant son professionnalisme, son implication et sa rigueur scientifique ont été importants pour le déroulement du projet. Au-delà de ces aspects professionnels, j’ai rencontré une amie de grande qualité avec qui j’ai passé d’excellents moments.

Je remercie également Jonathan GOOLE, tout d’abord, pour m’avoir proposé de rejoindre le service du Professeur Amighi dans le cadre de la réalisation d’une thèse. En effet, je n’avais pas du tout envisagé cette orientation qui finalement s’est avérée très fructueuse et intéressante. Ensuite, je le remercie pour toutes les corrections et relectures réalisées en vue des différentes publications.

Merci à l’ensemble des membres de mon comité d’accompagnement, le Docteur Anne PERETZ (CHU-Brugmann) et le Professeur Pierre DUEZ qui ont tous les deux pris le temps chaque année d’évaluer l’avancée de mes recherches et de me conseiller. Je les remercie également d’avoir accepté de juger mon travail pour cette dernière épreuve. J’en profite aussi pour remercier les autres membres du jury : Professeurs Jean NEVE, Frédéric COTTON, Brigitte EVRARD et Juergen SIEPMANN. Merci d’avoir accepté d’examiner mon travail.

Merci également à toute l’équipe du Professeur SERTEYN (CORD) de l’Université de Liège (ULg), plus particulièrement à Thierry FRANCK et Jennifer ROMAINVILLE pour la réalisation des essais sur PMNs équins. Je remercie aussi le toute l’équipe du Professeur HENROTIN (UROC) du CHU de Liège pour leur accueil chaleureux et leur aide dans la mise en place, la réalisation et l’évaluation des résultats de l’étude in vivo. Je profite d’ailleurs de ces quelques lignes pour remercier plus particulièrement Frederic OPRENYESZK et Christelle BOILEAU pour leur professionnalisme, leur rigueur scientifique, leur efficacité et leur gentillesse. Faire votre connaissance et travailler avec vous fut un immense plaisir.

Je remercie évidemment toute l’équipe du Laboratoire de Galénique et Biopharmacie avec qui j’ai passé d’excellents moments que ce soit dans les locaux ou à l’extérieur. Je tiens également à remercier tous les membres des autres services de la Faculté de Pharmacie avec qui j’ai eu l’occasion de travailler ou de côtoyer.

Page III

ABREVIATIONS

SUMMARY

RESUME

INTRODUCTION

I. GENERALITES SUR L’ARTICULATION…………..………... 3

I.1. ANATOMIE DE L’ARTICULATION……….... 3

I.1.1. Généralités………. 3

I.1.2. L’articulation synoviale………. 3

I.2. STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU TISSU CARTILAGINEUX………... 5

I.2.1. Les différents tissus cartilagineux chez l’humain adulte……….... 5

I.2.2. Composition du cartilage hyalin……….... 5

I.2.3. Structure du cartilage hyalin……….. 9

I.2.4. Nutrition du cartilage………... 11

I.2.5. Homéostasie du tissu cartilagineux……….... 11

I.3. LA MEMBRANE SYNOVIALE………... 11

I.3.1. Morphologie………... 11

I.3.2. Histologie………... 13

I.3.3. Physiologie………. 13

I.3.3.1. Barrière de filtration et d’échanges : constitution du liquide synovial……….... 13

I.3.3.2. Rôle sur la trophicité de l’articulation……….. 15

I.3.3.3. Rôle de défense contre les agressions extérieures……….... 15

I.4. LE LIQUIDE SYNOVIAL……….. 15

I.4.1. Composition du liquide synovial……… 15

I.4.2. Propriétés viscoélastiques du liquide synovial……….. 17

II. L’ARTHROSE………. 19

II.1. GENERALITES………... 19

II.2. EPIDEMIOLOGIE………... 21

II.3. FACTEURS DE RISQUE……….... 23

II.4. MODIFICATIONS AU NIVEAU DU CARTILAGE………. 23

II.5. MODIFICATIONS AU NIVEAU DE LA MEMBRANE SYNOVIALE…... 23

II.6. MODIFICATIONS AU NIVEAU DU LIQUIDE SYNOVIAL……….. 25

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II.8. LES TRAITEMENTS CONVENTIONNELS………... 27

II.8.1. Traitements non-pharmacologiques……….... 27

II.8.2. Traitements pharmacologiques……… 29

II.8.2.1. Voie orale………. 29

II.8.2.2. Voie topique………... 33

II.8.2.3. Voie intra-articulaire……….... 33

II.8.2.4. Voie sous-cutanée……….... 37

III. STRATEGIE DE FORMULATION………. 39

III.1. INTÉRÊT DE L’ADMINISTRATION INTRA-ARTICULAIRE……….. 39

III.2. INTÉRÊT DE LA LIBERATION PROLONGÉE………... 39

III.3. TYPES DE FORMULATION DE DELIVRANCE INTRA-ARTICULAIRE... 39

III.4. CHOIX DES EXCIPIENTS………. 45

III.4.1. La monoléine……….... 47

III.4.2. Le hyaluronate de sodium... 49

III.4.3. Les autres excipients approuvés pour la voie parentérale……….. 49

III.5. LES PRINCIPES ACTIFS SÉLECTIONNÉS……….... 55

III.5.1. Le chlorhydrate de clonidine………55

III.5.2. Le dipropionate de bétaméthasone……….. 57

BUT DU PROJET

MATÉRIEL ET MÉTHODES

I.

II.

II.1. ÉTUDE DE COMPATIBILITÉ……….. 69

II.1.1. Analyse thermogravimétrique (TGA)………... 71

II.1.2. Calorimétrie différentielle à balayage (DSC)……….. 71

II.2. DÉVELOPPEMENT DE GELS HYDROLIPIDIQUES INJECTABLES…….. 73

II.2.1. Protocole de fabrication non stérile des gels………... 75

II.2.2. Méthode de fabrication stérile des gels……….……….. 75

III.

III.1. EXTRACTION ET DOSAGE DES DIFFÉRENTS CONSTITUANTS……….. 77

III.1.1. Extraction et dosage de la clonidine par HPLC……...…….…………. 77

III.1.2. Dosage du dipropionate de bétaméthasone par HPLC…... 81

III.1.3. Dosage de l’éthanol par GC………... 83

Page VII

III.2. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES GELS DEVELOPPÉS……….... 85

III.2.1. Observation macroscopique des formulations…………...……….. 85

III.2.2. Observation microscopique des formulations……….. 85

III.2.3. Détermination du pH des formulations……… 87

III.2.4. Etude des changements de masse après immersion des gels………... 87

III.2.5. Analyse de la texture des gels formés après immersion………... 87

III.2.6. Injectabilité des formulations………... 89

III.2.7. Propriétés rhéologiques des formulations………... 91

III.2.8. Propriétés de libération de la clonidine à partir des gels………... 101

III.2.9. Propriétés de libération du dipropionate de bétaméthasone à partir des gels………. 105

III.2.10. Extraction et évaluation de la masse moléculaire de HA par GPC…... 107

III.2.11. Protection de HA contre l’activité enzymatique de la hyaluronidase…... 111

III.3. ESSAI DE STÉRILITÉ………. 111

III.4. RECHERCHE DES ENDOTOXINES……….. 115

IV.

IV.1. VEHICULES ET GELS CONTENANT LA CLONIDINE………..… 115

IV.2. GEL CONTENANT LE DIPROPIONATE DE BETAMETHASONE…...……. 117

V.

V.1. INTRODUCTION……… 117

V.2. MATERIEL ET METHODES………..……… 117

V.2.1. Choix du modèle cellulaire……….. 117

V.2.2. Isolement des neutrophiles équins sur gradient discontinu de Percoll…... 119

V.2.3. Viabilité des cellules……… 119

V.2.4. Mise en évidence de l’activité oxydante des neutrophiles par chimiluminescence………... 121

VI.

VI.1. INTRODUCTION………. 125

VI.1.1. Choix du modèle animal……… 125

VI.1.2. Sélection des lapins……….... 125

VI.1.3. Durée de l’étude……… 127

VI.2. MATERIEL ET METHODES………..……… 127

VI.2.1. Plan de l’étude………... 127

VI.2.2. Prélèvement post-mortem et évaluation macroscopique des articulations……….129

VI.2.3. Décalcification et enrobage des échantillons……...……….. 131

Page IX

RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE I : DEVELOPPEMENT DE NOUVELLES FORMULATIONS HYDROLIPIDIQUES A LIBERATION PROLONGEE CONTENANT LA CLONIDINE

I.

II.

II.1. ETUDE DE COMPATIBILITE………... 139

II.2. DEVELOPPEMENT D’UN GEL HYDROLIPIDIQUE INJECTABLE..…….. 141

III.

CHAPITRE II : CARACTERISATION ET OPTIMISATION DES FORMULATIONS HYDROLIPIDIQUES EN VUE DE PROLONGER LES PROPRIETES DE DELIVRANCE

I.

II.

II.1. OPTIMISATION DES FORMULATIONS GELS...………. 155

II.2. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES GELS……….. 157

III.

CHAPITRE III : DEVELOPPEMENT DE L’ESSAI DE STERILITE ET DE LA METHODE DE FABRICATION DES GELS STERILES

I.

II.

II.1. EVALUATION DE L’ESSAI DE STERILITE……… 179

II.2. DEVELOPPEMENT ET EVALUATION DE LA METHODE DE FABRICATION DES GELS STERILES………..………... 183

III.

CHAPITRE IV : ETUDE DE STABILITE

I.

II.

II.1. STÉRILITÉ, APYROGÉNICITÉ ET pH DES FORMULATIONS………….... 189

II.2. PROPRIETES RHEOLOGIQUES DES FORMULATIONS……….. 191

II.3. POIDS MOLECULAIRE RELATIF DE L’ACIDE HYALURONIQUE…... 193

II.4. DOSAGE DE LA CLONIDINE……….. 193

II.5. PROFILS DE LIBERATION DE LA CLONIDINE……… 195

Page XI

CHAPITRE V : INCORPORATION D’UN PRINCIPE ACTIF LIPOPHILE – LE DIPROPIONATE DE BETAMETHASONE

I.

II.

II.1. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES GELS………... 199

II.2. ETUDE DE STABILITE……….. 203

III.

CHAPITRE VI : EVALUATION IN VITRO DE LA TOLERANCE ET DE L’EFFICACITE DES NOUVELLES FORMULATIONS

I.

II.

II.1. VIABILITE DES CELLULES……….. 211

II.2. EFFETS SUR LA PRODUCTION DES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE………. 213

III.

CHAPITRE VI I: ETUDE IN VIVO DE LA TOLERANCE ET DE L’EFFICACITE DES GELS SUR LAPINS AVEC ARTHROSE INDUITE

I.

II.

II.1. TOLERANCE…...……… 219

II.2. EVALUATION MACROSCOPIQUE DES ARTICULATIONS………... 221

II.3. EVALUATION HISTOLOGIQUE DES MEMBRANES SYNOVIALES …... 227

II.4. EVALUATION HISTOLOGIQUE DU CARTILAGE……… 229

III.

IV.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

BIBLIOGRAPHIE

Page XV

ACLT Anterior cruciate ligament transection = Section du ligament croisé antérieur AINS Anti-inflammatoire non-stéroïdien

AIS Anti-inflammatoire stéroïdien ATCC American type culture collection

CL Chimiluminescence

CLO Clonidine

COX Cyclo-oxygénase

CTL Contrôle

D Coefficient apparent de diffusion

DAD Diode array detector = détecteur à barrette de diodes DPB Dipropionate de bétaméthasone

DSC Differential scanning calorimetry = calorimétrie différentielle à balayage EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique

EMA European medicines agency

ESfunction Effect size on function =Effet thérapeutique sur la fonction

ESpain Effect size on pain =Effet thérapeutique sur la douleur

ET Ethanol absolu

FDA Food and drug administration

FID Flame ionization detector = détecteur à ionization de flame G’ Module d’élasticité

G’’ Module de viscosité

GC Gas chromatography = chromatographie gazeuse GMO Glycerol monooleate = monoléine

GPC Gel permeation chromatography = chromatographie par perméation de gel GR Grade de recommandation

HA Hyaluronic acid = acide hyaluronique

HPLC High-performance liquid chromatography = chromatographie liquid haute performance

HEPA High Efficiency Particulate Air HR Humidité relative

IA Intra-articulaire

ICH International conference on harmonisation

IL Interleukine

LAL Limulus amoebocyte lysat = lysat amoebocyte de limule LOD Limit of detection = limite de détection

LOQ Limit of quantification = limite de quantification MEC Matrice extracellulaire

MMP Matrix metalloproteinase = métalloproté(in)ase matricielle NAS Niveau d’assurance de stérilité

OA Ostéoarthritis = arthrose

OARSI Osteoarthritis research society international

PBS Phosphate buffered saline = tampon phosphate salin

PG Propylène glycol

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PMN Polymorphonuclear neutrophile = Leucocyte polymorphonucléaire PSC Poste de sécurité cytotoxique

PSM Poste de sécurité microbiologique

RID Refractive index detector = détecteur à indice de refraction ROS Reactive oxygen species = espèces réactives de l’oxygène RPM Rotations par minute

TGA Thermogravimetric analysis = analyses thermogravimétrique TNF Tumor necrosis factor = facteur de nécrose tumorale

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Future changes in the incidence and prevalence of OA are difficult to predict. As incidence and prevalence rise with increasing age, extending life expectancy will result in greater numbers with OA. Actually, usual therapeutic approaches are really restricted because of important side effects with long-term use. Therefore, there is a need to develop improved formulations which are well tolerated, biocompatible and biodegradable. Ideally, these new treatments should be able to deliver locally sufficient amount of anti-inflammatory or analgesic drugs into the site of arthritic inflammation while stabilizing or better restoring the mechanical integrity of the joint. In this way, the objective of this project is to develop slow-release gels that are sterile, injectable, characterized by viscoelastic properties and capable to sustain the in situ release of both hydrophilic and lipophilic drugs. The intraarticular delivery combined to sustained-release property should be interesting to reduce the number of injection required while prolonging the local drug activity over weeks. For that purpose, glycerol monooleate (GMO), also called “monolein” was selected for its capacity to form highly viscous crystalline phase structures upon contact with an aqueous fluid (e.g. synovial fluid).

In the first step of this work, it was decided to develop and characterize hydro-lipidic gels based on the use of monolein and hyaluronic acid in order to provide in vitro sustained release of hydrophilic drugs such as clonidine and lipophilic drugs such as betamethasone. Initially, a compatibility study was performed on the main ingredients selected in order to check that there were not physico-chemical incompatibilities, which could be deleterious regarding to their stability in formulation. Then, the development of hydro-lipidic gels was initiated by considering on the first hand the solubility of each ingredient and on the other hand the syringeability, the rheological properties and the in vitro dissolution profiles obtained for the developed formulations. The objective of this preformulation program was to identify potential candidates that presented suitable syringeability while being able to sustain the release of drugs over weeks and being characterized by interesting viscoelastic properties for the long-term management of osteoarthritis. Moreover, several methods of quantification and characterization were developed in order to allow the physico-chemical properties (rheology, syringeability, water uptake, stability and dissolution profiles) of the developed formulations to be studied.

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Then, according to EMA recommendations, a fast and easy manufacturing process that could be applied in a cleanroom at industrial scale was validated in our Laboratory. Finally, according to these promising results obtained in vitro, a stability study was performed on the carrier alone and containing clonidine or betamethasone according to ICH recommendations described for products intended for storage in a refrigerator. In that purpose, several parameters such as the quantification of drugs, the pH, the molecular weight of hyaluronic acid, the dissolution profiles of drugs and the rheological properties of the formulations were recorded depending on time and conditions of storage. This stability study showed clearly the importance to adjust the pH value of the formulation. Indeed, it was demonstrated that a pH value of 6.5, adjusted with diluted NaOH, allowed the stability of the formulation to be significantly improved. During this first step of this project, our Laboratory initiated two new collaborations. On the first hand, collaboration with the Laboratory of Professor Siepmann (University of Lille 2 – Faculty of Pharmacy) was started for their expertise on mathematical modeling. On the other hand, collaboration with the Laboratory of Professor Jerôme (ULg – Faculty of sciences) was started for their expertise on macromolecular chemistry and more particularly on rheological properties.

In the second step of this work, it was decided to evaluate in vitro the safety and the efficiency of the developed carrier and formulations containing clonidine or betamethasone. In this way, it was suggested to test selected drugs and potential candidates formulations on equine polymorphonuclear leukocytes (PMN) by measuring the production of reactive oxygen species (ROS) by PMNs stimulated or not with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). For that purpose, our Laboratory initiated a new collaboration with the Laboratory of Professor Serteyn (ULg – Faculty of veterinary) for their expertise on equine PMNs and quantification of (ROS) produced in particular in inflammatory diseases.

This in vitro study has shown that no pro-inflammatory effect appeared by incubating carrier with unstimulated PMNs in comparison with the control assay. However, the production of ROS was quickly and considerably decreased when stimulated cells were placed in contact with carrier regardless on the incorporation of clonidine or betamethasone. This observation demonstrated that developed carrier provided a strong antioxidant effect, certainly by trapping the ROS produced. These results were very promising because that antioxidant effect of carrier could inhibit oxidative damages and might consequently potentiate the prevention of inflammatory conditions. Concerning the clonidine and betamethasone, only the last one provided significant inhibition of the ROS activity.

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For this purpose, this in vivo study was outsourced by TNO (Delft, Holland) and was designed as follow: (i) 0.9 % saline buffered (n=8); (ii) carrier (n=8); (iii) formulation containing betamethasone (n=8); (iv) Durolane® (n=8) a marketed product of HA. Surprisingly, it seemed that the control group (saline buffered) presented macroscopical and histological scores that were globally low according to literature. As a consequence, it was difficult to conclude about the efficiency of the developed treatments by considering only this pilot study. However, it is important to note that it seemed that the expected viscoelastic protection of the carrier to prevent the degradation of articular cartilage was not optimal regardless on the incorporation of betamethasone. Nevertheless, the histological analyses of synovial membranes from each treated groups demonstrated that there was no pro-inflammatory reaction. This meant that all formulations tested were well tolerated despite of the apparition of lumps (in 37.5 % of treated rabbits) that are probably due to both the high volume injected (900 µL) and an excessive and unexpected in situ water uptake of developed formulations based on GMO. However, this lack of rejection of the developed carrier could be very important since it allowed new perspectives to be considered. For example, other articular disorders could be targeted by incorporating drugs, for which in situ sustained release or mechanical protection could be beneficial.

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L’arthrose est une pathologie dont la prévalence et le coût ne font qu’augmenter dans notre société vieillissante. Les moyens thérapeutiques actuels étant fort limités suite à de sérieux effets secondaires à long terme, il existe réellement un besoin médical important de développer de nouveaux traitements locaux qui soient bien tolérés, biocompatibles et biodégradables. Idéalement, ceux-ci devraient être actifs au niveau du processus inflammatoire ou de la douleur tout en étant capable de stabiliser, voire de restaurer, l’intégrité mécanique de l’articulation.

Dans cette optique, l’objectif de ce projet a été de développer des systèmes hydrolipidiques stériles, injectables et viscoélastiques qui soient capables de prolonger in situ la libération de principes actifs hydrophiles et lipophiles. Cette caractéristique devait permettre de réduire le nombre d’injections nécessaires dans le cadre du traitement symptomatique de l’arthrose et de maintenir l’effet des composés sur un minimum de quatre à six semaines. Cette étude entre dans le cadre du projet JOINT-AIC entièrement financé par le programme BioWin de la Région Wallonne. Le développement, la validation des méthodes analytiques, l’évaluation des propriétés physico-chimiques ainsi que la préparation stérile des lots de formulation destinés aux tests in vitro et in vivo ont été réalisés au sein du Laboratoire de Galénique et Biopharmacie de la Faculté de Pharmacie de l’ULB.

Au cours de ce projet, il a donc fallu dans un premier temps développer et caractériser des formulations hydrolipidiques à base de monoléine et d’acide hyaluronique permettant une libération in vitro prolongée de principes actifs tels que la clonidine (hydrophile) et le dipropionate de bétaméthasone (lipophile). Une étude de compatibilité a ainsi été préalablement réalisée afin de s’assurer qu’aucun des constituants principaux de la formulation ne présentaient d’incompatibilité physico-chimique qui pourrait être délétère vis-à-vis de leur stabilité en formulation. Ensuite, le développement de préparations hydro-lipidiques a été initié en tenant compte, d’une part de la solubilité des différents composants et, d’autre part de l’injectabilité, des propriétés rhéologiques et des profils de libération de la clonidine obtenus à partir des gels développés. Cette étude visait à obtenir une composition de référence qui soit à la fois injectable et capable de libérer un principe actif hydrophile sur plusieurs jours, voire plusieurs semaines, tout en possédant des propriétés rhéologiques intéressantes dans le cadre d’une viscosupplémentation articulaire. Enfin, un protocole de fabrication en milieu aseptique a été développé et plusieurs méthodes pour étudier les propriétés physico-chimiques des gels développés telles que la rhéologie, l’injectabilité, l’indice de gonflement, la stabilité et les profils de libérations ont été mises en place.

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En effet, cette composition présentait un écoulement de type pseudoplastique et des propriétés rhéologiques qui lui procuraient une bonne injectabilité. De plus, cette formulation a démontré in vitro une excellente capacité à gélifier au contact de fluides aqueux et à ralentir efficacement sur plusieurs semaines la libération des différents principes actifs incorporés (clonidine et dipropionate de bétaméthasone). Nous pouvions, dès lors, envisager que celle-ci serait capable de gélifier in situ au contact d’un fluide physiologique tel que le liquide synovial. Ensuite, suivant les recommandations de l’EMA, nous avons décidé d’utiliser l’association d’une filtration stérilisante et d’une préparation en milieu aseptique pour obtenir des formulations qui répondaient aux exigences en matière de préparation parentérale. C’est ainsi qu’un protocole de fabrication stérile de nos gels a été développé par nos soins en vue d’une éventuelle mise à l’échelle industrielle. Enfin, une étude de stabilité sur une année, suivant les normes ICH décrites pour des formulations destinées à être conservées au frigo, a été réalisée sur différents véhicules développés et contenant soit la clonidine, soit le dipropionate de bétaméthasone. Dans cette optique, plusieurs paramètres, tels que le dosage en principe actif, l’évolution du pH et du poids moléculaire de HA, le profil de libération ainsi que la rhéologie des formulations ont été évalués au cours du temps aux différentes conditions de conservation testées. Cette étude a permis de démontrer toute l’importance d’ajuster le pH de la préparation pour prévenir l’hydrolyse de l’HA, et cela indépendamment de l’incorporation de principe actif. Ainsi, il a pu être montré que l’ajustement du pH du véhicule à 6,5 à partir de NaOH dilué permettait d’améliorer considérablement la stabilité de la formulation puisqu’aucune modification significative de ses différents paramètres physico-chimiques et teneurs n’a été observée après un an de conservation à 5 et à 25 °C (60% HR) mais également après six mois à 30 °C (65% HR). Au cours de cette première partie, deux collaborations ont été initiées, l’une avec le Laboratoire du Prof. Siepmann de l’Université de Lille 2 et l’autre avec le Prof. Jerôme de l’Université de Liège. Avec l’aide du Prof. Siepmann, il a été possible de mettre au point un modèle mathématique pour caractériser les profils de libération des principes actifs à partir des différents véhicules développés. Le Prof. Jerôme a, quant à elle, mis à notre disposition un rhéomètre qui a permis d’approfondir nos connaissances sur les propriétés rhéologiques et viscoélastiques des formulations.

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Cette étude in vitro a démontré que les cellules restaient viables au moins pendant quatre heures lorsqu’elles étaient exposées à la matrice épurée de ses solvants. Ensuite, de manière surprenante, il a même pu être démontré que le véhicule permettait à la fois de prévenir et de réduire significativement la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les neutrophiles équins lorsque ceux-ci étaient stimulés au phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Cette propriété peut être d’un grand intérêt dans le cadre de la prise en charge de l’arthrose car cette activité antioxydante pourrait permettre d’inhiber les dommages oxydatifs générés par les ROS et ainsi prévenir les dommages liés au développement du processus inflammatoire et qui peut, à long terme, s’avérer délétère pour les tissus environnants tels que le cartilage. Cette propriété du véhicule semble trouver son origine dans la monoléine qui, de par sa composition en alpha-tocophérol (200 ppm), présente également une activité antioxydante vis-à-vis des ROS. Toutefois, une action synergique liée à l’HA, à l’huile de soja ou à l’alpha-tocophérol incorporés aux formulations, n’est pas à exclure. Enfin, parmi les deux principes actifs sélectionnés, seul le dipropionate de bétaméthasone a montré une inhibition significative de la production des ROS.

Enfin, en tenant compte des résultats obtenus sur cellules, une étude in vivo pilote a été réalisée sur base d’un modèle de lapins. Cette étude visait à vérifier la tolérance ainsi que l’efficacité en prophylaxie de l’arthrose du véhicule développé ainsi que de la formulation contenant le dipropionate de bétaméthasone. Dans ce but, quatre groupes d’animaux (n=8) ont été constitués pour chacun des traitements testés : (i) groupe témoin : 0,9 % tampon salin pH 7,4 ; (ii) véhicule à base de GMO développé; (iii) véhicule contenant du dipropionate de bétaméthasone ; (iv) groupe référence : Durolane®. Cette étude a été réalisée avec l’aide du Laboratoire du Prof. Henrotin de l’Université de Liège. L’hébergement des animaux ainsi que les actes chirurgicaux ont, quant à eux, été sous-traités par TNO (Delft, Pays-Bas).

Tableau 1 : Résumé des classes d’articulations

Classes stucturales

Caractéristiques

structurales Types Mobilité

Synoviale

Extrémité ou partie d’os recouverte de cartilage articulaire et abritée dans

une capsule articulaire tapissée d’une membrane

synoviale 1) Plane 4) Condylaire 2) Trochléenne 5) En selle 3) Trochoïde 6) Sphéroïde Entièrement mobile ; mouvements permis selon la forme de l’articulation

Cartilagineuse Extrémité ou partie d’os

réunies par du cartilage

1) Synchondrose (cartilage hyalin)

2) Symphyse (cartilage fibreux)

Immobile

Légèrement mobile

Fibreuse

Extrémités ou parties d’os réunies par des

fibres de collagène

1) Suture (fibres courtes) 2) Syndesmose (fibres plus

longues) 3) Gomphose (desmodonte) Immobile Légèrement mobile et immobile Immobile Source : Marieb E. N., Anatomie et physiologie humaine, 6ème édition, 2005

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I. GENERALITES SUR L’ARTICULATION

I.1. ANATOMIE DE L’ARTICULATION

I.1.1. Généralités

Les articulations permettent de relier les os entre eux. Elles confèrent une mobilité du squelette et ont, dans certains cas, un rôle de protection (ex. crâne, cage thoracique). Leur classification structurale fondée sur l’examen des matériaux qui la composent et sur la présence ou l’absence d’une cavité articulaire permet d’en distinguer 3 types [Marieb, 2005]. En effet, dans le corps humain, nous retrouvons des articulations dites fibreuses, cartilagineuses et synoviales (Tableau 1). La classification fonctionnelle de ces articulations prend en compte le degré de mouvement et distingue ainsi les articulations immobiles (synarthroses), semi-mobiles (amphiarthroses) et mobiles (diarthroses) [Marieb, 2005]. En règle générale, les articulations fibreuses sont immobiles tandis que les articulations synoviales sont totalement mobiles. Les articulations cartilagineuses offrent, quant à elles, des exemples d’articulations immobiles et semi-mobiles (Tableau 1).

La majorité des articulations du corps, notamment celles des membres (ex : genou, hanche, coude), étant exclusivement des articulations de type synovial, nous nous intéresserons particulièrement à celles-ci. En effet, étant donné leur complexité, leur fragilité plus ou moins importante et leur grande mobilité, ces articulations peuvent être sujettes à un déséquilibre homéostatique pouvant conduire à certaines pathologies articulaires telles que l’arthrose, la mono ou polyarthrite, la polyarthrite rhumatoïde, etc [Marieb, 2005].

I.1.2. L’articulation synoviale

Au niveau des articulations synoviales, les os s’unissent par l’intermédiaire d’une cavité remplie de liquide synovial. Cette structure permet une grande liberté de mouvement. Les articulations synoviales sont composées de 5 parties (Figure 1) :

- Le cartilage articulaire : Il recouvre la surface des os qui s’articulent. Il est lisse et spongieux ce qui lui permet d’absorber la compression que subit quotidiennement l’articulation et de prévenir l’écrasement des extrémités osseuses.

- La cavité articulaire : Il s’agit de l’espace situé entre les deux extrémités osseuses qui se font face et qui est rempli de liquide synovial.

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- Le liquide synovial : Il provient principalement du sang empruntant les capillaires présents au sein de la membrane synoviale et remplit l’espace de la cavité articulaire. Il a une composition proche de celle du plasma appauvri en protéines de haute masse moléculaire. D’autre part, les cellules de la membrane synoviale produisent l’acide hyaluronique, ce qui lui procure des propriétés viscoélastiques et lubrifiantes. Le liquide synovial est également présent à l’intérieur des cartilages articulaires où il forme une pellicule lisse qui lubrifie leurs surfaces libres, nourrit leurs cellules et réduit les frictions. Des modifications de la composition du liquide synovial peuvent influencer l’évolution de l’usure de l’articulation.

- Les ligaments : Ils permettent de renforcer l’articulation et d’améliorer la stabilité de celle-ci.

I.2. STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU TISSU CARTILAGINEUX

I.2.1. Les différents tissus cartilagineux chez l’humain adulte

Le cartilage est composé d’un seul type de cellule, les chondrocytes, issus à partir des chondroblastes, et d’une matrice extracellulaire (MEC) dont la composition va permettre de différencier trois types de cartilage [Mallein-Gerin et coll., 1996]. Le cartilage dit « hyalin » est le plus représenté à travers le corps humain et est caractérisé par une MEC riche en fibres de collagène de type II, IX et XI. Il se retrouve principalement au niveau des surfaces osseuses des articulations et au niveau du nez et des côtes. Le cartilage dit « élastique » est caractérisé, comme son nom l’indique, par une MEC riche en fibres élastiques qui lui permettent de conserver sa structure, comme au niveau du pavillon de l’oreille externe par exemple. Enfin, le cartilage dit « fibreux » est, quant à lui, caractérisé par une MEC riche en fibres de collagène de type I qui assurent une bonne résistance aux forces de traction et de compression. Il constitue les disques intervertébraux et les ménisques. Nous nous intéresserons ici d’avantage à la structure et à la composition du cartilage hyalin que l’on retrouve notamment au niveau des articulations synoviales (ex : genou, hanche, coude, etc).

I.2.2. Composition du cartilage hyalin

D’un point de vue rhéologique, l’environnement naturel des cellules d’un tissu peut se présenter soit sous forme liquide, soit sous forme solide. Dans les deux cas, ce qui entoure les cellules est appelé « matrice ».

Figure 2 : Répartition moyenne des différents constituants du cartilage articulaire [Chevalier et Richette, 2005 ; Bhosale et Richardson, 2008]

Figure 3 : Morphologie du chondrocyte caractérisé par son noyau central volumineux et son cytoplasme contenant un réticulum endoplasmique et un appareil de Golgi bien développés ainsi que des mitochondries, des ribosomes, des lysosomes et des vacuoles lipidiques et glycogéniques [www.master-biomed.ethz.ch]

Figure 4 : La MEC du cartilage hyalin est composée de chaînes de protéoglycans qui sont attachées le long de l’acide hyaluronique qui lui-même s’enroule autour des fibres de

collagène [Moreland, 2003]

65-85% 10-20%

1-10%

10-20% _1%

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En ce qui concerne le cartilage hyalin, il s’agit d’un tissu conjonctif non vascularisé et non innervé. Il est constitué de deux éléments principaux (Figure 2) : les chondrocytes, issus à partir des chondroblastes, et la MEC composée principalement d’eau et d’un réseau de fibres de collagène de type II et de chaînes de protéoglycans qui sont, tous les deux, produits par les chondrocytes [Chevalier et Richette, 2005 ; Bhosale et Richardson, 2008].

 Les chondroblastes

Ce sont les cellules les plus abondantes dans le cartilage en croissance. En effet, les chondroblastes sont des cellules capables de se diviser et qui produisent de la MEC jusqu’à ce que le squelette cesse de grandir, à la fin de l’adolescence. A maturité, ces chondroblastes ne se divisent plus et sont dès lors appelés chondrocytes [Marieb, 2005].

 Les chondrocytes

Figure 5 : Schématisation de la structure du cartilage hyalin décrivant la disposition et la forme des chondrocytes (à gauche) et des fibres de collagène (à droite) au niveau de la zone superficielle (STZ), de la zone intermédiaire (Middle zone), de la zone profonde (Deep zone)

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 La matrice extracellulaire (MEC) du cartilage hyalin

La MEC est principalement constituée d’eau et d’un réseau de fibres de collagène de type II et de chaînes de protéoglycans (Figure 4). Ces chaînes de protéoglycans, aussi appelée aggrécans, se fixent le long de l’acide hyaluronique qui, lui-même, s’enroule autour des fibres de collagène (Figure 4). Les aggrécans présentent la particularité de posséder trois régions bien distinctes : une région protéique qui facilite leur fixation sur l’acide hyaluronique, une région riche en kératine sulfate et une autre riche en chondroïtine sulfate qui confèrent au cartilage sa compressibilité et son élasticité (Figure 4).

I.2.3. Structure du cartilage hyalin

D’un point vue structurel, le cartilage hyalin peut être décomposé en quatre couches histologiques bien distinctes depuis sa surface jusqu’à l’os sous-chondral. En effet, selon la profondeur, il est possible d’observer plusieurs modifications de la forme et de la taille des chondrocytes, de l’orientation des fibres de collagène, ainsi que du contenu en eau et en chaînes de protéoglycans [Sintzoff et coll., 1999 ; Chevalier et Richette, 2005]. Ainsi peuvent être différenciées : la région tangentielle ou superficielle, la région intermédiaire ou transitionnelle, la région profonde ou radiale et enfin, la région calcifiée qui se trouve interposée entre la région profonde et l’os sous-chondral (Figure 5) :

Zone tangentielle : Cette région est composée principalement d’eau (elle est la couche qui en contient la plus grande concentration) et des chondrocytes ellipsoïdaux enchâssés dans un réseau dense de fibres de collagène disposées parallèlement à la surface. Cette disposition permet d’obtenir la meilleure résistance à la pression.

Zone intermédiaire : Cette région est composée de fibres de collagène et de chondrocytes sphériques suivant une orientation oblique et variable beaucoup moins structurée en comparaison avec la couche tangentielle.

Zone profonde : Cette région représente le plus grand volume des quatre couches et est composée de fibres de collagène plus larges et de chondrocytes disposés perpendiculairement à la surface articulaire. Cette région contient très peu d’eau mais une quantité importante de chaînes de protéoglycans (la plus haute). Cette richesse lui permet d’obtenir une grande résistance aux forces de compression.

Figure 6 : Schématisation de l’effet de la charge sur le cartilage. (1) les protéoglycanes baignent au sein de la matrice extracellulaire qui compose le cartilage ; (2) sous l’effet d’une charge, les protéoglycanes se compriment et l’eau sort de la zone de compression, notamment vers la cavité articulaire ; (3) à la fin de la charge, retour à l’état initial [Mazières, 2013].

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De plus, il semblerait que cette Tidemark présente de petits espaces qui permettent le transfert de nutriments depuis l’os sous-chondral jusqu’aux partie non-calcifiée du cartilage [Redler et coll., 1975].

A la surface du cartilage, il existe également une couche acellulaire dénommée lamina

splenda qui recouvre la région tangentielle [Chevalier, 1998]. Cette lamina splenda est très

importante car elle joue un rôle majeur dans l’accrochage de macromolécules telles que l’acide hyaluronique et la lubricine, présentes dans le liquide synovial. Elle constitue une couche protectrice pour le cartilage.

I.2.4. Nutrition du cartilage

Etant donné l’absence de vascularisation du tissu cartilagineux, l’apport en substrats vers les chondrocytes ne peut se faire que par diffusion, à travers la MEC, des nutriments de faible masse moléculaire présents dans le liquide synovial. Cette diffusion à travers le tissu cartilagineux est favorisée par les pressions cycliques qui permettent d’augmenter l’efficacité des échanges de liquide entre le cartilage hyalin et la cavité articulaire. En effet, lorsque le cartilage n’est pas sous pression, les mouvements d’eau sont relativement faibles. Par contre, lorsqu’une pression est appliquée, lors d’une mobilisation de l’articulation par exemple, l’eau contenue dans le tissu cartilagineux est chassée vers les régions du cartilage non soumises à la pression et notamment vers la cavité articulaire en emportant avec elle les déchets métaboliques des chondrocytes (Figure 6). Ce phénomène étant réversible, dès que la charge cesse, un flux inverse se crée, ramenant le cartilage à son hydratation initiale et amenant avec lui les nutriments tels que le glucose, essentiels à la survie et à la synthèse cellulaire.

I.2.5. Homéostasie du tissu cartilagineux

Le renouvellement de la MEC et, par conséquent du cartilage hyalin, est un phénomène extrêmement lent. En temps normal, il existe toutefois un équilibre entre la dégradation et la synthèse du cartilage qui, comme nous l’avons vu précédemment, est régulé par les chondrocytes. Un déséquilibre peut néanmoins s’installer, menant à différentes pathologies articulaires telles que l’arthrose, la mono ou polyarthrite, la polyarthrite rhumatoïde, etc [Marieb, 2005].

I.3. LA MEMBRANE SYNOVIALE

I.3.1. Morphologie

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I.3.2. Histologie

La membrane synoviale est un tissu conjonctif lâche qui s’organise en deux couches se différenciant par leurs compositions cellulaires :

- La couche en contact avec la cavité articulaire aussi appelée « intima » - La couche en contact avec la capsule fibreuse aussi appelée « subintima »

 L’intima

Elle est composée de cellules appelées « synoviocytes ». Il en existe deux types qui se distinguent par leurs fonctions [Iwanaga et coll., 2000 ; Schneider et coll., 2007]:

- Les synoviocytes de type A sont décrits comme des cellules libres qui ont une

fonction proche de celle des macrophages. En effet, leur cytoplasme contient un appareil de Golgi développé et est riche en mitochondries, grandes vacuoles et lysosomes. On les retrouve principalement en surface, proche de la cavité articulaire (Figure 7).

- Les synoviocytes de type B sont, quant à eux, caractérisés par l’existence d’un

réticulum endoplasmique très développé qui rend compte de leur implication importante dans la synthèse et la sécrétion des différents constituants de la MEC et du liquide synovial. Leur localisation à travers l’intima est plus homogène comparée à celle de leurs homologues de type A (Figure 7).

 La subintima

A l’inverse de l’intima, la subintima est composée principalement de fibroblastes, de histiocytes, de mastocytes et de fibres de collagène et est beaucoup plus vascularisée. Elle est, par conséquent, le siège des échanges avec le sang.

I.3.3. Physiologie

La membrane synoviale remplit plusieurs fonctions importantes pour l’articulation. Elle intervient notamment dans sa trophicité, participe à ses propriétés mécaniques et à sa stabilité. Ensuite, elle constitue une barrière de filtration et d’échanges avec le sang qui lui permet de synthétiser et de sécréter le liquide synovial jouant un rôle important dans le maintien de l’homéostasie de l’articulation. Enfin, elle intervient dans la défense contre les agressions extérieures [Iwanaga et coll., 2000 ; Schneider et coll., 2007].

Tableau 2: Comparaison des compositions du plasma en conditions normales et du liquide synovial en conditions normales et arthrosiques [Gaignaux (2014) adapté de Madea et coll., 2001 ; Gerwin et coll., 2006 ; Fam et coll., 2007 ; Calop et coll., 2008 et Perlemuter et Perlemuter, 2010]

Paramètres mesurés Liquide synovial Plasma

Normal Arthrosique Paramètres physiques

Volume (mL/genou pour le liquide synovial) (mL/kg du poids corporel pour le plasma)

0,5 - 2 > 3,5 39 - 44

Viscosité (mPa.s) > 300 < 300 1,4

Osmolarité (mOsm/l) ≈ 296 Inchangé 295 - 310

pH 7,4 Inchangé 7,35 - 7,45

Composants cellulaires

Erythrocytes (cellules * 109/l) < 2 Inchangé 4900b Leucocytes (cellules * 109/l) < 0,2 < 3 7,0 – 10,0b Monocytes/macrophages (% de leucocytes) ≈ 60 ?a 3 - 8b Lymphocytes (% de leucocytes) ≈ 30 ?a 25 - 40b Neutrophiles (% de leucocytes) ≈ 10 (<25) < 25 52 - 68b Paramètres biochimiques Protéines totales (g/L) 10 - 28 17 - 57 65 - 80 Albumine (g/L) 8 - 13 Inchangé 35 - 45

Immunoglobulines (% de la concentration plasmatique) ≈ 50 Inchangé 100 Lipoprotéines totales (% de la concentration plasmatique) ≈ 40 > 40 100

Acide hyaluronique (g/L) 2 - 4 < 2 4,2 * 10-6

Lubricine (g/L) 0,05 ?a ?a

Glucose (g/L) 0,63 - 1,1 Inchangé 0,63 - 1,1

Urée (g/L) 0,15 - 0,45 Inchangé 0,15 - 0,45

Lactate (mmol/L) 1,0 – 1,8 < 0,38 1,0 – 1,8

Calcium (mmol/L) 2,0 - 3,0 Inchangé 2,0 - 4,0

Chlore (mmol/L) 86,5 - 109,5 Inchangé 95 - 105

Sodium (mmol/L) 134 - 154 Inchangé 135 - 145

Potassium (mmol/L) 3,5 - 4,5 Inchangé 3,5 - 4,5

Fer (µmol/kg) ≈ 5,2 ?a 9 - 30

Zinc (µmol/kg) ≈ 2,7 Inchangé 16 - 20

Cuivre (µmol/kg) ≈ 4,3 Inchangé 12 - 24

a

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Ce dialysat de plasma sanguin, pauvre en protéines de haute masse moléculaire, est alors utilisé par les synoviocytes de type B pour sécréter le liquide synovial. En effet, ceux-ci sont capables, grâce à leur réticulum endoplasmique très développé, d’en synthétiser les différents éléments que sont le collagène, la fibronectine, l’acide hyaluronique ainsi que les protéoglycans et de les sécréter dans la cavité articulaire.

I.3.3.2. Rôle sur la trophicité de l’articulation

Le cartilage n’étant pas vascularisé, celui-ci se sert du liquide synovial, synthétisé et sécrété par les synoviocytes, pour se nourrir et éliminer ses déchets métaboliques. La membrane synoviale joue donc de manière indirecte un rôle majeur dans l’homéostasie de l’articulation.

I.3.3.3. Rôle de défense contre les agressions extérieures

D’un point de vue physiologique, les synoviocytes de type A, qui composent la membrane synoviale, sont capables d’absorber et de dégrader les constituants extracellulaires, les débris cellulaires/cartilagineux, les microorganismes, ainsi que les éventuels antigènes présents dans le liquide synovial et dans la matrice extracellulaire. Ils permettent donc, dans des conditions normales, d’assumer un rôle défensif contre les agressions extérieures.

I.4. LE LIQUIDE SYNOVIAL

La matrice extracellulaire peut se présenter soit sous forme solide, le cartilage articulaire, soit sous forme liquide selon sa composition en macromolécule qui lui confère ses propriétés rhéologiques. Le liquide synovial fait partie des matrices dites liquides au même titre que l’humeur aqueuse de l’œil.

En effet, celui-ci est composé d’un ultrafiltrat du plasma sanguin et de diverses substances synthétisées et sécrétées par la membrane synoviale. Son rôle principal est de lubrifier les surfaces du cartilage articulaire afin d’en réduire les frictions et d’éviter ainsi leur érosion prématurée. Il sert également, comme nous l’avons vu précédemment, à nourrir le tissu cartilagineux.

I.4.1. Composition du liquide synovial

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Le liquide synovial contient différents éléments spécifiques tels que les chaînes de protéoglycans et l’acide hyaluronique (HA) qui sont synthétisés et sécrétés par les synoviocytes de type B. C’est notamment HA qui confère ses propriétés rhéologiques importantes au liquide synovial. En effet, il s’agit d’un polysaccharide de haute masse moléculaire, composé d’acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamine (Figure 8). Dans des conditions normales, le liquide synovial d’un genou humain contient entre 2 et 4 g/L d’HA (Tableau 2) [Balazs, 1967 ; Levick, 1996] caractérisé par une masse moléculaire d’environ 2 à 10 MDa suivant l’espèce et la localisation de l’articulation [Dahl, 1985 ; Ghosh et Guidolin, 2002]. Il a été démontré que cette concentration en HA au niveau des articulations diminue avec l’âge mais également lorsqu’une pathologie articulaire telle que l’arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde est diagnostiquée (Tableau 2). De plus, l’évolution de sa masse moléculaire semble également être affectée par l’âge mais surtout par la présence d’une pathologie articulaire sous-jacente. En effet, on observe une diminution de celle-ci lors du vieillissement et en cas d’arthrose ou de polyarthrite rhumatoïde [Decker, 1959 ; Balazs, 1974 ; Gomez et Thurston, 1993 ; Ghosh et Guidolin, 2002 ; Fam et coll., 2007 ; Bastow et coll., 2008].

Compte tenu de sa masse moléculaire élevée, ce polymère occupe un volume extrêmement large lorsqu’il est mis en solution dans un milieu physiologique. En effet, si on considère une telle solution comme un ensemble de molécules individuelles proches, sans qu’aucune d’entre elles ne se chevauchent, l’entièreté du volume de cette même solution sera occupé pour une concentration de seulement 0,33 g/L [Balazs, 1974]. La concentration physiologique en HA au niveau du liquide synovial étant nettement supérieure à 0,33 g/L chez l’individu sain, ce milieu peut être considéré comme un réseau dense de chaînes d’HA qui s’entrecroisent et interagissent entre-elles par des liaisons non covalentes et des ponts hydrogènes. Ce sont les propriétés de ce réseau d’HA qui confèrent au liquide synovial ses propriétés viscoélastiques qui lui permettent à la fois de lubrifier l’articulation au repos et d’amortir les chocs lors de sa mobilisation.

I.4.2. Propriétés viscoélastiques du liquide synovial

Figure 9 : Modules d’élasticité (trait plein) et de viscosité (pointillé) du liquide synovial normal chez l’individu jeune et âgé. [adapté de Fam et coll., 2007]

Figure 10 : Plusieurs facteurs contribuent au déséquilibre de l’homéostasie du tissu cartilagineux. BMP, bone morphogenic protein; bFGF, basic fibroblastic growth factor; IGF, insulin-like growth factor; IL, interleukin; MMP, matrix metalloproteinase; Pg, proteoglycan; TGF, transforming growth factor; TIMP, tissue inhibitor of metalloproteinases; TNF, tumor

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Le liquide synovial sain, chez un individu jeune ou vieux, présente, à basses fréquences, un G’’ (module de viscosité) qui prédomine sur G’ (module d’élasticité) ce qui lui confère un caractère visqueux lui permettant de s’écouler entre les cartilages articulaires et de lubrifier ceux-ci (Figure 9). Par contre, lorsque la contrainte augmente, le phénomène s’inverse en un point appelé crossing-over. En effet, le G’ devient prédominant par rapport au G’’ ce qui donne au liquide synovial des propriétés élastiques qui l’empêchent de s’écouler entre les cartilages. Ceci lui permet d’une part de protéger la membrane synoviale et d’autre part d’amortir les chocs que subissent les articulations lorsque la mobilité de celles-ci est accélérée.

II. L’ARTHROSE

II.1. GENERALITES

L’arthrose est une affection chronique qui se manifeste par des douleurs persistantes causées par l’usure anormale du cartilage et de l’ensemble de l’articulation. Il s’agit d’une pathologie dégénérescente qui implique une perte progressive et irréversible du cartilage articulaire, des changements sous-jacents au niveau des os, des modifications morphologiques et physiologiques au niveau de la membrane synoviale ainsi qu’une réduction des propriétés viscoélastiques du liquide synovial. En effet, il apparaît clairement aujourd’hui que cette pathologie prend son origine à travers un déséquilibre progressif qui s’installe entre la dégradation de la matrice extracellulaire qui compose le cartilage et sa synthèse [Balazs, 1974 ; Sarzi-Puttini et coll., 2005 ; Gerwin et coll., 2006 ; Aigner et coll., 2007]. Toutefois, d’autres structures de l’articulation telles que l’os sous-chondral, ainsi que la membrane synoviale, semblent également jouer un rôle important dans la progression de cette pathologie [Aigner et coll., 2007 ; Roach et coll., 2007 ; Schneider et coll., 2007].

Dans la plupart des cas, l’origine de l’arthrose est inconnue, on parle alors d’arthrose primaire ou idiopathique. Cependant, certaines autres pathologies articulaires inflammatoires (ex. arthrites, goutte, lupus) peuvent prédisposer à l’arthrose. Il en va de même pour les blessures répétées et/ou les interventions chirurgicales sur une même articulation. Lorsque l’arthrose se développe suite à l’une ou l’autre de ces situations, on parlera alors d’arthrose secondaire [Buckwalter et Martin, 2006]. A côté des facteurs pathologiques et mécaniques qui peuvent prédisposer à l’arthrose, il semble aujourd’hui avéré que plusieurs autres causes métaboliques vont contribuer au déséquilibre de l’homéostasie du tissu cartilagineux et à son érosion progressive (Figure 10).

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Les aggrécanases, un groupe récemment identifié de métalloprotéases dégradant les protéoglycans, semblent également jouer un rôle important dans l’évolution de la pathologie. En effet, ces enzymes protéolytiques qui font partie de la famille des ADAMs (A Disintegrin And Metalloprotease) dégradent notamment les chaînes d’aggrécans qui composent la matrice cartilagineuse et confère sa compressibilité et son élasticité au cartilage [Tortorella, 2001]. Or, la perte en aggrécan au niveau de la MEC est l’un des premiers signes physiopathologiques observés en cas d’arthrose.

La présence de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α, etc.) et de radicaux libres de l’oxygène (ROS) et d’oxyde nitreux (NO), associés à une inflammation locale, contribue également à l’accélération du catabolisme du cartilage et à la mort prématurée des chondrocytes [Moreland, 2003 ; Sarzi-Puttini et coll., 2005 ; Martin et coll., 2009 ; Goodwin et coll., 2010 ; Ramakrishnan et coll., 2010]. De plus, au cours de l’évolution de l’arthrose, le pH des fluides qui entourent le cartilage peut diminuer ce qui active les cathepsines B, L et K synthétisées par les chondrocytes, leur permettant ainsi de participer à la dégradation accrue du cartilage articulaire.

II.2. EPIDEMIOLOGIE

Figure 11 : Schématisation des différences anatomiques entre un genou sain et les 4 stades de la maladie arthrosique ; (1) genou sain, (2) Stades 1 et 2 début de l’érosion progressive du cartilage ; (3) Stades 3 et 4 avec disparition locale du cartilage et début de l’atteinte osseuse

[www. bio-synergie.eu]

Figure 12 : Erosion du cartilage au niveau d’un genou arthrosique pouvant impliquer une inflammation de la cavité articulaire et un épanchement de la synovie [www.bio-synergie.eu]

1

2

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II.3. FACTEURS DE RISQUE

L’âge et le vieillissement global de la population mondiale représentent les causes principales de l’augmentation de la prévalence de ce type de pathologie. Cependant, il existe d’autres facteurs de risque tels que le sexe et l’obésité [Arden et Nevitt, 2006 ; Symmons et coll., 2006]. Dans certains cas d’arthrose, un facteur héréditaire semble aussi exister. Enfin, la répétition d’un traumatisme ou microtraumatisme, par exemple au cours d’activités physiques, peut également devenir un élément déclenchant.

II.4. MODIFICATIONS AU NIVEAU DU CARTILAGE

L’arthrose n’est pas une maladie à part entière mais plutôt un syndrome ou l’aboutissement ultime de diverses atteintes touchant l’articulation.

La Figure 11 reprend les étapes de l’évolution de l’arthrose du genou. On remarque au cours des différents stades (1 à 4) une fissuration et une érosion progressives du cartilage qui conduit à l’apparition de frottements entre les os. Cette atteinte va entraîner l’apparition d’une décalcification et d’une condensation osseuse au niveau des zones d’érosion du cartilage. Ce phénomène est appelé « ostéosclérose sous-chondrale » et donne lieu à des déformations anatomiques importantes de l’articulation. Lorsqu’elle devient symptomatique, l’arthrose entraîne douleur et raideur articulaire associées à un éventuel épanchement de la synovie et peut également présenter des degrés variables d’inflammation locale (Figure 12).

II.5. MODIFICATIONS AU NIVEAU DE LA MEMBRANE SYNOVIALE

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II.6. MODIFICATIONS AU NIVEAU DU LIQUIDE SYNOVIAL

En cas d’arthrose, la composition, le volume ainsi que les propriétés rhéologiques du liquide synovial vont être modifiés. Ces changements apparaîtront d’autant plus vite qu’une inflammation locale est présente. Au niveau de sa composition, la concentration en protéines et lipoprotéines augmente (Tableau 2). Des protéines plasmatiques de haute masse moléculaire, telles que le fibrinogène, finissent par s’y retrouver. C’est d’ailleurs pour cette raison qu’après ponction du liquide synovial, celui-ci peut coaguler. Des enzymes provenant des lysosomes, des leucocytes et des cellules détruites sont également retrouvées. Dans des conditions pathologiques, le liquide synovial est souvent dit « plasma-like », en raison de sa composition qui se rapproche de celle du plasma sanguin.

Au niveau de ses propriétés rhéologiques, le liquide synovial d’une articulation arthrosique perd une majeure partie de ses propriétés viscoélastiques qui lui permettaient de protéger la membrane synoviale, ainsi que le cartilage contre les stress mécaniques [Balazs, 1974 ; Fam, 2007]. En effet, en cas d’arthrose, le liquide synovial finit par ne plus présenter de crossing-over entre ses modules d’élasticité (G’) et de viscosité (G’’). De plus, les valeurs de G’ et de G’’ sont nettement plus basses que celles observées pour un liquide synovial sain (Figure 13). Dans ces conditions, le liquide synovial n’est donc plus capable d’exercer son rôle correctement et il s’en suit une accélération du processus d’érosion mécanique des surfaces cartilagineuses. Ces modifications des propriétés viscoélastiques du liquide synovial arthrosique sont principalement liées à HA. En effet, l’épanchement de synovie entraîne notamment une diminution de la concentration en HA liée à un phénomène de dilution. De plus, si une inflammation locale est présente, l’abaissement du pH du liquide synoviale va favoriser une activité enzymatique catabolique ce qui provoque une diminution de la concentration et de la masse moléculaire de HA (Tableau 2). Ces deux changements physiologiques sont en partie responsables des modifications apportées aux propriétés rhéologiques du liquide synovial.

II.7. LES FORMES CLINIQUES

Figure 14 : Effet sur la douleur (ESpain) des approches non-pharmacologiques en