Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Contribution à l'étude des réponses cellulaires secondaires à l'activation de récepteurs purinergiques ionotropes dans
les glandes salivaires et les macrophages de souris
Michèle SEIL
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur :
Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique)
Composition du jury : Pierre DUEZ (Président)
Carine DE VRIESE (Secrétaire) Jean-Michel KAUFFMANN Hassan JIJAKLI
Astrid VANDEN ABBEELE (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Bernard ROBAYE (Faculté des Sciences, Université libre de Bruxelles)
2011
Faculté de Pharmacie
Je voudrais tout d’abord remercier mon promoteur, le Professeur Jean-Paul Dehaye pour m’avoir accueillie dans son laboratoire. Sa motivation, sa disponibilité, son expérience, ses connaissances scientifiques et ses nombreux conseils m’ont permis de mener à bien cette thèse.
Je tiens à exprimer ma sincère gratitude au Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir formé aux différentes techniques de laboratoire, pour ses nombreux conseils, sa disponibilité et sa gentillesse.
Je remercie le Dr. Michel Vandenbranden pour avoir réalisé les analyses infrarouge et pour ses conseils scientifiques.
Je voudrais également exprimer mes remerciements au Professeur Nathalie Verbruggen pour m’avoir donnée accès au spectrophotomètre NanoDrop 2000c.
Mes remerciements vont à tous les membres, anciens et actuels, du Département de Biopharmacie dont le Service de Chimie Biologique et Médicale et de Microbiologie Pharmaceutique. Je remercie en particulier Sara, Manuela et Robert pour leur aide lors des manipulations effectuées et pour les moments passés ensemble aux travaux pratiques de Biochimie et de Biologie moléculaire. Merci également aux autres doctorants du service, dont Malika et Carole, pour leur soutien et les bons moments partagés, ainsi qu’à Anar avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à donner les travaux pratiques de Biochimie médicale.
Un grand merci aux doctorants étrangers, aux étudiants Erasmus et aux stagiaires avec lesquels j’ai eu l’occasion de travailler lors de leur séjour dans notre laboratoire : Unai, Irantzu, Giulia, Asma, Vivien, Christian et Souleymane.
Je remercie sincèrement mes parents, ma grand-mère et ma sœur, Diane, qui ont toujours été présents pour moi et qui m’ont soutenu au cours de ces années de doctorat. Merci également à la famille d’Olivier pour leurs marques de sympathie et leurs encouragements.
Enfin, merci à Olivier, pour sa présence, sa patience et ses encouragements tout au long de ces années de doctorat.
TABLE DES MATIERES
RESUME
LISTE DES ABREVIATIONS
CHAPITRE I : INTRODUCTION
I.1.LES RECEPTEURS PURINERGIQUES... 1
I.1.1. Historique ... 1
I.1.2. Les nucléotides et les nucléosides... 3
I.1.2.1. Stockage et libération d’ATP dans l’espace extracellulaire... 3
I.1.2.2. Métabolisme de l’ATP dans l’espace extracellulaire... 4
I.1.3. Les récepteurs purinergiques... 6
I.1.3.1. Les récepteurs P1 ... 6
I.1.3.2. Les récepteurs P2 ... 7
I.1.3.2.1. Les récepteurs P2Y ... 7
Structure ... 7
Pharmacologie ... 9
Sous-types des récepteurs P2Y ... 9
I.1.3.2.2. Les récepteurs P2X ... 11
Structure ... 12
Pharmacologie ... 13
Sous-types des récepteurs P2X ... 16
I.1.3.3. Les récepteurs P2X7... 18
Structure ... 18
Pharmacologie ... 19
Réponses secondaires à l’activation du récepteur P2X7... 21
I.1.4. Le potentiel thérapeutique de la signalisation purinergique ... 23
I.2.LES ESPECES REACTIVES DE L’OXYGENE (ROS) ... 26
I.2.1. Les ROS et leurs effets ... 26
I.2.2. Les systèmes antioxydants... 28
I.2.3. Les sources des ROS ... 30
I.3.LA CYTOKINE INTERLEUKINE-1β (IL-1β) ... 34
I.3.1. L’IL-1β et ses effets... 34
I.3.2. La synthèse de la pro-IL-1β... 36
I.3.3. Le clivage de la pro-IL-1β et la libération d’IL-1β mature... 39
I.4.LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DE LA FAMILLE DES CATHELICIDINES. 42 I.4.1. Les peptides antimicrobiens... 42
I.4.2. Les cathélicidines... 43
I.4.2.1. La régulation de l’expression des cathélicidines... 45
I.4.2.2. La structure des cathélicidines ... 46
I.4.2.3. Les propriétés antimicrobiennes des cathélicidines ... 47
I.4.2.4. Les effets des cathélicidines sur les cellules eucaryotes ... 49
I.5.LES MACROPHAGES ... 50
I.5.1. Historique ... 50
I.5.4. Rôles dans l’immunité... 52
I.5.5. Les récepteurs purinergiques dans les macrophages ... 53
I.6.LES GLANDES SALIVAIRES ET LA SALIVE ... 54
I.6.1. Anatomie et histologie des glandes salivaires ... 54
I.6.2. Physiologie de la sécrétion salivaire ... 56
I.6.3. Composition et rôles de la salive ... 59
I.6.4. Les récepteurs purinergiques dans les glandes salivaires... 62
I.7.OBJECTIFS DU TRAVAIL ... 62
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES II.1.MATERIEL ... 65
II.1.1. Les animaux ... 65
II.1.2. Les réactifs et substances ... 66
II.2.METHODES... 68
II.2.1. Préparation des milieux... 68
II.2.2. Prélèvement des macrophages péritonéaux ... 70
II.2.3. Préparation de la suspension brute de cellules à partir des glandes sous- maxillaires de souris ... 71
II.2.4. Séparation des cellules ductales et acineuses ... 71
II.2.5. Prélèvement de la salive ... 72
II.2.6. Dosage des protéines... 72
II.2.7. Mesure de l’activité de l’amylase ... 73
II.2.8. Mesure de la concentration intracellulaire en calcium ([Ca2+]i) ... 73
II.2.9. Mesure du potassium intracellulaire ... 77
II.2.10. Mesure des espèces réactives de l’oxygène (ROS) ... 79
II.2.11. Mesure de la perméabilité membranaire... 80
II.2.12. Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) ... 81
II.2.13. Test de cytotoxicité (test MTT) ... 82
II.2.14. Mesure de l’activité de la phospholipase A2 (PLA2) ... 84
II.2.15. Dosage de l’interleukine-1β (IL-1β) par ELISA ... 85
II.2.15.1. Préparation des échantillons ... 85
II.2.15.2. Dosage de l’IL-1β... 86
II.2.16. Mise en évidence de l’expression des récepteurs purinergiques, de l’expression et de la sécrétion de pro-IL-1β et d’IL-1β et de la phosphorylation d’IκB par Western blot... 87
II.2.16.1. Préparation des échantillons ... 87
II.2.16.2. Electrophorèse ... 89
II.2.16.3. Transfert... 90
II.2.16.4. Incubation en présence des anticorps ... 90
II.2.16.5. Révélation ... 91
II.2.17. Mise en évidence des transcrits de la pro-IL-1β, du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 par RT-PCR ... 91
II.2.17.1. Extraction des ARN totaux... 91
II.2.17.2. Transcription inverse des ARN en ADN complémentaires (ADNc) ... 92
II.2.17.3. Polymérisation en chaîne (PCR) des ADNc... 92
II.2.17.3. Electrophorèse sur gel d’agarose ... 93
II.2.18. Séquençage de l’ADNc du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88 ... 94
FTIR) ... 94
II.2.20. Analyse statistique des résultats ... 95
CHAPITRE III : EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES III.1. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X7... 96
III.2. L’EXPRESSION DES RECEPTEURS P2X4... 101
CHAPITRE IV : PRODUCTION DE ROS EN REPONSE A L’ATP DANS LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES IV.1. INTRODUCTION ... 104
IV.2. RESULTATS ... 105
IV.2.1 Production de ROS en réponse à l’ATP dans les macrophages péritonéaux ... 105
IV.2.2. Production de ROS suite à l’activation de récepteurs purinergiques dans les glandes sous-maxillaires ... 112
IV.2.3. Caractérisation des récepteurs purinergiques impliqués dans la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires... 116
IV.2.4. Mécanismes couplant l’activation des récepteurs P2X7 à la production de ROS dans les glandes sous-maxillaires ... 119
IV.2.5. Identification de la source de ROS produits suite à l’activation des récepteurs P2X7 dans les glandes sous-maxillaires ... 123
IV.3. DISCUSSION ... 126
CHAPITRE V : ETUDE DE L’EXPRESSION ET DE LA SECRETION D’IL-1ββββ PAR LES MACROPHAGES PERITONEAUX ET LES GLANDES SOUS-MAXILLAIRES V.1. INTRODUCTION... 131
V.2. RESULTATS ... 132
V.2.1. Concentration salivaire d’IL-1β... 132
V.2.2. Expression d’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous-maxillaires ... 135
V.2.3. Etude de la phosphorylation d’IκB... 139
V.2.4. Expression du récepteur TLR4, de CD14 et de MyD88... 140
V.2.5. Régulation de la sécrétion d’IL-1β dans les macrophages et les glandes sous- maxillaires ... 141
V.3. DISCUSSION ... 146
CHAPITRE VI : REGULATION DES REPONSES DES MACROPHAGES PERITONEAUX A L’ATP PAR LE PEPTIDE ANTIMICROBIEN CRAMP VI.1. INTRODUCTION ... 151
VI.2. RESULTATS ... 152
VI.2.1. Effet du CRAMP sur la variation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP... 152
VI.2.2. Interaction entre le CRAMP et le canal cationique activé par l’ATP... 155
VI.2.3. Effet des agonistes des récepteurs des peptides formylés (FPR) sur l’augmentation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP ... 160
VI.2.6. Effet du CRAMP sur la production de ROS en réponse à l’ATP ... 166
VI.2.7. Effet du CRAMP sur la libération d’IL-1β en réponse à l’ATP... 168
VI.2.8. Etude de la structure secondaire du CRAMP... 169
VI.3. DISCUSSION ... 172
CHAPITRE VII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES... 177
BIBLIOGRAPHIE ... 180
ANNEXES... 217
RESUME
Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à étudier certaines réponses cellulaires secondaires à l’activation des récepteurs purinergiques P2X dans deux modèles différents, les macrophages péritonéaux et les cellules des glandes sous-maxillaires. Ces cellules contribuent à notre immunité innée, soit tournée vers l’intérieur (macrophages), soit vers l’extérieur (glandes sous-maxillaires).
Nous avons dans un premier temps confirmé par Western blot et par des dosages de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i) que les deux types de cellules étudiés expriment des récepteurs P2X4 et P2X7 fonctionnels.
Nous nous sommes alors concentrés sur deux réponses impliquées dans la protection de l’hôte contre les agressions et l’élimination de pathogènes : la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β). Nos résultats montrent que la production de ROS en réponse à l’ATP extracellulaire est secondaire à l’activation d’une NADPH oxydase dans les deux types de cellules. Cette réponse est médiée par les récepteurs P2X7 ainsi que, dans les macrophages, par d’autres récepteurs purinergiques comme par exemple les récepteurs P2X4 et des récepteurs P2Y. Dans les glandes exocrines, contrairement aux macrophages, la protéine kinase C ainsi que ERK1/2 interviennent dans l’activation de la NADPH oxydase.
Par la suite nous avons comparé la régulation de l’expression et de la sécrétion d’IL- 1β par les macrophages et les glandes sous-maxillaires. Nous avons observé que l’IL-1β est présente dans la salive collectée chez des souris injectées par de la pilocarpine. Des analyses par ELISA, RT-PCR et Western blot montrent que la cytokine est exprimée de manière constitutive par les cellules acineuses et ductales des glandes sous-maxillaires, à un niveau plus élevé que dans les macrophages. Contrairement aux cellules phagocytaires, l’expression de la cytokine dans les cellules des glandes salivaires n’est pas augmentée suite à la stimulation par des lipopolysaccharides. De même, dans ces cellules l’ATP n’a pas provoqué la sécrétion d’IL-1β malgré l’efflux de K+ secondaire à l’activation des récepteurs P2X7.
Dans une dernière série d’expériences nous avons évalué les effets du peptide antimicrobien CRAMP sur les macrophages murins. Le CRAMP a inhibé toutes les réponses secondaires à l’activation des récepteurs P2X7 (ouverture du canal cationique, formation de pore, production de ROS, libération d’IL-1β, d’acide oléique et de lactate déshydrogénase).
L’inhibition par le CRAMP de l’augmentation de la [Ca2+]i en réponse à l’ATP n’était pas médiée par les récepteurs aux peptides formylés car les agonistes de ces récepteurs n’ont pas bloqué cette augmentation. Le CRAMP n’a pas eu d’effet sur l’augmentation de la [Ca2+]i
secondaire à l’activation des récepteurs P2X4 par une combinaison d’ATP et d’ivermectine.
Nos expériences ont révélé que les récepteurs P2X7 sont couplés à diverses voies de signalisation dans les macrophages et dans les glandes exocrines. Les voies activées diffèrent en fonction du type de cellules. Nous avons également conclu que les peptides antimicrobiens de la famille de cathélicidines ne sont pas des agonistes universels des récepteurs P2X7.
LISTE DES ABREVIATIONS
[Ca2+]i : concentration intracellulaire de calcium [K+]i : concentration intracellulaire de potassium α,β-meATP : α,β-méthylène adénosine 5’-triphosphate β,γ-meATP : β,γ-méthylène adénosine 5’-triphosphate 2MeSADP : 2-(méthylthio)adénosine 5’-diphosphate 2MeSATP : 2-(méthylthio)adénosine 5’-triphosphate ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire ADP : adénosine 5’-diphosphate
AEBSF : 4-(2-aminoéthyl) benzènesulfonyle fluorure AMP : adénosine 5’-monophosphate
AMPA : acide (2-amino-3-(5-méthyl-3-oxo-1,2- oxazol-4-yl) propionique AMPc : adénosine 5’-monophosphate cyclique
ARN : acide ribonucléique
ARNm : acide ribonucléique messager ATP : adénosine 5’-triphosphate
ATPγS : adénosine 5’-(γ-thio) triphosphate
BAPTA : acide 1,2-bis(2-aminophénoxy)-éthane-N,N,N’,N’-tétraacétique BCA : acide bicinchoninique
BEL : bromoénol lactone
BIM : bisindolylmaléimide
BSA : albumine de sérum bovin
BzATP : 2’,3’-O-(4-benzoylbenzoyl)adénosine 5’-triphosphate Carbachol : carbamylcholine
CD : cluster of differentiation
CFTR : régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)
CRAMP : cathelin-related antimicrobial peptide CTP : cytidine 5′-triphosphate
Da : Dalton
DAG : diacylglycérol
DAMP : motifs structuraux associés aux signaux de danger ou de dommage (damage/danger associated molecular pattern)
DCF : dichlorofluorescéine
DCFH : dichlorodihydrofluorescéine
DCFH/DA : dichlorodihydrofluorescéine diacétate
DMSO : diméthylsulfoxyde
dNTP : désoxyribonucléotides triphosphates
DPI : diphénylène iodonium
EC50 : concentration efficace à 50 % EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique EGF : facteur de croissance épidermique
EGTA : acide éthylène glycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
ENaC : canal épithélial du sodium
E-NTPDases : ectonucléosides triphosphates diphosphohydrolases E-NPPs : ectonucléotides pyrophosphatases/phosphodiestérases
Eq : équation
ERK1/2 : kinase régulée par les signaux extracellulaires (extracellular signal- regulated kinase)
FADH2/FAD : flavine adénine dinucléotide réduit/oxydé
FBS : sérum fœtal bovin
FCCP : carbonyl cyanide p-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone fMLF : N-formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine
FPR : récepteurs aux peptides formylés
fura-2 : acide 1-[2-(5-carboxylazol-2-yl)-6-aminobenzo-furan-5-oxy]-2- (2’amino-5’-méthylphénoxy)-éthane-N,N,N’,N’-tétraacétique fura-2/AM : ester acétoxyméthyl du fura-2
GABA : acide γ-aminobutyrique
G-CSF : facteur stimulant les granulocytes (granulocyte colony stimulating factor)
GM-CSF : facteur stimulant les granulocytes et les macrophages (granulocyte macrophage colony stimulating factor)
GTP : guanosine 5’-triphosphate
hCAP18 : human cationic antimicrobial peptide HBSS : Hank’s balanced salt solution
HEPES : acide N-[2-hydroxyéthyl] pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]
HRP : peroxydase de raifort
IDP : inosine 5’-diphosphate
Ig : immunoglobuline
IκB : protéine inhibitrice de NF-κB
IKK : kinase d’IκB
IL : interleukine
IL-1R1 : récepteur 1 de l’interleukine-1
IL-1Ra : antagoniste du récepteur 1 de l’interleukine-1
IL-1R-AcP : protéine accessoire du récepteur 1 de l’interleukine-1 IP3 : inositol 1,4,5 trisphosphate
ITP : inosine 5’-triphosphate
Kd : constante de dissociation
KN-62 : 1-[N,O-bis-(5-isoquinolinesulfonyl)-N-méthyl-L-tyrosyl]-4- phénylpipérazine
LBP : protéine liant les lipopolysaccharides LDH : lactate déshydrogénase
L-NAME : N-nitro-L-arginine méthyl ester
LPS : lipopolysaccharides
LRR : motifs répétitifs riches en leucine (leucine-rich repeat) LY294002 : 2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-1-benzopyran-4-one
MAPK : protéine kinase activée par un mitogène (mitogen-activated protein kinase)
M-CSF : facteur stimulant les macrophages (macrophage colony stimulating factor)
MEK : MAPK/ERK kinase
MES : acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique MOPS : acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique MyD88 : myeloid differentiation primary response gene
MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium NADPH/NADP+ : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit/oxydé
NF-κB : facteur nucléaire κB
NGF : facteur de croissance des nerfs NMDA : acide N-méthyl-D-aspartique
NMDG : N-méthyl-D-glucosamine
oATP : ATP oxydé (adénosine 5’-triphosphate 2’,3’-dialdéhyde)
PAMP : motifs structuraux associés aux pathogènes (pathogen-associated molecular pattern)
pb : paires de bases
PBFI : potassium-binding benzofuran isophtalate PBFI/AM : ester acétoxyméthyl du PBFI
PBS : phosphate-buffered saline
PD98059 : 2’-amino-3’-méthoxyflavone PI3K : phosphatidylinositol 3 kinase PI4K : phosphatidylinositol 4 kinase
PK : protéine kinase
PLA2 : phospholipase A2
cPLA2 : phospholipase A2 cytosolique dépendante du calcium iPLA2 : phospholipase A2 indépendante du calcium
PLC : phospholipase C
PLD : phospholipase D
PMA : phorbol myristate acétate (12-o-tétradécanoylphorbol-13-acétate) PNP : purine nucléoside phosphorylase
PPADS : acide pyridoxalphosphate-6-azophényl-2’-4’-disulfonique PPI-PLC : phospholipase C spécifique des polyphosphoinositides PVDF : polyfluorure de vinylidène
RMN : résonance magnétique nucléaire ROS : espèces réactives de l’oxygène
RT-PCR : polymérisation en chaîne après transcription inverse RXR : récepteur aux rétinoïdes
SDS : sodium dodécylsulfate
SEM : écart étalon de la moyenne (standard error of the mean)
SOD : superoxyde dismutase
Souris P2X7-WT : souris de type sauvage
Souris P2X7-KO : souris knockout, invalidées pour le gène codant pour le récepteur P2X7
Spectroscopie ATR- : spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, à réflexion totale FTIR atténuée
TBE : tampon TRIS-borate-EDTA
TEEI : tampon TRIS-EDTA-EGTA-inhibiteurs protéases
TIR : Toll-IL-1 receptor domain
TLR : Toll like receptor
TNFR1 : récepteur 1 du facteur de nécrose tumorale TRIS : tris(hydroxyméthyl)-aminométhane u.a.f. : unités arbitraires de fluorescence
U73122 : 1-[6-[((17β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-yl)amino]hexyl]-1H- pyrrole-2,5-dione
U73343 : 1-[6-[((17β)-3-méthoxyestra-1,3,5[10]-trien-17-yl)amino]hexyl]-2,5- pyrrolidinedione
UDP : uridine 5’-diphosphate
UDPβS : uridine 5’-(β-thio) diphosphate UTP : uridine 5’-triphosphate
UTPγS : uridine 5’-(γ-thio) triphosphate VDR : récepteur de la vitamine D
VDRE : élément de réponse à la vitamine D VIP : peptide intestinal vasoactif
VNUT : transporteur vésiculaire des nucléotides (vesicular nucleotide transporter)
CHAPITRE I INTRODUCTION
I.1. LES RECEPTEURS PURINERGIQUES
Pendant de longues années l’adénosine 5’-triphosphate (ATP) a été considéré uniquement comme réserve d’énergie des cellules, l’hydrolyse du lien anhydride entre les trois phosphates libérant de l’énergie utilisée pour le métabolisme cellulaire. C’est donc au niveau intracellulaire que sa concentration est la plus élevée, tandis que sa concentration extracellulaire est beaucoup plus faible (Bours et al., 2006). Aujourd’hui, les nucléotides et les nucléosides sont aussi considérés comme molécules de la signalisation extracellulaire (Burnstock, 2006 a). En effet, l’ATP et ses dérivés sont libérés localement par des cellules, ils activent des récepteurs purinergiques situés au niveau de la membrane de diverses cellules et ils sont hydrolysés par de multiples ectoenzymes, ce qui régule leur concentration extracellulaire.
I.1.1. Historique
En 1929, un premier article décrivant les activités physiologiques des purines a été publié par Drury et Szent-Györgyi. Ces travaux montraient que les dérivés de l’adénine avaient des effets sur le cœur et les vaisseaux sanguins (Drury et Szent-Györgyi, 1929).
D’autres études menées quelques années plus tard ont confirmé les actions des nucléosides et nucléotides au niveau des vaisseaux. Un premier indice suggérant que l’ATP pourrait éventuellement être un neurotransmetteur est apparu en 1959, quand Holton montra que pendant des stimulations antidromiques il y a une libération d’ATP par des branches collatérales des fibres sensitives afférentes, en quantité suffisante pour entraîner une vasodilatation des artères de l’oreille de lapin. Le concept de neurotransmission purinergique a été proposé pour la première fois en 1972 par Burnstock. Selon lui, l’ATP était le neurotransmetteur responsable de la transmission non-cholinergique, non-adrénergique au
niveau de la musculature lisse du tractus gastro-intestinal et de la vessie. Ce nouveau concept a, au début, suscité une forte opposition, beaucoup considérant l’ATP uniquement comme source d’énergie. En 1976, Burnstock a évoqué la possibilité de la co-transmission, le fait donc que certaines terminaisons nerveuses stockent et libèrent plusieurs neurotransmetteurs.
C’est également lui qui, en 1978, a proposé de classer les récepteurs purinergiques en deux groupes, les récepteurs purinergiques P1, sélectifs de l’adénosine et inhibés par de faibles concentrations de méthylxanthines, et les récepteurs purinergiques P2 qui reconnaissent principalement l’ATP et l’ADP. A peu près au même moment deux sous-types des récepteurs P1 ont été découverts, appelés A1 et A2 (Van Calker et al., 1979). En 1985, une première sous-division des récepteurs P2 en P2X et P2Y a été proposée par Burnstock et Kennedy.
Cette classification était basée sur le profil pharmacologique et la distribution tissulaire des récepteurs, les récepteurs P2X ayant comme agonistes les plus puissants l’α,β-meATP et le β,γ-meATP, et les récepteurs P2Y activés surtout par la 2MeSATP. D’autres sous-types de récepteurs P2 ont été découverts au cours des années suivantes, parmi lesquels les récepteurs P2T, sélectifs de l’ADP et impliqués dans l’agrégation plaquettaire, les récepteurs P2Z, activés par l’ATP4- (Gordon, 1986), les récepteurs P2U ayant comme agoniste l’ATP et l’UTP de manière équivalente (O’Connor et al., 1991), et les récepteurs P2D, proposés être responsables des effets biologiques des polyphosphates de diadénosine (Pintor et al., 1993).
La nomenclature des récepteurs P2 a été révisée suite à la mise en évidence de deux mécanismes de transduction différents, à savoir des canaux ioniques intrinsèques et le couplage à des protéines G (Benham et Tsien, 1987 ; Dubyak, 1991), ainsi que suite au clonage des deux premiers récepteurs P2, le P2Y1 (Webb et al., 1993) et le P2Y2 (Lustig et al., 1993). En 1994, Abbracchio et Burnstock ont ainsi proposé une nomenclature adoptée par la plupart des scientifiques, basée sur la structure et les mécanismes de transduction, à savoir une classification des récepteurs purinergiques P2 en deux familles majeures, les récepteurs P2X, ionotropes, et les récepteurs P2Y, métabotropes.
I.1.2. Les nucléotides et les nucléosides
I.1.2.1. Stockage et libération d’ATP dans l’espace extracellulaire
La concentration intracellulaire d’ATP est proche de 1 à 5 mM. Cet ATP cytosolique constitue la source de nucléotide extracellulaire (Miller et Horowitz, 1986). La concentration extracellulaire d’ATP est beaucoup plus faible, avec des concentrations plasmatiques physiologiques de l’ordre du micro- ou nanomolaire (Bours et al., 2006). Des concentrations plus élevées d’ATP sont stockées dans les vésicules sécrétoires des neurones et sont co- libérées avec des neurotransmetteurs comme l’acétylcholine, la noradrénaline ou le peptide intestinal vasoactif (VIP) (Burnstock, 2009). Il a été montré que le transporteur vésiculaire des nucléotides (vesicular nucleotide transporter, VNUT) dépend du chlorure et appartient à la famille SLC17 des transporteurs anioniques. Ce transporteur intervient dans l’accumulation d’ATP dans les vésicules (Sawada et al., 2008). L’ATP et probablement d’autres nucléotides sont également stockés à des concentrations élevées dans les granules denses des plaquettes, dans les granules chromaffines des médullo-surrénales (Abbracchio et al., 2006) et dans les granules contenant de l’insuline des cellules β pancréatiques (Novak, 2003 ; Obermuller et al., 2005). La stimulation de ces cellules par des impulsions nerveuses ou par des agonistes provoque l’exocytose de l’ATP de ces vésicules. Les cellules non-excitables, comme les cellules épithéliales ou endothéliales, les fibroblastes, les astrocytes et les hépatocytes peuvent également libérer des nucléotides (Lazarowski et al., 2003). Différents stimuli sont susceptibles de provoquer cette libération, parmi lesquels des contraintes de cisaillement (shear stress), l’hypoxie, le gonflement osmotique (Burnstock, 2007 a), ainsi que la stimulation par des agonistes cholinergiques (Sorensen et Novak, 2001 ; Novak et al., 2010).
La libération spontanée ou constitutive de nucléotides a été suggérée pour beaucoup de cellules, comme les cellules épithéliales bronchiques, les cellules de gliome de rat C6, les cellules d’astrocytome humain 1321N1 (Lazarowski et al., 2000 ; Lazarowski et al., 2003), les cellules de la lignée de macrophages BAC1.2F5 (Beigi et Dubyak, 2000) et les cellules d’hépatome de rat (Roman et al., 1999). Finalement la lyse cellulaire peut également entraîner la libération des nucléotides intracellulaires.
Des mécanismes de transport spécifiques sont nécessaires pour la libération de l’ATP car le nucléotide ne diffuse pas à travers la membrane plasmique à cause de ses charges nettes négatives (voir Praetorius et Leipziger, 2009, pour revue). Certains de ces mécanismes restent controversés, comme le mécanisme de conductance d’anions activé par le gonflement cellulaire (cell-swelling activated anion conductance) ou l’implication du régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR). L’hémicanal de connexine a également été proposé comme mécanisme de transport de l’ATP (Cotrina et al., 1998 ; Kang et al., 2008 ; Li et al., 2010), et certaines études ont montré que les pannexines seraient des pores pour la libération d’ATP (Bao et al., 2004 ; Ransford et al., 2009 ; Li et al., 2010). La libération vésiculaire de l’ATP pourrait également être un phénomène ubiquitaire de la plupart des cellules (Maroto et al., 2001).
I.1.2.2. Métabolisme de l’ATP dans l’espace extracellulaire
La concentration d’ATP mesurée au niveau des surfaces épithéliales ou dans des sécrétions dépend de l’activité d’enzymes qui métabolisent les nucléotides et les nucléosides.
En effet, après la libération d’ATP dans l’espace extracellulaire, sa demi-vie est très courte suite à sa dégradation rapide en ADP, AMP et adénosine. Les ecto-enzymes sont localisées à la surface des cellules ou peuvent être retrouvées sous forme soluble dans le milieu interstitiel ou dans les liquides corporels. Ces enzymes incluent les ectonucléosides triphosphates diphosphohydrolases (E-NTPDases), les ectonucléotides pyrophosphatases/
phosphodiestérases (E-NPPs), l’ecto-5’-nucléotidase et les phosphatases alcalines (Yegutkin, 2008). Les E-NTPDases hydrolysent les nucléosides triphosphates et diphosphates mais pas les monophosphates. Huit gènes différents codent pour les membres de cette famille, le prototype étant la protéine CD39. La famille des E-NPPs comprend sept membres qui hydrolysent les liens phosphodiester et pyrophosphate. Ces enzymes possèdent un large spectre de substrats (Stefan et al., 2005), et seuls les trois premiers membres de cette famille peuvent hydrolyser les nucléotides (Goding et al., 2003). Les 5’-nucléotidases hydrolysent l’AMP en adénosine. Un seul des sept membres de la famille des 5’-nucléotidases, le CD73, est associé aux surfaces. Les phosphatases alcalines déphosphorylent divers substrats, y compris les nucléotides. L’ATP extracellulaire est ainsi dégradé en ADP, AMP et finalement en adénosine. Celle-ci active des récepteurs purinergiques P1. Le nucléoside peut également
être recapturé par les cellules grâce à des transporteurs spécifiques des nucléosides, ou il peut être inactivé via l’inosine en hypoxanthine suite à l’action séquentielle de l’adénosine désaminase et de la purine nucléoside phosphorylase (PNP) (Fig. 1.1) (Yegutkin, 2008).
A part ces enzymes intervenant dans la dégradation des nucléotides d’autres enzymes ont été décrites, qui catalysent la synthèse de différents nucléotides. L’ATP peut ainsi être synthétisé via des réactions de transfert de groupement phosphate, par l’adénylate kinase et la nucléoside diphosphate kinase. Ces enzymes, d’abord décrits comme enzymes intracellulaires peuvent aussi être exprimés à la surface de différents types cellulaires (Yegutkin, 2008).
Figure 1.1 : Mécanismes d’inactivation des purines au niveau de la surface cellulaire.
Les nucléotides sont hydrolysés par plusieurs ectoenzymes (E-NPPs, E-NTPDases, ecto-5’- nucléotidases). L’adénosine résultant est à son tour désaminée en inosine (Ino) puis libère de l’hypoxanthine (Hyp) par action séquentielle de l’adénosine désaminase et de la PNP (Yegutkin, 2008).
I.1.3. Les récepteurs purinergiques
I.1.3.1. Les récepteurs P1
Les récepteurs P1 sont activés principalement par l’adénosine. Jusqu’à ce jour quatre sous-types ont été clonés, les récepteurs A1, A2A, A2B et A3. Ces récepteurs font partie de la famille des récepteurs métabotropes et ils sont distribués de façon hétérogène dans différents tissus. Comme tous les récepteurs couplés à des protéines G, ils possèdent sept segments transmembranaires, formés chacun d’une hélice α d’approximativement 21 à 28 acides aminés hydrophobes (Fig. 1.2). L’extrémité N-terminale de la protéine se trouve du côté extracellulaire, tandis que l’extrémité C-terminale se trouve du côté cytoplasmique (Ralevic et Burnstock, 1998).
Figure 1.2 : Structure schématique du récepteur A1.
Le récepteur A1 possède sept domaines transmembranaires (I-VII) d’acides aminés hydrophobes, connectés entre eux par trois boucles extracellulaires et trois boucles intracellulaires. La localisation des résidus histidine (H) dans les régions transmembranaires VI et VII, qui joueraient un rôle dans la fixation de ligand, est indiquée. S-S indique la présence possible de ponts disulfures (Fields et Burnstock, 2006).
Les récepteurs A1 sont couplés à différentes protéines G. Une stimulation de ces récepteurs par des agonistes a pour effet une inhibition de l’adénylate cyclase, entraînant une diminution de la concentration intracellulaire du second messager AMPc. Leur stimulation peut également activer la phospholipase C (PLC), menant à la production d’inositol 1,4,5- trisphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG), et elle permet l’activation de différents types de canaux potassiques. Les récepteurs A2 sont divisés en deux sous-types, les récepteurs A2A
et A2B, qui activent l’adénylate cyclase via une protéine Gs essentiellement. Le récepteur A2B
humain peut également être couplé à une protéine Gq/11. L’activation des récepteurs A3
entraîne une inhibition de l’adénylate cyclase et une augmentation des taux d’IP3 et de Ca2+
intracellulaires (Ralevic et Burnstock, 1998).
I.1.3.2. Les récepteurs P2
Les récepteurs P2 sont les récepteurs sensibles à l’ATP. En 1994, Abbracchio et Burnstock ont proposé de classer les récepteurs P2 en deux grandes familles, les récepteurs ionotropes P2X, formant un canal cationique non spécifique, et les récepteurs métabotropes P2Y, couplés aux protéines G. A ce jour, sept sous-types de récepteurs P2X et huit sous-types de récepteurs P2Y ont été clonés et caractérisés chez les mammifères (Ralevic et Burnstock, 1998).
I.1.3.2.1. Les récepteurs P2Y
Après le clonage en 1993 des récepteurs P2Y1 et P2Y2, d’autres sous-types de récepteurs P2Y ont été clonés : P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13 et P2Y14. Les nombres manquants représentent des récepteurs clonés chez des espèces autres que les mammifères ou des récepteurs possédant une séquence proche de celle des récepteurs P2Y mais pour lesquels aucune réponse fonctionnelle aux nucléotides n’est connue (Abbracchio et al., 2006).
Structure
Contrairement aux récepteurs P2X, les gènes codant pour les récepteurs P2Y ne contiennent pas d’introns dans leur séquence codante, à l’exception du récepteur P2Y11
(Burnstock, 2007 b). Les récepteurs P2Y sont des protéines constituées de 328 à 377 acides aminés. Ils présentent la structure typique des récepteurs couplés aux protéines G, comprenant
une extrémité N-terminale extracellulaire, qui contient des sites potentiels de N-glycosylation, une extrémité C-terminale intracellulaire, qui contient des sites consensus de phosphorylation par des protéines kinases, et sept segments transmembranaires (Fig. 1.3).
D’un point de vue structural deux sous-groupes de récepteurs P2Y peuvent être identifiés. Le premier sous-groupe comprend les récepteurs P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, et P2Y11, et le deuxième sous-groupe comprend les récepteurs P2Y12, P2Y13 et P2Y14 possédant des séquences assez proches (Abbracchio et al., 2003).
Figure 1.3 : Structure schématique du récepteur P2Y.
Le récepteur P2Y possède sept domaines transmembranaires (I-VII) d’acides aminés hydrophobes, connectés entre eux par trois boucles extracellulaires (e2-e4) et trois boucles intracellulaires (i1-i3). L’extrémité N-terminale est extracellulaire (e1) tandis que l’extrémité C-terminale se situe au niveau intracellulaire (i4). S-S indique la présence possible de ponts disulfures. Les cercles verts représentent des acides aminés qui sont conservés entre les récepteurs P2Y1, P2Y2 et P2Y6, les cercles jaunes indiquent les résidus non conservés, et les cercles rouges représentent des résidus importants pour la fonction d’autres récepteurs couplés aux protéines G (Fields et Burnstock, 2006).
Pharmacologie
Les récepteurs P2Y sont couplés aux différentes protéines G. Un récepteur P2Y particulier peut être couplé à différentes protéines G et activer différentes voies de signalisation intracellulaire. En fonction du ligand, l’une ou l’autre de ces voies de signalisation peut être activée. Les récepteurs P2Y1, P2Y2, P2Y4 et P2Y6 sont couplés à l’activation d’une PLC via Gq/11. Leur activation entraîne la formation d’IP3 et la mobilisation du calcium intracellulaire. Le récepteur P2Y4 est également couplé à Gi/0. L’activation du récepteur P2Y11 par l’ATP conduit à une augmentation d’AMPc et d’IP3, alors que l’activation par l’UTP entraîne une mobilisation du calcium intracellulaire sans augmentation d’IP3 et d’AMPc. Les récepteurs P2Y12, P2Y13 et P2Y14 sont surtout couplés à Gi (Abbracchio et al., 2006 ; Burnstock, 2007 b).
D’un point de vue pharmacologique les récepteurs P2Y peuvent être subdivisés en quatre groupes (Abbracchio et al., 2006) :
• les récepteurs ayant plus d’affinité pour les purines (activés préférentiellement par l’ADP et l’ATP), parmi lesquels les récepteurs P2Y1, P2Y11, P2Y12, P2Y13 ;
• les récepteurs ayant plus d’affinité pour les pyrimidines (répondant à l’UDP et à l’UTP), parmi lesquels le récepteur P2Y4 humain et le récepteur P2Y6 ;
• les récepteurs à sélectivité mixte, parmi lesquels le récepteur P2Y2 et le récepteur P2Y4 de rongeur ;
• le récepteur P2Y14 répondant à l’UDP-glucose et à l’UDP-galactose.
Sous-types des récepteurs P2Y
Récepteurs P2Y1 : Le récepteur P2Y1 a d’abord été cloné à partir du cerveau de poussin (Webb et al., 1993). Dans la plupart des espèces, l’ADP est un agoniste plus puissant que l’ATP, et leurs dérivés 2-méthylthio sont plus puissants. L’UTP, l’UDP, le CTP et le GTP sont inactifs (Waldo et Harden, 2004). L’agoniste le plus puissant et le plus sélectif connu à ce jour est un analogue du 2MeSADP, le MRS2365 (Chhatriwala et al., 2004). Plusieurs antagonistes très sélectifs et puissants existent, le MRS2179, le MRS2279 et le MRS2500 (Jacobson et al., 2009). Ces récepteurs sont largement distribués au niveau des tissus, notamment au niveau des plaquettes et des cellules endothéliales (Abbracchio et al., 2006).
Récepteurs P2Y2 : Le récepteur P2Y2, anciennement appelé P2U, a d’abord été cloné à partir de cellules du neuroblastome de souris (Lustig et al., 1993). Ce récepteur est activé par des
concentrations équivalentes d’ATP et d’UTP (Lustig et al., 1993), sauf le récepteur de porc, insensible à l’ATP (Shen et al., 2004), tandis que leurs dérivés diphosphates sont moins puissants. L’UTPγS est également un agoniste du récepteur P2Y2 (Lazarowski et al., 1995), de même que l’INS365 et l’INS37217 (Jacobson et al., 2009). La suramine est un antagoniste des récepteurs P2Y2 du rat et de l’homme. D’autres antagonistes du P2Y2 sont l’AR-C126313 et l’AR-C118925 (Burnstock, 2007 b). Ce récepteur est exprimé dans différents tissus, dont le cœur et le cerveau (Abbracchio et al., 2006). Le récepteur P2Y2 est couplé à la PLC via une protéine Gq/11. Son activation augmente la synthèse et/ou la libération d’acide arachidonique, de prostaglandines et d’oxyde nitrique (Xu et al., 2003).
Récepteurs P2Y4 : Les récepteurs P2Y4 ont d’abord été clonés chez l’homme (Communi et al., 1995). L’UTP est l’agoniste le plus puissant du récepteur recombinant humain P2Y4
(Nicholas et al., 1996). Le GTP et l’ITP sont 10 fois moins puissants que l’UTP (Communi et al., 1996 a). L’ATP agit en tant qu’antagoniste compétitif (Kennedy et al., 2000). En revanche, les récepteurs recombinants de rat et de souris sont activés de façon égale par l’ATP et l’UTP (Bogdanov et al., 1998 ; Webb et al., 1998). Chez l’homme, le transcrit et la protéine sont les plus abondants dans l’intestin mais sont également présents dans d’autres tissus (Moore et al., 2001).
Récepteurs P2Y6 : Ces récepteurs, d’abord clonés chez le rat (Chang et al., 1995) et l’homme (Communi et al., 1996 b), sont sélectifs de l’UDP. Les nucléotides les plus puissants sont : UDP > UTP > ADP > 2MeSATP >> ATP (Communi et al., 1996 b). Des agonistes plus résistants à la dégradation sont l’UDPβS, le MRS2633, le MRS2693 et l’INS48823 (Jacobson et al., 2009). Parmi les propriétés de ce récepteur on peut citer sa désensibilisation et son internalisation lentes (Robaye et al., 1997 ; Brinson et Harden, 2001). Le récepteur P2Y6 est exprimé au niveau de différents tissus.
Récepteurs P2Y11 : Le récepteur P2Y11 a d’abord été cloné chez l’Homme, à partir de placenta (Communi et al., 1997). Il est unique parmi tous les récepteurs P2Y. C’est le seul récepteur P2Y dont le gène contient un intron. L’intron de 1,9 kpb sépare l’exon codant pour les six premiers acides aminés du second exon (Communi et al., 2001 a). L’ATP a une affinité assez faible pour ce récepteur qui est couplé à la fois à la PLC et à l’adénylate cyclase.
L’ATPγS est plus puissant que l’ATP. Un autre agoniste puissant est l’AR-C67085 qui est également un antagoniste du récepteur P2Y12 (Jacobson et al., 2009).
Récepteurs P2Y12 : Ce récepteur, cloné en 2001 chez l’homme (Hollopeter et al., 2001 ; Savi et al., 2001 ; Zhang et al., 2001), le rat (Hollopeter et al., 2001) et la souris (Foster et al., 2001), possède comme agoniste naturel l’ADP. Il est fortement exprimé dans les mégacaryocytes et les plaquettes où il est la cible de plusieurs médicaments (voir partie I.1.4.).
Récepteurs P2Y13 : Les récepteurs P2Y13 ont d’abord été clonés chez l’homme (Communi et al., 2001 b ; Zhang et al., 2002). Leurs agonistes naturels sont l’ADP et le 2MeSADP (Jacobson et al., 2009). L’IDP est un agoniste puissant du récepteur P2Y13 murin (Zhang et al., 2002). Le cangrelor (AR-C69931MX), antagoniste du récepteur P2Y12, est également un antagoniste du récepteur P2Y13 humain et de rat (Marteau et al., 2003 ; Fumagalli et al., 2004). Le récepteur P2Y13 est exprimé dans différents organes humains, surtout dans la rate et le cerveau (Communi et al., 2001 b).
Récepteurs P2Y14 : Le récepteur P2Y14, anciennement appelé récepteur à l’UDP-glucose, est identique à 47 % aux récepteurs P2Y12 et P2Y13. Il est activé par l’UDP-glucose, l’UDP- galactose, l’acide UDP-glucuronique et l’UDP-N-acétylglucosamine (Chambers et al., 2000).
A ce jour aucun antagoniste sélectif n’est disponible. L’ARNm de ce récepteur est largement distribué dans le corps humain.
I.1.3.2.2. Les récepteurs P2X
Les récepteurs P2X sont des récepteurs ionotropes. Ils font partie de la famille des canaux ioniques dépendants de ligands qui comprend, en plus des récepteurs P2X trimériques, les récepteurs pentamériques Cys-loop (récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, récepteurs de la sérotonine 5-HT3, récepteurs du GABAA, récepteurs de la glycine et récepteurs activés par le zinc) et les récepteurs tétramériques au glutamate (NMDA, AMPA, kainate) (Fig. 1.4).
Les premiers récepteurs P2X ont été clonés en 1994 (Valera et al., 1994 ; Brake et al., 1994).
Actuellement sept sous-unités de récepteurs P2X (P2X1-7) sont reconnues.
Figure 1.4 : Représentation schématique des trois familles de canaux ioniques dépendants de ligands.
La famille des récepteurs pentamériques Cys-loop comprend les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (ACh), les récepteurs de la sérotonine (5-HT3), les récepteurs du GABAA, les récepteurs de la glycine et les récepteurs activés par le zinc (zinc-activated channels, ZAC).
Les récepteurs tétramériques au glutamate sont sous-divisés en récepteurs NMDA, AMPA et kainate. Les récepteurs purinergiques P2X sont des récepteurs trimériques.
Les cercles jaunes indiquent les résidus cystéine participant dans la formation de ponts disulfures. Les cylindres rouges indiquent des régions qui participent dans la conduction ionique/sélectivité (Collingridge et al., 2009).
Structure
Les sous-unités des récepteurs P2X comprennent des extrémités N- et C-terminales intracellulaires, deux segments transmembranaires et une large boucle extracellulaire. Le domaine extracellulaire contient dix résidus cystéine conservés formant plusieurs ponts disulfures, deux à six sites potentiels de N-glycosylation, une région hydrophobe pouvant jouer un rôle dans la régulation du canal par le magnésium, le zinc, le cuivre et d’autres cations, et un site de liaison pour l’ATP. Au niveau des extrémités intracellulaires on retrouve
des sites de liaison pour des protéines kinases (Burnstock, 2007 b). Les sous-unités des récepteurs P2X humains sont constituées de 379 (P2X6) à 595 (P2X7) acides aminés (Jarvis et Khakh, 2009). Les séquences de ces sous-unités possèdent une homologie inférieure à 50 %.
La sous-unité P2X7 diffère des autres par son extrémité C-terminale intracellulaire longue, contenant plusieurs domaines permettant son interaction avec des protéines intracellulaires (Denlinger et al., 2001 ; Kim et al., 2001).
Plusieurs sous-unités doivent s’associer pour constituer des récepteurs fonctionnels.
Des canaux cationiques homo- ou hétéro-multimériques sont ainsi formés (Torres et al., 1999), impliquant trois sous-unités (Nicke et al., 1998 ; Stoop et al., 1999 ; Jiang et al., 2003).
L’existence de plusieurs hétéromultimères a été décrite (P2X1/2, P2X1/4, P2X1/5, P2X2/3, P2X2/6
et P2X4/6). Le récepteur P2X6 est le seul qui ne forme pas d’homomultimères (Burnstock, 2007 b). La sous-unité P2X7 était pendant longtemps considérée comme la seule sous-unité ne formant pas d’hétéromères (Torres et al., 1999). En 2007, Guo et ses collaborateurs ont suggéré la formation d’hétéromères entre les récepteurs P2X4 et P2X7 (Guo et al., 2007).
Cependant, des études ultérieures ont conclu que ces récepteurs s’assemblent de manière prédominante sous forme d’homotrimères (Nicke et al., 2008 ; Boumechache et al., 2009 ; Antonio et al., 2011). La composition des récepteurs P2X détermine leurs propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Ces propriétés dépendent également de la présence de diverses variantes d’épissage ou de polymorphismes liés à un seul nucléotide.
Pharmacologie
L’activation des récepteurs P2X entraîne l’ouverture d’un canal cationique permettant le passage de cations tels que le Na+, le K+ et le Ca2+. Ceci est suivi d’une dépolarisation de la membrane entraînant l’activation de canaux calciques dépendant du potentiel de membrane (Erb et al., 2006). Il en résulte une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i). Certains récepteurs, notamment les récepteurs P2X2, P2X4 et P2X7, subissent des changements de conformation lors d’une stimulation prolongée. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation de la perméabilité à des ions de taille plus grande tels le NMDG+ ou le YOPRO-1 (Steinberg et al., 1987 ; Khakh et al., 1999 a ; Virginio et al., 1999).
L’activation des récepteurs P2X est généralement suivie par la désensibilisation plus ou moins rapide de ceux-ci. Les récepteurs P2X1 et P2X3 sont rapidement désensibilisés (< 1 seconde), tandis que les récepteurs P2X2, P2X4, P2X5 et P2X6 sont désensibilisés plus lentement. Le récepteur P2X7 est peu ou pas désensibilisé (North, 2002).
L’agoniste naturel des récepteurs P2X est essentiellement l’ATP. Au moins trois molécules du nucléotide se lient à la partie extracellulaire des récepteurs P2X (Bean, 1990 ; Ding et Sachs, 1999). Les récepteurs P2X diffèrent par rapport à leur sensibilité à l’ATP et à d’autres agonistes. Ainsi le récepteur P2X7 est activé par des concentrations d’ATP de l’ordre du millimolaire, tandis que les autres sous-types ont des EC50 de 0,1 à 10 µM pour l’ATP.
L’α,β-meATP est un analogue de l’ATP permettant la discrimination entre plusieurs sous- types de récepteurs P2X : seuls les récepteurs P2X1 et P2X3 sont activés par des faibles concentrations de cet agoniste. Le 2MeSATP et le BzATP sont d’autres agonistes des récepteurs P2X. L’activité des récepteurs P2X peut être régulée par certains ions, notamment par le Zn2+, par le pH, ou encore par l’ivermectine (P2X4). Différents antagonistes des récepteurs P2X ont été décrits, avec des spécificités variables par rapport aux sept sous-types.
Parmi ces antagonistes on trouve entre autres la suramine, le PPADS, le bleu de Coomassie, le KN-62 et l’ATP oxydé (Fig. 1.5) (Jarvis et Khakh, 2009). Des différences entre espèces ont été rapportées en ce qui concerne la sensibilité des récepteurs P2X aux différents agonistes et antagonistes (Young et al., 2007 ; Donnelly-Roberts et al., 2009).
Figure 1.5 : Structure chimique de certains agonistes, antagonistes et modulateurs des récepteurs P2X.
L’ATP, l’α,β-meATP, le 2MeSATP et le BzATP sont des agonistes des récepteurs P2X, tandis que l’ATP oxydé (oATP), le KN-62 et le PPADS sont des antagonistes. L’ivermectine est un modulateur des récepteurs P2X4.
Sous-types des récepteurs P2X
Récepteurs P2X1 : Le récepteur P2X1 a d’abord été cloné à partir de la musculature lisse du canal déférent de rat (Valera et al., 1994). Cette protéine de 399 acides aminés intervient dans la contraction des muscles lisses du canal déférent, de la vessie, d’artères et de veines (Di Virgilio et al., 2005). Le récepteur P2X1 est également retrouvé au niveau des plaquettes (MacKenzie et al., 1996) où son activation entraîne un changement de forme de ces cellules (Rolf et al., 2001) et leur agrégation (Erhardt et al., 2003). Parmi les caractéristiques de ce récepteur on peut citer sa désensibilisation rapide et son activation par l’α,β-meATP (Evans et al., 1995 ; Valera et al., 1994). D’autres agonistes sont le BzATP, le 2MeSATP et l’ATP (Valera et al., 1994).
Récepteurs P2X2 : D’abord cloné à partir de cellules PC12 du phéochromocytome du rat (Brake et al., 1994), ce récepteur n’est pas activé par l’α,β-meATP et ne montre pas ou très peu de désensibilisation. Il est activé par l’ATP, l’ATPγS et le 2MeSATP (Evans et al., 1995), et il est potentialisé par les protons (King et al., 1996 ; Stoop et al., 1997) et par des faibles concentrations de Zn2+ (Brake et al., 1994). Il est exprimé dans le système nerveux central et périphérique ainsi que dans d’autres tissus (Gever et al., 2006).
Récepteurs P2X3 : Les récepteurs P2X3 ont été clonés à partir de la racine postérieure ganglionnaire de rat (Chen et al., 1995 ; Lewis et al., 1995). Ils sont activés par le 2MeSATP, l’ATP et l’α,β-meATP. On constate une désensibilisation rapide, comme c’est le cas avec le récepteur P2X1. Le récepteur P2X3 est localisé de façon prédominante au niveau des neurones sensitifs et il est impliqué dans certains types de douleur (Wirkner et al., 2007).
Récepteurs P2X4 : D’abord clonés à partir de l’hippocampe (Bo et al., 1995), du cerveau (Seguela et al., 1996), du ganglion cervical supérieur (Buell et al., 1996) et des îlots pancréatiques (Wang et al., 1996) de rat, ces récepteurs sont largement distribués. Les récepteurs P2X4 de la microglie interviennent dans l’inflammation chronique et dans la douleur neuropathique (Guo et al., 2005 ; Inoue et al., 2004 ; Schwab et al., 2005 ; Tsuda et al., 2003). Le gène codant pour la sous-unité P2X4 est localisé sur le même chromosome que celui de la sous-unité P2X7. La sous-unité P2X4 est composée de 388 acides aminés. Parmi toutes les sous-unités de récepteurs P2X, c’est celle qui a la séquence en acides aminés la plus proche de la sous-unité P2X7 (environ 49 % d’identité) (North, 2002). Les récepteurs P2X4
sont localisés de manière prédominante au niveau intracellulaire car ils sont internalisés par endocytose via des vésicules recouvertes de clathrine (Bobanovic et al., 2002 ; Royle et al., 2002 ; Royle et al., 2005). Dans la cellule ils sont principalement localisés dans les lysosomes (Qureshi et al., 2007 ; Stokes et Surprenant, 2009). Ces récepteurs sont activés par des concentrations intermédiaires d’ATP (3-300 µM), qui est l’agoniste le plus puissant. Le 2MeSATP active également ces récepteurs, tandis que l’α,β-meATP est un agoniste faible des récepteurs P2X4 murins et humains. Ces récepteurs sont relativement insensibles aux antagonistes classiques des récepteurs P2X, comme la suramine et le PPADS (Buell et al., 1996). Aucun antagoniste sélectif du récepteur P2X4 humain, de rat ou de souris n’a été identifié jusqu’à maintenant. Son activité est fonction du pH : en milieu acide (pH 6,3 - 6,5) elle est diminuée, alors qu’en milieu basique (pH 8,0 - 8,3) il n’y a que très peu ou pas de changement (Stoop et al., 1997). Les récepteurs P2X4 sont modulés de façon positive par le Zn2+ (Garcia-Guzman et al., 1997) et par l’ivermectine, une lactone macrocyclique semi- synthétique dérivée des produits de fermentation de Streptomyces avermitilis et utilisée comme antiparasitaire. L’ivermectine exerce son effet antiparasitaire par l’activation des canaux chlorure activés par le glutamate des nerfs et muscles des invertébrés (Cully et al., 1994). Ceci entraîne une hyperpolarisation, puis la paralysie et la mort des parasites. Cette molécule a également une action au niveau d’autres canaux ioniques : les récepteurs GABAA (Sigel et Baur, 1987), les récepteurs de la glycine (Shan et al., 2001) et les récepteurs α7- nicotiniques des mammifères (Krause et al., 1998). En 1999, Khakh et ses collaborateurs ont observé une modulation allostérique du récepteur P2X4 par l’ivermectine, mais aucun effet au niveau des autres récepteurs P2X (Khakh et al., 1999 b). Cet antiparasitaire semble interagir avec un site allostérique du récepteur P2X4 plutôt que d’avoir un effet sur son internalisation (Priel et Silberberg, 2004 ; Silberberg et al., 2007 ; Asatryan et al., 2010). Deux groupes indépendants ont mis en évidence certains résidus au niveau des hélices α des deux segments transmembranaires intervenant dans la liaison à l’ivermectine (Silberberg et al., 2007 ; Jelinkova et al., 2008).
Récepteurs P2X5 : Le récepteur P2X5 a d’abord été cloné à partir des ganglions cœliaques (Collo et al., 1996) et du cœur (Garcia-Guzman et al., 1996) de rat. Il est activé par l’ATP, le 2MeSATP et l’ADP. Le PPADS et la suramine sont des antagonistes du récepteur P2X5 (Bo et al., 2000 ; Garcia-Guzman et al., 1996 ; Collo et al., 1996).
Récepteurs P2X6 : Ce clone a été isolé du ganglion cervical supérieur (Collo et al., 1996) et du cerveau (Soto et al., 1996) de rat. Des agonistes de ce récepteur sont l’ATP, le 2MeSATP et l’ADP. Aucun courant n’est induit par l’ATP quand les récepteurs P2X6 sont exprimés sous forme d’homomultimères dans des oocytes ou des cellules HEK293 (Collo et al., 1996 ; Khakh et al., 1999 b). Ils peuvent former des récepteurs hétéromultimériques fonctionnels P2X2/6 (King et al., 2000) ou P2X4/6 (Le et al., 1998).
Récepteurs P2X7 : Ce récepteur a été cloné à partir du cerveau de rat (Surprenant et al., 1996) et correspond au récepteur P2Z. Il est surtout exprimé au niveau des cellules du système hématopoïétique, tels que les mastocytes, les macrophages et les monocytes, mais également au niveau d’autres cellules, par exemple des fibroblastes, des cellules gliales, neuronales ou épithéliales (Gever et al., 2006). Le récepteur P2X7 est structurellement et fonctionnellement différent des autres récepteurs P2X. La partie I.1.3.3. est consacrée spécialement à ce récepteur.
I.1.3.3. Les récepteurs P2X
7Structure
Le gène codant pour la sous-unité P2X7 contient 13 exons et chez l’homme il est localisé au niveau du chromosome 12, le chromosome sur lequel est également situé le gène codant pour le récepteur P2X4. Le récepteur P2X7 humain, formé de 595 acides aminés, est glycosylé au niveau de cinq résidus de la boucle extracellulaire (Lenertz et al., 2010). Cette modification post-traductionnelle est importante pour la fonction du récepteur. Lenertz et ses collaborateurs (2010) ont montré qu’une mutation au niveau de ces sites de N-glycosylation a comme conséquence une diminution de la phosphorylation d’ERK1/2 en réponse au BzATP.
L’extrémité C-terminale du récepteur P2X7 est beaucoup plus longue que celle des autres récepteurs P2X. Elle contient plusieurs sites d’interactions protéines-protéines ou protéines- lipides, dont un site potentiel pour la liaison des lipopolysaccharides (LPS) (Denlinger et al., 2001) et un site de liaison à la calmoduline (Roger et al., 2008). Elle intervient dans la régulation de la translocation du récepteur P2X7 vers la membrane plasmique (Smart et al., 2003 ; Denlinger et al., 2003) et dans la modulation du fonctionnement du canal (Becker et al., 2008). Kim et ses collaborateurs (2001) ont montré que les récepteurs P2X7 peuvent former un complexe de signalisation avec de multiples protéines, comme des protéines du
cytosquelette, des protéines de choc thermique ou encore la phosphatidylinositol-4-kinase (PI4K) ou le récepteur à activité tyrosine phosphatase. Le même groupe a démontré que le récepteur P2X7 est phosphorylé au niveau de la tyrosine en position 343 (2ème segment transmembranaire) en condition basale. Suite à l’activation du récepteur cette tyrosine est déphosphorylée (Kim et al., 2001).
De nombreux polymorphismes d’un seul nucléotide ont été mis en évidence chez les récepteurs P2X7 (Fuller et al., 2009). Parmi ces derniers, certains semblent causer une perte ou une augmentation de fonction et ont été associés à diverses affections, comme la leucémie lymphocytaire chronique, le risque de fracture osseuse, ainsi que des fonctions immunitaires diminuées (Cabrini et al., 2005 ; Ohlendorff et al., 2007 ; Shemon et al., 2006). Jusqu’à ce jour dix isoformes du récepteur P2X7 humain ont été identifiées (Cheewatrakoolpong et al., 2005 ; Feng et al., 2006 ; Nicke et al., 2009). L’ADNc du récepteur P2X7 complet, formé de 13 exons, est la variante P2X7(a) (GenBank NM_011027).
Pharmacologie
Le récepteur P2X7 possède une affinité plus faible pour l’ATP (EC50 = 100 µM) que les autres récepteurs P2X. Le BzATP est l’agoniste le plus puissant (Gargett et al., 1997 ; Gever et al., 2006). Cependant cet analogue n’est pas spécifique du récepteur P2X7, il active également d’autres récepteurs P2X. Après une stimulation préalable par l’ATP ou le BzATP, le récepteur P2X7 devient plus sensible à l’ADP et l’AMP. Chafke et ses collaborateurs (2002) ont montré que l’ADP et l’AMP entraînent une libération de la cytokine interleukine- 1β (IL-1β) par les cellules de la microglie humaine suite à une stimulation initiale par l’ATP.
Le NAD n’active pas directement le récepteur P2X7, mais il a été montré que le transfert, via l’ADP-ribosyltransférase ART2.2, du groupement ADP-ribose du NAD sur certains résidus du récepteur P2X7 entraîne l’activation de celui-ci (Seman et al., 2003 ; Adriouch et al., 2008).
Plusieurs modulateurs des récepteurs P2X7 ont été décrits. Le tenidap, un produit anti- inflammatoire, potentialise les effets cytotoxiques et perméabilisants du récepteur P2X7 dans les macrophages (Sanz et al., 1998). Une potentialisation de l’effet perméabilisant a également été observée dans les glandes salivaires (Alzola et al., 2001). Le groupe de Di Virgilio a montré que la polymyxine B, un antibiotique cationique qui se lie au lipide A des
