Faculté de Pharmacie

(1)

Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques

Caractérisation du rôle des chémokines de type CXCL dans le comportement biologique de deux types de cancers naturellement

résistants à l’apoptose, le cancer de l’œsophage et le gliome

Céline Bruyère

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Prof. Robert Kiss

co-Promoteur : Prof. Marc Van Damme

Département de Bioanalyse et Toxicologie Pharmaceutique Laboratoire de Toxicologie

Composition du jury :

Président : Prof. Jacques Dubois Secrétaire : Prof. Véronique Fontaine Prof. Stéphanie Pochet

Membres du jury externe:

Prof. Eric Sariban (Hôpital des Enfants Reine Fabiola, ULB) Prof. Didier Serteyn (Faculté Vétérinaire de l’Université de Liège)

Faculté de Pharmacie

(2)

(3)

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le professeur Marc Van Damme pour m’avoir acceuillie au sein de son service pour réaliser ma thèse de doctorat. Je tiens ensuite à remercier mon promoteur, le Professeur Robert Kiss pour ses conseils, le temps qu’il a consacré à mon travail, la confiance qu’il m’a accordée et pour son encadrement. Merci de m’avoir appris à avoir confiance en moi et en mon travail. Je sors grandie de ces quatre années grâce à vous.

Je souhaite également remercier tout particulièrement le docteur Florence Lefranc et le docteur Véronique Mathieu pour tout le temps consacré à mon travail, leur patience ainsi que les judicieux conseils qu’elles m’ont prodigués. Merci aussi à Delphine Lamoral-Theys pour son soutien tout au long de ma thèse. Merci à toutes les trois pour votre amitié.

Merci également à tous les membres de notre équipe : Gwendoline Van Goietsenoven, Alexandra Iuonescu, Thierry Gras, Benjamin Lallemand, Touria Lamkami, Christine Decaestecker, Marina Bury, et Manuela De Lorenzi, avec une mention spéciale pour Laetitia Moreno, pour l’aide et le soutien qu’ils m’ont apporté tant sur le plan technique et scientifique que personnel. Un merci particulier également à Tatjana Mijatovic pour ses précieux conseils et ses encouragements.

Je tiens également à remercier mes amis Ago, Benoît, Florence, Nada, Nadia, Fabrice, Pierre et Aurore pour leur soutien, leur compréhension et surtout pour toutes les bonnes rigolades. Grâce à vous, cette étape aura été plus facile à franchir.

Enfin, merci à ma famille, ma marraine Nicole et mon parrain Boualem, mon papi et ma mami, à mes petites soeurs pour m’avoir suivie et encouragée tout au long de ce travail mais bien sûr et surtout à mon papa et ma maman pour avoir toujours cru en moi et avoir toujours été là dans les bons et dans les moins bons moments.

(4)

(5)

Table des matières

Abréviations ... 10

But du Travail ... 11

Résumé ... 12

Introduction ... 14

I. Le cancer ... 14

1. Généralités... 14

2. Epidémiologie ... 15

a. Les cancers cérébraux ... 15

b. Les cancers de l’oesophage ... 15

3. Hisopathologie des tumeurs ... 16

a. Les cancers cérébraux et plus particulièrement les gliomes ... 16

4. Traitements ... 17

a. Les cancers cérébraux et plus particulièrement les gliomes ... 17

i. Chirurgie ... 17

ii. Radiothérapie ... 18

iii. Chimiothérapie ... 18

iv. Immunothérapie et vaccinothérapie ... 19

i. Chirurgie ... 20

ii. Radiothérapie ... 21

iii. Chimiothérapie ... 21

II. Vie et mort d’une cellule cancéreuse ... 22

1. En quoi une cellule cancéreuse se distingue-t-elle d’une cellule normale ? ... 22

2. La prolifération cellulaire ... 26

3. Les diverses formes de morts cellulaires ... 26

a. L’apoptose ... 26

b. Le processus irréversible d’autophagie ... 28

c. La perméabilisation des membranes des lysosomes ... 29

(6)

(7)

III. Le problème de la résistance des cancers à l’apoptose ... 31

2. Deux exemples de cancers résistants à l’apoptose ... 33

a. Les gliomes, dont le glioblastome ... 33

b. Le cancer de l’oesophage ... 35

IV. Les chémokines ... 37

2. Les chémokines de type CXCL et leurs récepteurs ... 39

3. Implication des chémokines CXCL dans le comportement biologique des cancers en général ... 41

a. La prolifération cellulaire ... 41

b. La mort cellulaire ... 42

c. La migration cellulaire ... 43

4. Implication des chémokines CXCL dans le comportement biologique du glioblastome et des cancers de l’oesophage ... 44

a. Les gliomes ... 44

V. Quelle est la stratégie expérimentale développée dans notre travail ? ... 45

1. Choix des modèles ... 45

a. In vitro ... 45

i. Gliomes ... 45

ii. Cancers de l’oesophage ... 45

b. In vivo ... 46

i. Gliomes ... 46

ii. Cancers de l’oesophage ... 46

2. Choix des molécules visant à modifier le taux d’expression des chémokines CXCL dans nos modèles expérimentaux ... 46

a. Le témozolomide ... 46

b. L’approche par siRNA anti-chémokines CXCL ... 48

Matériel et Méthodes ... 49

I. Description des modèles expérimentaux utilisés dans le cadre du

(8)

(9)

a. Les modèles In vitro: lignées établies et primocultures ... 49

i. Les modèles ... 49

- Les lignées établies ... 49

- Les primocultures ... 49

ii. Les techniques et milieux de culture ... 50

b. Les modèles in vivo ... 50

i. Les lignées établies ... 50

- Le modèle Hs683 ... 50

- Le modèle U87 ... 51

- Le modèle T98G ... 51

- Le modèle U373 ... 51

ii. Les primocultures ... 52

iii. Les greffes orthotopiques in vivo ... 52

2. Les cancers de l’oesophage ... 53

a. Les modèles in vitro ... 53

i. Les modèles ... 53

ii. Les techniques et milieux de culture ... 53

b. Les modèles in vivo ... 54

i. Greffes orthotopiques ... 54

ii. Greffes sous-cutanées ... 54

- Le modèle OE33 ... 54

- Le modèle OE21 ... 54

- Technique de greffes sous-cutanées ... 55

c. Echantillons cliniques de cancer de l’oesophage ... 56

3. Les petits ARN interférants (siRNA) ... 56

a. Principe de la méthode ... 56

b. Technique utilisée ... 56

c. Applications in vitro ... 57

II. Analyse de l’expression des gènes ... 58

1. La technique de RT-PCR ... 58

a. L’extraction d’ARN messager ... 58

b. Synthèse de l’ADN complémentaire ... 59

c. Amplification par PCR ... 59

(10)

(11)

c. Analyses des données ... 62

III. Analyses de l’expression des protéines ... 63

1. La technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ... 63

2. La technique dite du Western bloting ... 64

c. Applications ... 65

3. La microscopie à fluorescence ... 66

4. L’immunohistochimie ... 67

IV. Analyses in vitro de la dynamique de croissance d’une population cellulaire ... 69

1. Le test colorimétrique MTT ... 69

2. La vidéomicroscopie quantitative ... 70

3. Analyse du taux d’apoptose et de processus potentiellement liés à l’autophagie ... 71

a. Détermination du taux d’apoptose ... 71

b. Détermination de processus potentiellement liés à l’autophagie ... 71

V. Analyses des données ... 73

1. Les comparaisons de groupe de données ... 73

2. Les analyses de survie ... 73

Résultats ... 74

I. Quantification des chémokines ... 74

(12)

(13)

b. Caractérisation de l’expression génomique des chémokines CXCL et de leurs récepteurs dans les primocultures et dans les lignées établies de

glioblastome ... 75

2. Dans les cancers de l’oesophage ... 77

Caractérisation de l’expression génomique des chémokines CXCL et de leurs récepteurs dans des lignées établies de cancers de l’œsophage et dans des échantillons cliniques ... 77

II. Caractérisation de l’effet du témozolomide sur la croissance de divers modèles de gliomes in vitro et de modèles de cancers de l’œsophage in vitro et in vivo ... 78

1. Dans les gliomes ... 78

a. Sélection des modèles ... 79

b. Effets du témozolomide in vitro ... 79

c. Effets du témozolomide in vivo ... 80

a. Développement de modèles in vitro ... 81

b. Développement de modèles in vivo ... 81

c. Effets du témozolomide in vitro ... 82

d. Effets du témozolomide in vivo ... 83

e. Effet anti-angiogénique du témozolomide in vivo ... 84

III. Influence du témozolomide sur les taux d’expression des chémokines ... 85

a. ARNm ... 85

b. Protéines ... 86

c. Sécrétion ... 86

a. ARNm ... 87

b. Sécrétion ... 88

IV. Influence de la chémokine CXCL2 dans la biologie des gliomes et des cancers de l’œsophage ... 88

1. Mise au point d’un siRNA anti-CXCL2 ... 88

(14)

(15)

l’œsophage OE21 ... 91

Discussion ... 93

I. Caractérisation du patron d’expression des chémokines de type CXCL ... 96

II. Caractérisation de l’effet du témozolomide sur la croissance de divers modèles de gliomes in vitro et de modèles de cancers de l’œsophage in vitro et in vivo ... 100

III. Influence du témozolomide sur les taux d’expression des chémokines de type CXCL ... 102

IV. Influence de la chémokine CXCL2 dans la biologie des gliomes et des cancers de l’œsophage ... 104

Conclusions ... 106

Références ... 108

Annexes ... 126

(16)

(17)

Annexes

a. Annexe 1 : Bruyère C., Mijatovic T., Lonez C., Spiegl-Kreinecker S., Berger W., Kast R.E., Ruysschaert J.M., Kiss R., Lefranc F. (2011). Temozolomide- induced modification of the CXC chemokine network in experimental gliomas.

Int J Oncol 38, 1453-1464.

b. Annexe 2: Bruyère C., Lonez C., Duray A., Cludts S., Ruysschaert J.M.,

Saussez S., Yeaton P., Kiss R., Mijatovic T. (2011). Considering temozolomide as a novel potential treatment for esophageal cancer. Cancer 117, 2004-2016.

(18)

(19)

Abréviations

ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire

Akt : Sérine/thréonine protéine kinase B Apaf1: apoptosis protease activity factor 1 APC: adenomatosis polyposis coli Apo2L: apoptosis antigen 2 ligand Apo3L: apoptosis antigen 3 ligand ARN: acide ribonucléique

ARNm: ARN messager

ATCC: American Type Culture Collection ATF6: Activating Transcription Factor 6 ATG: Autophagy-related protein ATP: adénosine triphosphate Bak : Bcl2 antagonist/killer Bax : Bcl2 associated protein BCA: acide bicinchonique Bcl2: B-cell CLL/ lymphoma 2 Bcl-Xl: Bcl2 like protein BCNU : carmustine

Bid: Bcl2 interacting domain death agonist Bim: Bcl2 interacting mediator of cell death Br-dUTP: bromodéoxyuridine triphosphate BSA: albumine bovine

CCNU: lomustine

CDK: Cyclin Dependent Kinase

CDKN2A: Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A

DAB: diaminobenzidine

DISC: Death Inducing Signaling Complex DMSO: diméthylsulfoxide

dNTP: déoxynucléotides triphosphates DR: Death Receptor

Duffy: DARC antigen receptor for chemokines ECACC : European Collection of Cell Cultures EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor EGR1: Early Growth Response 1

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELR: acide glutamique – leucine – arginine ERK: Extracellular signal-Regulated protein Kinase

FADD: Fas associated protein with death domain

Fas R: apoptosis stimulating fragment receptor FasL: apoptosis stimulating fragment ligand FITC: Fluoréscéine isothiocyanate

GBM: Glioblastome

GM-CSF : Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor

GRO: Growth Related Oncogene HGF: Hepatocyte Growth Factor

ID1: DNA-binding protein inhibitor 1 IGF: Insulin-like Growth Factor IL8 : interleukine 8

INK4a: Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A JNK1: c-Jun N-Terminal Protein Kinase 1 MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase MDM2: Murine Double Minute 2

MEM: Minimal Essential Medium MGMT: O6-méthylguanine- DNA- méthyltransférase

MIF : Macrophage Migration-Inhibitory Factor MMP: métalloprotéases de matrice

MS: cellules souches malignes

MTIC: monométhyl titrazeno imidazole carboxamide

mTOR: mammalian Target of Rapamycin MTT: bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl tetrazolium

NF-B: Nuclear Factor kappa B NK: Natural Killer

OMS: Organisation Mondiale de la Santé PARP: poly ADP-ribose polymerase PBS: phosphate buffered saline PCR: Poly Chain Reaction

PCV: procarbazine, CCNU, vincristine PF4 : platelet factor 4

PI3K : phosphatidyl inositol 3-kinase pRB: protéine du retinoblastoma

PTEN: Phosphatase and Tensin homolog Raf: v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog

Ras: Rat Sarcoma virus oncogene RISC: RNA-Induced Silencing Complex RNI: Reactive Nitrogen Intermediates ROS: Reactive Oxygen Species RT: radiothérapie

RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Scr: scramble

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate siRNA: small interfering RNA

STAT3: Signal Transducer and Activator of Transcription 3

TBS:Tris Buffer Saline TBE: Tris borate EDTA

TdT: terminal deoxnucleotidyltransferase TGFβ:Transforming growth factor beta TMB: tétraméthylbenzidine

TMZ: témozolomide

TNF : Tumor Necrosis Factor

TNFR1: Tumor Necrosis Factor Receptor 1 TNM : Tumor Node Metastasis

TRAIL : TNF-related Apoptosis Inducing Ligand

(20)

(21)

But du Travail

Le glioblastome, qui correspond au stade le plus élevé de malignité des gliomes, est associé à un pronostic très sombre, la survie à 5 ans étant de moins de 10%. Le glioblastome représente (en termes d’incidence) plus de 65% des gliomes et il exprime une forte résistance aux stimuli pro-apoptotiques, donc à la radiothérapie et à la chimiothérapie conventionnelle. Le cancer de l’œsophage (carcinome épidermoïde et adénocarcinome) est également un cancer très agressif, la survie à 5 ans étant de moins de 5% pour les patients de grade IV. Ce cancer présente lui aussi une résistance intrinsèque aux stimuli pro-apoptotiques.

Le témozolomide est le traitement chimiothérapeutique de premier choix administré aux patients atteints de glioblastome après chirurgie et concomitamment puis après la radiothérapie. Chirurgie et radiothérapie forment également le traitement de base pour combattre le cancer de l’œsophage. En revanche, aucune étude, même de nature expérimentale, ne s’est intéressée avant la nôtre aux bénéfices thérapeutiques potentiels du témozolomide apportés dans le cas du cancer de l’œsophage.

De plus, de nombreux cancers, dont les gliomes et le cancer de l’œsophage, expriment un réseau complexe de chémokines, dont les chémokines de type CXCL et de récepteurs aux chémokines qui influencent la croissance tumorale, la migration des cellules cancéreuses (donc le processus métastatique) et l’angiogenèse, et ce en interagissant étroitement avec le milieu extra-tumoral environnant. Nous nous sommes ainsi demandé quels pouvaient être les effets du témozolomide sur le patron d’expression de certaines de ces chémokines CXCL au sein de divers modèles de gliomes et de cancers œsophagiens. Nous avons donc dans un premier temps caractérisé le taux d’expression de toutes les chémokines de types CXCL et de tous leurs récepteurs dans divers modèles de gliomes et de cancers œsophagiens. Nous souhaitions ainsi identifier la ou les chemokines qui pourraient être le(s) plus impliquée(s) dans la biologie de ces deux types de cancers. Nous avons ainsi pu sélectionner des chémokines pro-angiogéniques et plus particulièrement la chémokine CXCL2 (mais aussi CXCL3) pour laquelle nous avons mis au point un petit ARN interférant permettant de réduire son taux d’expression dans des modèles in vitro de gliomes et de cancer de l’œsophage. Nous avons également caractérisé l’implication des

(22)

(23)

Résumé

Le glioblastome qui correspond au stade de malignité le plus élevé des gliomes est associé à un très mauvais pronostic car il envahit le parenchyme cérébral de manière diffuse, ce qui rend son exérèse complète généralement impossible, et il résiste aux traitements conventionnels en raison de sa résistance intrinsèque aux stimuli pro- apoptotiques. Le cancer de l’œsophage est également un cancer très agressif car invasif et résistant également aux stimuli pro-apoptotiques.

Les chémokines sont des cytokines chémotactiques responsables de la migration des leucocytes et exprimées en réponse à des cytokines inflammatoires, à des facteurs de croissance et à des stimuli pathogènes. De nombreux cancers possèdent un réseau complexe de ces chémokines. Les chémokines de type CXCL et plus particulièrement CXCL8 et CXCL12 sont impliquées dans la biologie des gliomes et du cancer de l’oesophage. Au cours de mon travail de thèse de doctorat, nous avons étudié l’expression des 15 chémokines CXCL et des 9 récepteurs aux chémokines CXCL dans divers modèles de gliomes et de cancers de l’œsophage. Cette étude menée par RT-PCR nous a permis de mettre en évidence la présence d’un patron d’expression complexe de ces chémokines CXCL dans les divers modèles analysés. Nous avons observé une expression plus importante des chémokines CXCL pro-angiogéniques par rapport aux chémokines anti-angiogéniques dans ces deux types de cancers. Nous avons également pu mettre en évidence une implication potentielle des chémokines CXCL2, CXCL3 et CXCL8 dans l’acquisition de la résistance au traitement par témozolomide des gliomes d’origine astrogliale.

Les glioblastomes et les cancers de l’œsophage étant deux types de cancers résistants aux stimuli pro-apoptotiques, et le témozolomide étant la seule molécule dotée de bénéfices thérapeutiques réels dans le cas du glioblastome, nous avons également testé le témozolomide dans nos modèles de cancer de l’œsophage in vitro et in vivo. Nous avons pu ainsi montrer un bénéfice thérapeutique réel apporté par cette molécule in vivo sur des animaux immunodéficients greffés avec des cellules humaines de carcinome épidermoïde de l’œsophage. Ce bénéfice thérapeutique peut être expliqué en partie par différents mécanismes d’action tels que l’induction de processus soutenus d’autophagie suivis par

(24)

(25)

nos modèles in vitro de glioblastome et de carcinome épidermoïde de l’œsophage entraîne une diminution de la croissance de ces populations cellulaires cancéreuses, suggérant un rôle important de cette chémokine dans la biologie de ces deux types de cancers. Enfin, nous avons démontré un effet anti-angiogénique in vivo pour le témozolomide dans un modèle de xénogreffes de cancers oesophagiens humains chez la souris immunodéficiente.

En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que le témozolomide, bien qu’il devienne bientôt un générique sous sa forme d’administration i.v. (la forme orale étant déjà générique), pourrait représenter une molécule d’intérêt pour combattre le cancer de l’œsophage, comme on le sait déjà depuis 2005 en ce qui concerne les glioblastomes. Nos résultats montrent ensuite l’importance du patron d’expression des chémokines CXCL dans la biologie des cellules gliales tumorales et des cellules cancéreuses de l’œsophage. Enfin, nos résultats montrent que le témozolomide détruit en partie ce réseau de chémokines CXCL au sein de ces deux types de cancers.

(26)

(27)

Introduction

(28)

(29)

Introduction

I. Le cancer.

1. Généralités.

Au cours des siècles, la perception du cancer a fortement évolué : il fut d’abord considéré comme une maladie de l’organisme, puis du tissu pour devenir enfin une maladie de la cellule et de son noyau. Bien que les premières descriptions de cette maladie remontent à l’antiquité, c’est Hippocrate, au 4^ème siècle avant JC, qui le nomma pour la première fois. Il l’appela « carcinos » (crabe en grec, pour évoquer le crabe dévorant les tissus) ou encore « carcinome » ou « squirr(h)e » pour faire référence à une tumeur dure, non inflammatoire, avec tendance à la récidive et à la généralisation avec souvent une issue fatale. Au 1^er siècle après JC, Galien utilisa le mot grec « oncos » pour définir des grosseurs ou tumeurs malignes. Les connaissances sur le cancer n’évoluent pas beaucoup au cours des siècles suivants. Aux 17^ème et 18^ème siècles, le cancer est considéré comme une maladie contagieuse. Jean Godind ouvre le premier hôpital pour cancéreux à Reims en 1740. Les 18^ème et 19^ème siècles sont le siège de grand progrès médicaux. A partir du début du 20^ème siècle, les recherches s’orientent sur le noyau cellulaire. Le mécanisme de la formation des cancers commence ainsi à être perçu peu à peu: la cellule se transforme et se divise de façon anarchique.

Les informations résumées ici proviennent principalement de l’Histoire du cancer (Imbault-Huart, 1984) et « The theory and Practice of Oncology : Historical Evolution and present principles » (Raven, 1990).

Je me suis intéressée dans le cadre de ma thèse de doctorat aux gliomes et aux cancers de l’œsophage car ces deux types de cancers présentent une résistance intrinsèque importante face aux stimuli pro-apoptotiques (donc une résistance marquée aux traitements radiothérapiques et chimiothérapiques conventionnels) et il semble que les chémokines de type CXCL puissent influencer significativement leur comportement biologique.

(30)

(31)

2. Epidémiologie.

a. Les cancers cérébraux.

Chez l’adulte, les tumeurs cérébrales représentent 10% des tumeurs solides alors qu’elles représentent 30% chez l’enfant (Kleihues et Cavenee, 2000). On distingue habituellement les tumeurs primaires qui sont issues directement des tissus cérébraux et qui peuvent avoir différentes origines cellulaires (astrocytes, oligodendrocytes, ependymocytes, etc.) des tumeurs secondaires issues de la dissémination à distance d'un autre cancer (métastases).

Les gliomes représentent environ 50% des tumeurs cérébrales primaires et sont associés à un taux de mortalité et de morbidité élevé (Louis et coll., 2007). Le taux de survie est variable et dépend essentiellement du grade de malignité de la tumeur. Le glioblastome, stade le plus élevé de malignité des gliomes, est associé à un pronostic très sombre. En effet, la survie à 5 ans est inférieure à 10% (Stupp et coll., 2009). Le glioblastome représente (en termes d’incidence) plus de 65% des gliomes (Ohgaki et Kleihues, 2005).

b. Les cancers de l’œsophage.

Le cancer de l’œsophage, aussi bien sous la forme carcinome épidermoïde que sous la forme d’adénocarcinome, est très agressif car très invasif et forme rapidement des métastases (Law et Wong, 2007). Il est classé parmi les six causes les plus fréquentes de mort due à un cancer dans le monde (Homs et coll., 2006). La variation géographique de l’incidence des cancers de l’œsophage est beaucoup plus importante que pour tous les autres types de cancers (Kollarova et coll., 2007). Les carcinomes épidermoïdes de l’œsophage sont beaucoup plus fréquents en Asie et en Afrique du Sud tandis que les adénocarcinomes sont plus fréquents dans les pays occidentaux (Kollarova et coll., 2007).

L’incidence de l’adénocarcinome a rapidement augmenté dans les pays développés et ce en parallèle avec l’augmentation du surpoids et de l’obésité (Jemal et coll., 2010).

Le développement des cancers de l’œsophage (carcinome épidermoïde et adénocarcinome) est lié à différents facteurs de risques dont les plus importants sont la race, le tabac, le sexe (les hommes étant 4 à 5 fois plus susceptibles que les femmes de développer ce type de cancer), l’âge, le surpoids et l’alcool (Kollarova et coll., 2007). Le

(32)

A

A B B

Figure 2 : Illustrations histologiques (A) d’un carcinome épidermoïde qui envahit la sous-muqueuse et (B) d’un adénocarcinome de l’oeosphage qui envahit la sous-muqueuse et la muscularis propria. (d’après Lewin et Appelman., 1996)

Table 1 : Classification des gliomes selon l’Organisation Mondiale de la Santé (modifié d’après Louis et coll., 2007)

Figure 1 : (A) Illustration histologique d’un glioblastome avec une densité cellulaire très importante, présence de beaucoup de vaisseaux sanguins (flèches noires) et des zones de nécroses (flèche verte) autour desquelles les cellules s’arrangent en pseudopalissades (flèche rouge). (B) Illustration macroscopique du développement d’un glioblastome au niveau du lobe frontal gauche (d’après Kleihues et Cavenee, 2000).

(33)

diagnostiqué à un stade avancé de la maladie avec déjà des métastases à distance (Homs et coll., 2006; Hurmuzlu et coll., 2010).

3. Histopathologie des tumeurs.

a. Les cancers cérébraux et plus particulièrement les gliomes.

Le terme gliome englobe les tumeurs cérébrales primaires ayant pour origine les cellules gliales (Figarella-Branger et Bouvier, 2005). Ces cellules assurent le maintien de

l’homéostasie cérébrale, le soutien des neurones et des tissus nerveux et défendent les neurones contre les agressions extérieures. Il existe trois types de cellules

gliales pouvant donner lieu à un type de gliome bien spécifique d’un point de vue histologique: les astrocytes, les oligodendrocytes et les épendymocytes. Il existe un quatrième type de cellules gliales qui constituent la microglie. La microglie représente le système immunitaire du système nerveux central. Les tumeurs astrocytaires représentent 60 à 70% des gliomes, les tumeurs oligodendrogliales 20 à 30% des gliomes et les tumeurs épendymaires moins de 10% des gliomes (Louis et coll., 2007). Des gliomes mixtes composés de cellules astrogliales et oligodendrogliales existent également: on les nomme oligo-astrocytomes (Louis et coll., 2007).

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) subdivise les gliomes en quatre grades de malignité :

 le grade I est attribué aux tumeurs bien circonscrites, compactes et bénignes,

 les grades II à IV sont attribués aux tumeurs malignes diffuses, le grade IV représentant les glioblastomes (Figure 1).

L’OMS décrit quatre grades de malignité pour les tumeurs astrogliales (grades I à IV) (Table 1), et deux grades de malignité pour les tumeurs oligodendrogliales (grades II et III). Certains glioblastomes pourraient avoir une origine oligodendrogliale mais cela ne représenterait que 5% des glioblastomes tout au plus (Decaestecker et coll., 1998 ; He et coll., 2001).

b. Les cancers de l’œsophage.

(34)

Table 2 : Classification des tumeurs de l’œsophage selon l’OMS (d’après Lewin et Appelman, 1996).

Figure 3 : Images de résonnance magnétique d’un patient traité pour un glioblastome : (A) glioblastome temporal avant l’opération, (B) image après l’ablation macroscopiquement complète de la lésion, (C) quatre mois après la chirurgie et la radiothérapie, récidive locale, (D) image après enlèvement macroscopiquement complet de la lésion récidivante, (E) et (F) trois mois après la seconde opération et l’administration de la chimiothérapie, on observe une récidive à distance de la lésion initiale ( d’après Lefranc et coll., 2005).

(35)

épidermoïde ayant pour origine un épithélium épidermoïde, revêtement habituel de l’œsophage, et l’adénocarcinome ayant pour origine un épithélium glandulaire suite à une métaplasie du tiers inférieur de l’œsophage (Œsophage de Barrett) (Iwanski et coll., 2008). La classification TNM (tumor node metastases) de l’OMS est le système le plus utilisé pour la classification en différents stades des carcinomes (Table 2). Ce système donne une indication sur le pronostic et assiste le clinicien dans les planifications du traitement (Lewin et Appelman, 1996).

La classification TNM stratifie les carcinomes selon trois critères : l’étendue de la tumeur primaire (T), la présence ou l’absence de métastases dans les ganglions lymphatiques (N) et la présence ou non de métastases à distance (M) (Lewin et Appelman, 1996).

Ces groupes T, N et M sont gradés en nombres, en fonction de la taille de la tumeur et en fonction de la croissance à travers les structures anatomiques, à l’étendue de l’extension dans les ganglions lymphatiques et à la présence des métastases. Ainsi, il existe quatre degrés de T, trois degrés de N et deux degrés de M (Table 2).

Deux autres éléments sont utiles: la présence de carcinome résiduel après traitement (R) et le grade histologique de la tumeur (peu différenciée, différenciée, bien différenciée) (G) (Lewin et Appelman, 1996).

4. Traitements.

a. Les cancers cérébraux et plus particulièrement les gliomes.

i. Chirurgie.

La première étape dans le traitement des patients atteints d’un gliome est toujours la chirurgie. En effet, une biopsie est au moins réalisée afin de déterminer le type et le grade histologique de la tumeur pour pouvoir ensuite orienter les différents traitements.

En ce qui concerne les gliomes bénins de grade I, la résection de la tumeur permet de guérir les patients (Pouratian et Schiff, 2010). Pour les gliomes malins de grade II à IV, la chirurgie agressive consistant en une résection maximale de la tumeur est préconisée (Hsieh et Lesniak, 2005). Le gliome malin est une tumeur extrêmement invasive au sein du parenchyme cérébral, ce qui rend généralement impossible une résection totale de la tumeur (Figure 3).

(36)

Figure 4 : Le témozolomide dans le traitement du glioblastome. (A) Le témozolomide est administré pendant toute la durée de la radiothérapie à une dose de 75mg/m²/j pendant 40 à 49 jours. Ensuite, il est administré à raison de 6 cycles de 5 jours toutes les 4 semaines à une dose de 150 à 200mg/m²/j. (d’après Stupp et coll., 2007). (B) Survie globale des patients atteints de glioblastome traités avec soit de la radiothérapie seule soit combinée à du témozolomide selon le schéma d’administration détaillé en A (modifié d’après Stupp et coll., 2009). Abréviations : TMZ : témozolomide ; RT : radiothérapie.

A

B

(37)

ii. Radiothérapie.

La radiothérapie est à l’heure actuelle le traitement adjuvant standard à la chirurgie pour traiter les gliomes de grades III et IV (Lefranc et coll., 2006). En effet, plusieurs études cliniques menées depuis les années 1970 ont permis de montrer une amélioration du taux de survie de six mois grâce à la radiothérapie pour les gliomes de haut grade (Walker et coll., 1978 ; Laperriere et coll., 2002).

iii. Chimiothérapie.

Le témozolomide est le traitement chimiothérapeutique de premier choix administré aux patients atteints d’astrocytomes de grades III et IV (glioblastomes) mais aussi depuis peu d’oligodendrogliomes de grade III (Stupp et coll., 2009). Le témozolomide est un agent alkylant qui ajoute un groupement méthyl à l’ADN et inhibe ainsi sa synthèse. Cette molécule sera décrite plus en détails dans la partie « choix des molécules visant à modifier le taux d’expression des chémokines CXCL dans nos modèles expérimentaux ».

Le témozolomide est une petite molécule lipophile qui passe la barrière hémato- encéphalique efficacement et qui est moins toxique que la plupart des traitements chimiothérapeutiques traditionnels (Friedman et coll., 2000). Cette molécule est utilisée depuis de nombreuses années en clinique mais il a fallu attendre une étude clinique multicentrique menée par Stupp et ses collaborateurs en 2005 pour optimiser son utilisation. C’est ainsi qu’il a été montré dans cet essai clinique de phase III qu’il fallait associer le témozolomide à la radiothérapie puis continuer des cycles de témozolomide après la radiothérapie pour en tirer un bénéfice thérapeutique maximal (Stupp et coll., 2009). Le détail de ce protocole thérapeutique est décrit dans la Figure 4.

Des agents alkylants autre que le témozolomide telles les nitrosourées (carmustine (BCNU) et lomustine (CCNU)) et la procarbazine qui inhibent la synthèse d’ADN par ajout d’un groupe alkyl en position O6 de la guanine ont longtemps été les molécules chimiothérapeutiques adjuvantes à la radiothérapie les plus utilisées pour traiter les gliomes de grades III et IV (Walker et coll., 1978 ; Lefranc et coll., 2006). Ces molécules

(38)

(39)

de Procarbazine, CCNU et Vincristine était également souvent utilisée pour traiter les gliomes de grades III et IV (Levin et coll., 1990 ; Lefranc et coll., 2006).

iv. Immunothérapie et vaccinothérapie.

Au cours des 20 dernières années, l’immunologie des tumeurs a connu un grand bouleversement notamment grâce à l’identification d’antigènes spécifiques aux tumeurs, mais aussi grâce à la découverte des cellules dendritiques (Koido et coll., 2009). Le but de l’immunothérapie tumorale est d’exploiter et d’amplifier les réponses immunitaires de l’organisme pour combattre la maladie. Il existe deux grandes voies d’immunothérapie anti-cancéreuse développées ces dernières années : l’immunothérapie non-spécifique et l’immunothérapie spécifique (Leung, 2009).

La thérapie non-spécifique est fondée sur le « dopage » du système immunitaire du patient grâce à la délivrance locale de TNF (tumor necrosis factor), de certains facteurs de croissance (GM-CSF ; granulocyte macrophage colony stimulating factor) et de certaines cytokines telles que l’interféron α et l’interleukine 2 (Janeway et coll., 2003).

Les effets secondaires des cytokines, leurs actions en cascade et leur nombre impressionnant de fonctions ont laissé place à une immunothérapie plus spécifique et plus ciblée : les approches vaccinales anti-tumorales peptidiques et cellulaires.

L’immunothérapie spécifique consiste à injecter à un patient donné des lymphocytes T autologues spécifiques d’antigènes de tumeurs générés et sélectionnés ex vivo à partir du sang ou de la tumeur de ce même patient (Janeway et coll., 2003). C’est au niveau du mélanome que de nombreux antigènes spécifiques de tumeurs humaines ont été initialement identifiés (Coulie et coll., 1993 ; Boon et coll., 1994 ; Boon et coll., 1997 ; Carrasco et coll., 2008). Néanmoins, les résultats obtenus jusqu’à présent sont décevants (Sloan et coll., 2009 ; Garbe et coll., 2011). L’immunothérapie active reprend également la vaccinothérapie qui donne de réels espoirs pour les patients atteints de gliomes ce qui n’est malheureusement pas le cas pour les patients atteints de mélanomes (Garbe et coll., 2011). Cette vaccinothérapie fait appel aux cellules dendritiques, cellules présentatrices d’antigènes, qui ont la capacité d’activer efficacement des lymphocytes T

(40)

Figure 5 : (A) Carcinome superficiel de l’oesophage, cette partie est enlevée par oesophagectomie. (B) Adénocarcinome dans le petit segment d’oesophage de Barrett. L’opération effectuée est une oesophagogastrectomie (d’après Lewin et Appelman, 1996).

(41)

dernières années pour essayer d’améliorer le pronostic des patients atteints de gliomes.

Des études cliniques de phase I ont montré que la vaccination des patients avec ces cellules dendritiques autologues peut provoquer une réponse immunitaire anti-tumorale contre les tumeurs du système nerveux central (De Vleeschouwer et coll., 2008). Dans ces études, les cellules dendritiques du patient sont mises en présence de lysat tumoral et/ou de peptides bien définis associés à la tumeur afin de les activer (De Vleeschouwer et coll., 2008). Ensuite, les cellules dendritiques autologues activées sont réinjectées au patient et des résultats très prometteurs ont d’ores et déjà été obtenus en termes d’augmentation de survie des patients atteints de glioblastome, mais toutefois uniquement chez des patients relativement jeunes dotés d’un système immunitaire encore efficient (De Vleeschouwer et coll., 2008). Le groupe de recherche au sein duquel j’ai réalisé mon doctorat participe activement à une approche originale de vaccinothérapie des gliomes en combinant cette vaccinothérapie avec un traitement adjuvant faisant appel à un siRNA anti-galectin-1 (Verschuere et coll., 2011). Ce traitement en est encore au stade expérimental mais des essais cliniques sont prévus dans un futur de l’ordre de deux ou trois ans.

b. Les cancers de l’œsophage.

i. Chirurgie.

La chirurgie est le traitement de choix pour les patients atteints d’un cancer de l’œsophage bien localisé (Lerut, 1998). Deux types d’opérations sont pratiquées par les chirurgiens en fonction de l’étendue des lésions et de leurs localisations : l’oesophagogastrectomie où la partie malade de l’œsophage et la partie malade de l’estomac sont réséquées et l’oesophagectomie où une partie de l’œsophage (voire la totalité) est réséquée (Figure 5). Malheureusement, une résection curative n’est possible que dans 15 à 40% des cas à cause de la présence de métastases bien avant que les symptômes du cancer n’apparaissent (Lieberman et coll., 1995). Des chimiothérapies néo-adjuvantes (avant la chirurgie) peuvent être administrées aux patients dans le but d’augmenter la résectabilité de la tumeur (Malthaner et coll., 2006).

ii. Radiothérapie.

(42)

A B

Figure 6 : Etudes de cohortes rétrospectives : 45 patients ont été traités par chirurgie seule et 31 ont reçu une chimio-radiothérapie pré-opératoire. (A) Le graphique rapporte le stade de la maladie au moment du diagnostic et après chirurgie seule ou chirurgie précédée d’une chimio-radiothérapie pré-opératoire. La combinaison de la chirurgie avec la CRT induit une diminution du stade de la tumeur primaire. (B) Par analyse univariée, un bénéfice de survie est apporté par la combinaison de la chirurgie et de la chimio-radiothérapie pré-opératoire (d’après Hurmuzlu et coll., 2010). Abréviations : CRT : chimio-radiothérapie pré-opératoire

(43)

précède généralement la chirurgie dans le but d’augmenter la résectabilité des tumeurs.

Le rôle de la radiothérapie pré-opératoire dans le cadre du cancer de l’œsophage est très controversé. En effet, plusieurs études ont montré qu’elle augmente le taux de survie des patients atteints d’un cancer de l’œsophage (Hofstetter et coll., 2002 ; Tepper et coll., 2008). D’autres études n’ont pas montré de bénéfices réels de survie en comparaison à la chirurgie seule (Bosset et coll., 1997 ; Lee et coll., 2004 ; Burmeister et coll., 2005).

Hurmuzlu et coll. (2010) ont mis en évidence dans une étude menée sur 107 patients atteints de cancer de l’œsophage de stades II et III que la chimio-radiothérapie pré- opératoire augmente la résectabilité des tumeurs (Figure 6). D’autres auteurs avaient déjà montré que lorsque que le cancer de l’œsophage est à un stade peu avancé (ne présentant pas de métastase), la radiothérapie pré-opératoire peut augmenter la résectabilité de la tumeur (Arnott et coll., 1998 ; Schwer et coll., 2009).

iii. Chimiothérapie.

La chimiothérapie est utilisée comme thérapie adjuvante ou néo-adjuvante à la chirurgie pour traiter le cancer de l’œsophage. Plusieurs combinaisons de molécules sont actuellement utilisées en clinique. Une méta-analyse réalisée par Malthaner et ses collègues en 2006 révèle que la molécule la plus couramment administrée aux patients est le cisplatine, une molécule pro-apoptotique qui induit des dommages de l’ADN (Wang et Lippard, 2005 ; Stewart, 2007). Le cisplatine est régulièrement associé au 5’fluorouracil, qui s’incorpore dans l’ADN et l’ARN créant de cette manière des dommages irréversibles (Longley et coll., 2003). La bléomycine, un antibiotique qui crée également des dommages en cassant les doubles brins d’ADN, est parfois combiné au cisplatine (Chen et Stubbe, 2005). Des poisons du fuseau mitotique, la vindésine et la vinblastine, sont eux aussi parfois combinés au cisplatine (Robert, 2007). Dans la plupart des cas le bénéfice de survie apporté par ces combinaisons de traitement est très mince, voire inexistant, comme le révèle cette méta-analyse (Malthaner et coll., 2006). Ainsi, toutes les molécules utilisées pour combattre le cancer de l’œsophage sont des molécules pro-apoptotiques.

Or, de plus en plus d’études montrent que le cancer de l’œsophage fait partie des cancers résistants aux stimuli pro-apoptotiques (McCabe et Dlamini, 2005; Abdel-Latif et coll.,

(44)

Figure 7 : Concept de la tumorigenèse. (A) Théorie de Nowell : l’évolution clonale. Un carcinogène induit un changement dans les cellules progénitrices (N) produisant des cellules tumorales diploïdes (T1, 46 chromosomes) avec des avantages de croissance permettant ainsi à l’expansion clonale de commencer. L’instabilité génétique des cellules T1 induit la production de variants (changements dans le nombre de chromosomes symbolisés par T2 à T6). La plupart de ces variants meurent mais occasionnellement un variant acquiert un avantage de survie (T2, 47 chromosomes) et sa progéniture devient prédominante dans la sous-population jusqu’à ce qu’un variant encore plus favorable apparaisse. Les tumeurs humaines avec un minimum de changements chromosomiques sont considérées comme apparaissant tôt dans l’évolution clonale, tandis que les tumeurs solides aneuploïdes sont retrouvées dans les derniers stades du processus de développement (d’après Nowel, 1976). (B) Théorie de Pierce : représentation schématique d’une cellule souche normale (S) et des progénitures différenciées et non-différenciées des cellules souches malignes (MS). Les cellules précurseurs (PC) sont responsables du renouvellement normal d’un tissu (de A à E). A’-E’ représentent les progénitures des cellules souches malignes (d’après Pierce et Speers, 1988).

(45)

témozolomide, comme nous l’expliquons ci-après, pour court-circuiter, tout au moins en partie, cette résistance intrinsèque des cancers oesophagiens aux stimuli pro-apoptotiques.

II. Vie et mort d’une cellule cancéreuse.

1. En quoi une cellule cancéreuse se distingue-t-elle d’une cellule normale ?

Plusieurs théories ont été émises à propos de l’origine des cellules cancéreuses et de leurs différences par rapport aux cellules normales (Figure 7). En 1976, Nowell émet la théorie selon laquelle un changement génomique apparaît dans une seule cellule qui devient ainsi néoplasique et acquiert des avantages de croissance et de survie par rapport aux cellules normales. Ces cellules sont instables génétiquement et génèrent une grande quantité de variants génétiques (Figure 7A) (Nowell, 1976).

Pierce et Speers (1988) introduisent quelques années plus tard la notion de cellules souches, notion amplement développée à l’heure actuelle (Seery, 2002; Tabatabai et Weller, 2011; Visvader, 2011). Les cellules souches sont des cellules indifférenciées se caractérisant par leurs capacités à engendrer d’une part des cellules spécialisées et d’autre part à se multiplier quasi infiniment à l'identique (autorenouvellement). Selon la théorie de Pierce, les cellules souches normales peuvent donner naissance à des cellules souches malignes (Figure 7B). Contrairement aux lignées de cellules normales dans lesquelles les cellules souches se divisent pour remplacer des cellules sénescentes, dans le contexte du cancer beaucoup plus de cellules souches sont produites par rapport aux nombres de cellules qui se différencient. Les cellules souches ne sont pas les seules à générer des cellules tumorales. En effet, les cellules progénitrices qui vont ensuite donner naissance à différentes cellules souches peuvent également donner des tumeurs (Figure 7B) (Pierce et Speers, 1988). Cette théorie semble confirmée aujourd’hui dans le cas des gliomes (Sanai et coll., 2005).

(46)

Figure 8 : Ciblage thérapeutique des 10 caractéristiques phénotypiques distinguant les cellules cancéreuses des cellules normales. Ce schéma reprend dix caractéristiques, à savoir la capacité de prolifération soutenue, l’insensibilité aux facteurs inhibiteurs de croissance, la résistance à la mort cellulaire, la capacité de prolifération illimitée, la capacité de susciter l’angiogenèse, l’acquisition du pouvoir invasif, le développement de l'instabilité génomique dans les cellules cancéreuses, l’influence de l'état inflammatoire des lésions précancéreuses et cancéreuses, la reprogrammation majeure du métabolisme énergétique et l’échappement à la destruction par le système immunitaire. Ce schéma reprend également différents exemples de médicaments qui interfèrent avec ces différents phénotypes (d’après Hanahan et Weinberg, 2011).

Les mentions « Ph1 », « Ph2 », etc. ont été ajoutées à la figure originale pour faciliter la lecture du texte en regard de la présente figure.

(47)

La cellule cancéreuse se distingue selon dix phénotypes différents par rapport à la cellule normale comme expliqué dans la revue de Hanahan et Weinberg (2011). La Figure 8 illustre ces dix phénotypes distinctifs que nous résumons ci-après.

 Phénotype 1: La prolifération soutenue : les cellules normales ont besoin de signaux tels que des facteurs de croissance extracellulaires pour se diviser. Ces facteurs de croissance se lient à des récepteurs, ce qui active toute une série de voies de signalisations et régule la progression des cellules tumorales dans leur cycle cellulaire ainsi que d’autres processus biologiques tels que la survie ou encore le métabolisme énergétique. Les cellules cancéreuses peuvent dès lors acquérir cette capacité de haute prolifération via un certain nombre de moyens : stimulation autocrine, stimulation des cellules normales pour les obliger à produire des facteurs de croissance, surexpression des récepteurs aux facteurs de croissance à la surface des cellules cancéreuses les rendant hypersensibles ; etc.…

 Phénotype 2: Insensibilité aux facteurs inhibiteurs de croissance. En plus de maintenir une croissance positive, les cellules cancéreuses doivent également échapper à des voies de signalisation inhibant la prolifération cellulaire. La plupart de ces voies de signalisation dépendent de l’action de gènes suppresseurs de tumeurs tels la protéine du rétinoblastome (pRb) et p53.

 Phénotype 3: Acquisition de résistance à l’apoptose. Les cellules tumorales les plus résistantes sont celles qui arrivent à résister aux stimuli pro-apoptotiques. Le phénomène le plus commun se rapporte à la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur p53. Alternativement, les tumeurs peuvent également surexprimer des facteurs anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL) ou des signaux de survie, ou encore sous exprimer des facteurs pro-apoptotiques (Bax, Bim, Puma).

 Phénotype 4: Capacité proliférative illimitée (activation de l’immortalité réplicative).

Cette capacité est un contraste marqué avec le comportement de la plupart des cellules normales qui ont généralement un nombre limité de division. Après quoi soit les cellules entrent en sénescence, état où les cellules sont viables mais non proliférantes, soit les cellules meurent.

(48)

(49)

développer tout en devant évacuer les déchets métaboliques et le dioxyde de carbone.

Chez les adultes, mis à part lors du cycle menstruel chez la femme et lors des processus de réparation tissulaire, par exemple suite à une blessure, l’angiogenèse ne s’effectue point. Lors de la progression tumorale, le processus angiogénique s’active et les vaisseaux sanguins quiescents en conditions normales se mettent à produire de nouveaux vaisseaux soutenant de cette manière la croissance néoplasique.

 Phénotype 6: Acquisition d’un pouvoir invasif. Une tumeur d’origine épithéliale progresse dans des stades plus élevés de la maladie grâce aux capacités d’invasion et de métastaser à distance qu’acquièrent les cellules tumorales. Le processus d'invasion et de métastase a été schématisé comme une séquence d'étapes distinctes, souvent appelée cascade d’invasion métastatique.

 Phénotype 7: Développement de l'instabilité génomique dans les cellules cancéreuses, ce qui génère des mutations aléatoires. Certains génotypes mutants confèrent un avantage sélectif aux cellules tumorales permettant leur dominance dans un environnement tissulaire local. La progression tumorale en plusieurs étapes peut être décrite comme une succession d'expansions clonales, dont chacune est déclenchée par l'acquisition d'un génotype mutant.

 Phénotype 8: Le climat inflammatoire environnant des lésions précancéreuses et cancéreuses. Les cellules immunitaires jouent un rôle très important dans la progression tumorale. L'inflammation chronique peut contribuer à l’acquisition de caractéristiques biologiques agressives de la part des cellules tumorales en fournissant des molécules bioactives pour le microenvironnement tumoral, notamment des facteurs de croissance qui soutiennent la signalisation proliférative des cellules tumorales, des facteurs de survie qui limitent la mort des cellules tumorales, des facteurs pro-angiogéniques et des enzymes pour digérer la matrice extracellulaire pour faciliter l'angiogénèse, l'invasion et les métastases. Les cellules inflammatoires peuvent également libérer des substances chimiques telles que les espèces oxygénées réactives, qui sont mutagènes pour les cellules cancéreuses à proximité, en accélérant leur évolution génétique vers des états de malignité accrue.

 Phénotype 9: Reprogrammation majeure du métabolisme énergétique cellulaire afin

(50)

(51)

 Phénotype 10: Echappement des cellules tumorales à la destruction par le système immunitaire. En effet, les cellules et les tissus sont constamment surveillés par un système immunitaire toujours en éveil, et une telle surveillance est responsable de la reconnaissance et de l'élimination de la grande majorité des cellules cancéreuses et donc de nombreuses tumeurs naissantes. Selon cette logique, les tumeurs solides qui se développent semblent avoir réussi à éviter la détection et l’éradication par les différentes branches du système immunitaire.

En plus de ces dix phénotypes, il faut tenir compte des modifications épigénétiques apparaissant au sein de la chromatine. La modification épigénétique est définie comme un changement réversible dans l’expression génique qui ne résulte pas de l’altération de la séquence de l’ADN (Baylin et coll., 2001). La modification majeure est la méthylation de l’ADN, principalement au niveau des cytosines. Ces méthylations sont la marque d’une chromatine transcriptionnellement silencieuse (Luczak et Jagodzinski, 2006). Plusieurs types de cancers sont associés à une réduction globale du taux de méthyl-cytosines dans le génome par rapport au tissu normal et est de ce fait responsable de la surexpression de proto-oncogènes, de facteurs de croissance et de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, l’invasion et le processus métastatique (Szyf et coll., 2004 ; Luczak et Jagodzinski, 2006). Au contraire, plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs sont rendus silencieux par l’hyper-méthylation de leur promoteur (Mizuno et coll., 2001). Des tumeurs peuvent maintenir stablement une mutation sur un allèle de gène alors que l'autre est hyperméthylé, et ainsi inactivé (Luczak et Jagodzinski, 2006).

De plus, les gènes suppresseurs de tumeurs résident souvent au sein de régions caractérisées par des délétions fréquentes, aboutissant à une perte d’hétérozygotie (LOH).

La réversibilité des changements épigénétiques pourrait être une cible dans la thérapie anti-cancéreuse. A titre d’exemple, l’efficacité thérapeutique du témozolomide (une molécule à laquelle nou nous sommes intéressés dans le présent travail) dans le gliome est en partie liée à la méthylation du promoteur du gène de la O6-méthylguanine-DNA- méthyltransférase (MGMT).

(52)

Figure 9 : Le cycle cellulaire. (A) Il est composé de 4 phases distinctes : la phase G1, la phase S de synthèse d’ADN, la phase G2 et finalement la phase M de mitose. Les cellules ne se divisant pas sont en phase G0. La progression dans le cycle cellulaire est dirigée par des complexes actifs de cyclines et de kinases dépendantes des cyclines (CDKs) qui phosphorylent la protéine du rétinoblastome (Rb) inhibant de cette manière les fonctions inhibitrices de croissance et permettant à la cellule de progresser dans le cycle cellulaire. L’avancement dans la phase G1 est facilitée par les cyclines de type D qui forment des complexes actifs avec CDK4 et CDK6 et les cyclines de type E qui forment des complexes avec CDK2. p21 et p27 sont des inhibiteurs des complexes formés par les CDKs et les cyclines (d’après Coleman et coll., 2004). (B) Les 4 phases de la mitose sont : (a) Prophase : les centrosomes sont dupliqués et migrent autour du noyau ; (b) Prométaphase : l’enveloppe nucléaire est rompue et les chromosomes migrent vers le milieu de la cellule ; (c) Métaphase : les chromatides sœurs son alignées au centre de la cellule ; (d) – (e) Anaphase : phase de ségrégation : les chromatides sont attirées vers les pôles de la cellule. La mitose est suivie par (f) la télophase et la cytokinèse : les cellules filles possèdent chacune tout le matériel génétique. Le cytoplasme se sépare et l’enveloppe nucléaire de chaque cellule fille se forme (d’après Scholey et coll., 2003).

A

B

(53)

2. La prolifération cellulaire.

La cinétique de croissance d’un tissu est un équilibre entre le nombre de cellules produites (prolifération) et le nombre de cellules détruites (les différentes morts cellulaires décrites ci-après). Dans une tumeur, soit le taux de prolifération cellulaire est augmenté, soit la mort cellulaire est diminuée (Leaver et coll., 1998 ; Cory et coll., 1999).

La prolifération cellulaire se rapporte au fait qu’une cellule mère se divise en deux cellules filles au cours du cycle cellulaire (Alberts et coll., 2007). Le cycle cellulaire est une succession de quatre étapes (Figure 9A). Des accidents peuvent survenir lors de la division cellulaire dans les cancers et les cellules peuvent devenir aneuploïdes et adopter un comportement biologique agressif (Salmon et coll., 1993). La mitose est la dernière étape du cycle cellulaire et comporte quatre phases (Figure 9B). La phosphorylation et la dégradation de nombreuses protéines régulent le cycle cellulaire. Ainsi le cycle est contrôlé par trois complexes majeurs de cycline-CDK (cyclin dependente kinase) : un en phase G1, un en phase S et un en phase M. Ces complexes sont formés d’une sous-unité régulatrice, la cycline, et d’une sous-unité à activité kinase, la protéine CDK (Figure 9).

Des ubiquitines ligases polyubiquinylent les régulateurs clés du cycle et les adressent au protéasome pour les dégrader (Alberts et coll., 2007).

3. Les diverses formes de morts cellulaires.

a. L’apoptose.

L’apoptose, mort programmée de type I, consiste en l’élimination de cellules génétiquement endommagées sans provoquer de réaction inflammatoire (Elmore, 2007).

L’apoptose est un processus normal au cours du développement et du vieillissement. Ce processus est impliqué dans l’homéostasie tissulaire mais c’est également un mécanisme de défense permettant l’élimination des cellules endommagées pour prévenir notamment l’oncogenèse (Lodish et coll., 2003 ; Elmore, 2007). Ce suicide cellulaire est caractérisé par de nombreux changements morphologiques bien définis et illustrés dans la Figure 10.

(54)

Figure 11: L’apoptose : La voie extrinsèque de l’apoptose (à gauche) s’enclenche par la liaison d’un ligand à un récepteur de mort mais aussi par le relarguage du granzyme (une sérine protéase) par les cellules immunitaires.

Après la liaison des ligands aux récepteurs de mort, ces récepteurs se multimérisent et forment un complexe lié à la membrane cellulaire induisant la mort : DISC (death-inducing signalling complexe) qui contient aussi bien la protéine adaptatrice FADD (fas associated protein with death domain) que les caspases initiatrices 8 et 10. La voie intrinsèque de l’apoptose (à droite) est initiée suite à des dommages cellulaire via l’activation de la voie de p53 qui implique aussi bien l’expression de récepteurs de mort que des protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl2. Cela a pour conséquence le relarguage du cytochrome C dans le cytoplasme qui induit un complexe de protéine appelé apoptosome qui contient la protéine Apaf 1 (apoptosis protease activity factor 1) et des initiateurs de la caspase 9. L’activation des caspases initiatrices par les deux voies apoptotiques induit des caspases effectrices 3, 6 et 7 qui clivent différents substrats induisant de cette manière la mort cellulaire. La caspase 8 peut également induire la voie intrinsèque via le clivage de la protéine pro-apoptotique Bid (Bcl2 interacting protein) (d’après Eberle et coll., 2008).

(55)

Figure 10 : L’apoptose : Schéma représentant les changements morphologiques apparaissant durant le processus d’apoptose. L’ADN de la cellule se condense, la membrane plasmique bourgeonne et il y a formation des corps apoptotiques qui sont ensuite phagocytés (modifié d’après Gewies, 2003).

Il existe deux cascades moléculaires énergie-dépendantes appelées voies apoptotiques: la voie extrinsèque résultant de signaux provenant de l’extérieur de la cellule appelée aussi voie des récepteurs de mort et la voie intrinsèque résultant de signaux internes aussi appelée voie mitochondriale (Figure 11).

La voie extrinsèque implique l’activation des récepteurs transmembranaires de mort cellulaire de la famille du TNF (Elmore, 2007). Les membres de cette famille de récepteurs ont tous en commun des domaines extracellulaires riches en cystéine et un domaine cytoplasmique de 80 acides aminés appelé domaine de mort. Ce domaine cytoplasmique joue un rôle important dans la transmission des signaux extracellulaires à l’intérieur de la cellule. Les différents couples ligands (extracellulaires)/ récepteurs (cytoplasmiques) activant la voie extrinsèque les mieux caractérisés sont FasL/FasR (apoptosis stimulating fragment ligand/receptor), Apo3L (apoptosis antigen-3 ligand) / DR3 (death receptor 3), Apo2L (apoptosis antigen-2 ligand) / DR4 (death receptor 4), Apo2L / DR5 (death receptor 5) et TNFα/TNFR1 (tumor necrosis factor receptor 1) (Eberle et coll., 2008). La liaison du ligand à son récepteur mène à l’activation de la caspase 8, une des protéases à l’origine de la dégradation du contenu cellulaire (Figure 11) (Eberle et coll., 2008).

(56)

Figure 12: Schéma du processus de mort cellulaire lié à l’autophagie. L’autophagie implique la séquestration de cytosol et d’organites cellulaires dans une double membrane créant de cette manière un autophagosome qui fusionne ensuite avec des endosomes ou des lysosomes formant l’autophagolysosome ou autolysosome. Les enzymes lysosomiales peuvent ensuite agir et détruire le matériel ainsi emprisonné conduisant finalement à une mort par apoptose. L’autophagie et l’apoptose peuvent être déclenchés par les mêmes signaux en aval. La mort cellulaire peut alors être la résultante de la combinaison des deux morts cellulaire induite simultanément. La plupart des voies de mort cellulaire convergent finalement vers l’apoptose (d’après Lefranc et coll., 2008a). ATF6:

Activating transcription factor 6; ATG: Autophagy-related proteins; Bip/GRP78: 78 KDa glucose-related protein;

DDIT3/Gadd153: DNA-damage-inducible transcript 3; eIF-2a: Eukaryotic translation initiation factor 2α; ER:

Endosplasmic reticulum; HSP: Heat-shock protein; HSPA5: Heat shock 70 KDa protein 5; LC3: Microtubule- associated protein 1 light chain 3; LMP: Lysosomal membrane permeabilization; mTOR: Mammalian target of rapamycin; PDK-1: Phosphoinositide dependent protein kinase-1; PERK: eIF-2α kinase; PP2A: Protein phoshatase.

(57)

La voie intrinsèque résulte de différents stimuli internes, soit positifs (radiation, radicaux libres, hypoxie, etc…), soit négatifs (absence de certains facteurs de croissance, de cytokines, d’hormones) qui causent la perte de suppression de la voie apoptotique et donc activent l’apoptose (Figure 11) (Eberle et coll., 2008). Ces stimuli induisent une dépolarisation de la membrane mitochondriale accompagnée d’une ouverture des pores et du relarguage des protéines pro-apoptotiques telles que le cytochrome c grâce notamment à l’activation de protéines de la famille Bcl2 (B-cell CLL/lymphoma 2) dans le cytoplasme menant à l’activation de la caspase 9 (Figure 11). Les protéines de la famille Bcl2 peuvent être soit pro-apoptotiques (Bax (Bcl2 associated x protein), Bak (Bcl2 antagonist/killer), Bid (Bcl2 interacting protein), Bim (Bcl2 interacting mediator of cell death),..), soit anti-apoptotiques (Bcl2, Bcl-Xl (Bcl2 like protein),..). Les deux voies de signalisation mènent à l’activation de la voie exécutrice de l’apoptose dont le premier évènement est l’activation de la caspase 3 qui clive à son tour différents substrats (PARP (poly ADP-ribose polymérase), endonucléases, protéases, etc…) responsables de la dégradation du matériel cytoplasmique et nucléaire aboutissant aux changements morphologiques et biologiques caractéristiques des cellules apoptotiques (Figure 11) (Eberle et coll., 2008 ; Elmore, 2007).

La résistance à l’apoptose joue un rôle important dans la tumorigenèse et le processus métastatique en particulier, ainsi que dans la résistance aux traitements des cancers car à l’heure actuelle la majorité des traitements sont pro-apoptotiques (Okada et Mak, 2004).

Nous consacrons le chapitre III de l’Introduction à cette problématique.

b. Le processus irréversible d’autophagie.

La mort par autophagie est aussi appelée la mort programmée de type II par opposition à la mort programmée de type I ou apoptose. La mort par autophagie est un processus indépendant de la voie des caspases (Figure 12). L’autophagie est un mécanisme de défense cellulaire (lié tant aux cellules normales qu’aux cellules tumorales) durant lequel divers organites, dont les mitochondries, sont dégradés par les

(58)

Figure 13: Mécanisme hypothétique d’implication de la perméabilisation des lysosomes dans le processus de mort cellulaire. La perméabilisation des lysosomes induit le relarguage de cathepsines, de shingosines, et de ROS (reactive oxygen species) dans le cytoplasme. Les cathepsines relarguées dans le cytosol interagissent avec les protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl2 menant à l’induction de la voie intrinsèque de l’apoptose (d’après Yamashima et Oikawa, 2009).

Figure 14: Structures chimiques de molécules induisant la mort par perméabilisation des lysosomes. (A) Structure de la 19-hydroxy-2’’-oxovoruscharine qui est un dérivé semisynthétique de la 2’’ oxovoruscharine découverte dans l’arbuste africain Calotropis procera (d’après Van Quaquebeke et coll., 2005 ; Mijatovic et coll., 2006). (B) Structure du Kahalalide F découvert dans un mollusque Hawaïen Elysia rufescens (d’après Suarez et coll., 2003).

Kahalalide F Kahalalide F

B

19-hydroxy-2’’-oxovoruscharine

A

19-hydroxy-2’’-oxovoruscharine 19-hydroxy-2’’-oxovoruscharine