Faculté de Pharmacie
Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Caractérisation des propriétés anticancéreuses de la fusicoccine A et de l’ophioboline A au sein de modèles expérimentaux de
glioblastomes humains
Marina Bury
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur: Professeur Robert Kiss Laboratoire de Toxicologie
Co-promoteur: Professeur Jacques Dubois
Laboratoire de Chimie Bioanalytique, Toxicologie et Chimie Physique Appliquée
Composition du jury : Prof. Jean Nève (Président)
Prof. Caroline Stévigny (Secrétaire) Prof. Jean-Michel Kauffmann
Prof. Ghanem Ghanem (Institut Jules Bordet, ULB) Prof. Laurence Lagneaux (Institut Jules Bordet, ULB)
Prof. Thierry Cresteil (Institut de Chimie des Substances Naturelles, Gif-sur-Yvette)
Année académique 2012-2013
TABLE DES MATIÈRES
TABLE DES MATIÈRES
ABRÉVIATIONS ... 5
BUT DU TRAVAIL ET RÉSUMÉ ... 8
INTRODUCTION ... 10
I. Le glioblastome. ... 10
1. Classification anatomo-pathologique. ... 10
2. Épidémiologie. ... 11
3. Tumorigenèse. ... 11
4. Caractéristiques génétiques. ... 12
4.1 Généralités. ... 12
4.2 La voie des récepteurs à activité tyrosine kinase. ... 12
4.3 La voie du gène suppresseur de tumeur p53. ... 13
4.4 La voie de la protéine du rétinoblastome. ... 14
4.5 Les isocitrate déshydrogénases. ... 14
5. Caractéristiques biologiques. ... 15
5.1 Prolifération cellulaire. ... 15
5.2 Nécrose. ... 15
5.3 Angiogenèse. ... 16
5.4 Invasion. ... 16
6. Traitements. ... 17
6.1 Chirurgie. ... 17
6.2 Radiothérapie et chimiothérapie standard. ... 18
6.3 Chimiothérapie de seconde ligne... 18
6.4 Thérapies ciblées. ... 19
6.5 Thérapies locales. ... 20
7. Chimiorésistance. ... 20
7.1 L’enzyme de réparation MGMT. ... 20
7.2 Les pompes à efflux. ... 20
7.3 L’hypoxie. ... 21
7.4 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose. ... 23
II. La paraptose : une mort cellulaire non-apoptotique. ... 25
1. Les principaux types de mort cellulaire. ... 25
1.1 L’apoptose. ... 25
1.2 L’autophagie... 26
2
1.3 La nécrose. ... 27
1.4 La sénescence. ... 28
2. La paraptose. ... 29
III. Les terpénoïdes. ... 32
1. Généralités. ... 32
2. Les terpénoïdes d’origine fongique étudiés dans ce travail. ... 33
2.1 La fusicoccine A. ... 33
2.1.1 Origine et propriétés connues à ce jour. ... 33
2.1.2 La kinase d’adhérence focale, FAK. ... 35
2.2 L’ophioboline A. ... 36
2.2.1 Origine et propriétés connues à ce jour. ... 36
2.2.2 Le canal ionique BKCa ... 37
MATÉRIEL ET MÉTHODES ... 39
I. Origine des molécules utilisées dans le cadre du présent travail. ... 39
II. Étude de la stabilité physico-chimique. ... 39
III. Description des modèles expérimentaux. ... 39
1. Les modèles in vitro. ... 39
1.1 Lignées cellulaires établies. ... 39
1.2 Primocultures. ... 40
1.3 Lignées cellulaires multi-drogues résistantes. ... 40
1.4 Milieux et conditions de culture. ... 41
1.5 Transfection. ... 42
2. Le modèle B16F10 in vivo. ... 43
IV. Description des techniques utilisées. ... 43
1. Analyses de l’expression et de l’activité des protéines. ... 43
1.1 Le western blot. ... 43
1.2 La microscopie à fluorescence. ... 45
1.3 Le test d’inhibition des protéines kinases. ... 46
2. Analyses de la croissance cellulaire. ... 47
2.1 Le test colorimétrique MTT. ... 47
2.2 La vidéomicroscopie quantitative : croissance et division cellulaire. ... 48
2.3 La cytométrie de flux : analyse du cycle cellulaire. ... 49
3. Analyses de la migration cellulaire. ... 49
3.1 La vidéomicroscopie quantitative : motilité cellulaire. ... 49
3.2 Les chambres d’invasion de Boyden. ... 50
3.3 Analyse des capacités d’adhésion des cellules. ... 50
4. Analyses de la mort cellulaire. ... 51
4.1 La coloration au bleu de trypan. ... 51
4.2 La cytométrie de flux... 51
4.2.1 Le marquage TUNEL. ... 51
4.2.2 Le double marquage annexine V/iodure de propidium ... 52
4.2.3 Le marquage à l’acridine orange. ... 53
4.3 Le test d’activité de la β-galactosidase. ... 53
4.4 Analyses des flux ioniques. ... 54
4.4.1 Mesure de la concentration intracellulaire du calcium. ... 54
4.4.2 Le patch clamp : mesure de l’activité du canal BKCa. ... 55
5. Analyses statistiques. ... 56
5.1 Comparaison de groupes de données... 56
5.2 Analyse de survie. ... 56
RÉSULTATS ... 58
RÉSULTAT - I ... 59
"Fusicoccin A, a phytotoxic carbotricyclic diterpene glucoside of fungal origin, reduces proliferation and invasion of glioblastoma cells by targeting multiple tyrosine kinases". ... 59
RÉSULTAT - II ... 62
"Ophiobolin A, a sesterterpenoid fungal phytotoxin, displays higher in vitro growth- inhibitory effects in mammalian than in plant cells and it also displays in vivo antitumor activity". ... 62
RÉSULTAT - III ... 65
"Ophiobolin A induces paraptosis-like cell death in human glioblastoma cells by decreasing BKCa channel activity". ... 65
DISCUSSION ... 68
I. L’intérêt de la fusicoccine A dans le traitement du glioblastome. ... 68
La protéine kinase FAK est une cible d’intérêt pour le traitement des glioblastomes. ... 69
II. L’intérêt de l’ophioboline A dans le traitement du glioblastome. ... 71
4
Le canal ionique BKCa est une cible d’intérêt pour le traitement des glioblastomes. ... 73
III. Perspectives de développement de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. ... 74
1. Évaluation in vivo. ... 74
2. Hémisynthèse de dérivés de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. ... 75
CONCLUSIONS ... 76
RÉFÉRENCES ... 77
ANNEXE ... 94
ABRÉVIATIONS
5
ABRÉVIATIONS
5-ALA: 5-aminolevulinic acid 10-DAB: 10-déacetylbaccatine III ABC: ATP-binding cassette
ABCB1: ABC sub-family B member 1 ABCC1: ABC sub-family C member 1 ABCG2: ABC sub-family G member 2 ADN: acide désoxyribonucléique ALG-2: apoptosis linked gene 2 Alix: ALG-2-interacting protein X
AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor ARNm: acide ribonucléique messager
ATCC: american type culture collection Atg: autophagy-related gene
ATP: adénosine triphosphate Bad: Bcl-2 antagonist of cell death Bax: Bcl-2–associated X protein BCA: bicinchoninic acid
Bcl-2: B-cell lymphoma 2
Bcl-XL: B-cell lymphoma-extra large BCRP: breast cancer resistance protein BHE: barrière hémato-encéphalique
BKCa: big conductance calcium-activated potassium channel BSA: bovin serum albumin
CAD: caspase activated DNAse CAM: cell adhesion molecule CDK: cyclin-dependent kinase
CDKN2A: cyclin-dependent kinase inhibitor 2A CSC: cellule souche cancéreuse
CSG: cellule souche de glioblastome CSN: cellule souche neurale
DcR3: decoy receptor 3 DMSO: dimethylsulfoxide
DSMZ: deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen dUTP: déoxyuridine triphosphate
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid EGF: epidermal growth factor
EGFR: epidermal growth factor receptor EGTA: ethylene glycol tetraacetic acid ERK: extracellular signal regulated kinase FAK: focal adhesion kinase
FBS: fetal bovine serum
FITC: fluorescein isothiocyanate GBM: glioblastome multiforme GGDP: geranylgeranyl diphosphate
GGS: geranylgeranyl diphosphate synthase
Graf: GTPase regulator associated with focal adhesion kinase Grb2: growth factor receptor-bound protein 2
Grb7: growth factor receptor-bound protein 7 HIF-1α: hypoxia inducible factor 1 alpha HRP: horse radish peroxydase
HUVEC: human umbilical vein endothelial cells IAP: inhibitor of apoptosis protein
IDH1: isocitrate déshydrogénase 1 IDH2: isocitrate déshydrogénase 2 IFN-α: interferon-α
IGF: insulin-like growth factor
IGF1R: insulin-like growth factor 1 receptor IP: iodure de propidium
JNK: c-Jun N-terminal kinase
KGM-2: keratinocyte growth medium
LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3 LRP: low density lipoprotein regulated receptor protein MAPK: mitogen-activated protein kinase
M-CSF: macrophage colony-stimulating factor MDM2: murine double minute 2
MDM4: murine double minute 4 MDR1: multidrug resistance 1 MEC: matrice extracellulaire
MGMT: O6-methylguanine DNA methyltransferase MIP: milieu intra-pipette
MMP: métalloprotéinase MMR: mismatch repair
MRDO: maximal relative distance to the origin MRP1: multidrug resistance protein 1
NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCI: national cancer institute
NF1: neurofibromatosis 1 NFƘB: nuclear factor-kappa B NK1R: neurokinin-1 receptor
NSCLC: non-small-cell lung carcinoma Olig2: oligodendrocyte 2
OMS: organisation mondiale de la santé
PaFS: phomopsis amygdali fusicoccadiene synthase PARP-1: poly (ADP-ribose) polymerase 1
PDGFR: platelet-derived growth factor receptor P-gp: glycoprotéine-P
PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase pRB: protéine du rétinoblastome
PTEN: phosphatase and tensin homolog PVDF: polyvinylidiène difluoride
Ras: rat sarcoma viral oncogene homolog RIPK1: receptor-interacting protein kinase 1 RIPK3: receptor-interacting protein kinase 3 ROS: reactive oxygen species
RPMI: roswell park memorial institute medium RTK: receptor tyrosine kinase
RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction
7 SA-β-Gal: senescence-associated beta-galactosidase
SDS: sodium dodecyl sulfate siRNA: small interfering RNA
TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase TMZ: témozolomide
TNF: tumor necrosis factor
TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling VEGF: vascular endothelial growth factor
X-GAL: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
BUT DU TRAVAIL ET
RÉSUMÉ
8
BUT DU TRAVAIL ET RÉSUMÉ
Le glioblastome est la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs cérébrales primaires.
Malgré un traitement standard pluridisciplinaire (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), la médiane de survie des patients atteints de ce type de tumeur est de 15 mois et aucun patient n’a pu être guéri à ce jour. Ce pronostic très sombre est directement lié à la capacité d’invasion diffuse du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales, ce qui rend impossible une résection chirurgicale totale. De plus, ces cellules sont particulièrement résistantes aux traitements chimiothérapeutiques de type pro-apoptotique, entrainant une récidive quasi inévitable de la tumeur. De nombreuses stratégies thérapeutiques telles que l’immunothérapie ou les thérapies ciblées sont actuellement explorées pour tenter de combattre ces tumeurs. Cependant, leur efficacité au niveau clinique s’est avérée décevante. Il devient donc indispensable d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques afin d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome.
Dans ce travail, nous avons caractérisé les propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo de deux terpénoïdes extraits de champignons, la fusicoccine A et l’ophioboline A, puis nous avons caractérisé en partie leur mécanisme d’action anti-tumoral dans des cellules de glioblastome.
Tout d’abord, nous avons montré que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de la fusicoccine A et de l’ophioboline A n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Nous avons ensuite mis en évidence que la fusicoccine A était capable de diminuer l’invasion des cellules de glioblastome in vitro en ciblant la kinase focale d’adhérence (FAK). Dans le même temps, nous avons démontré que l’ophioboline A était capable d’induire la mort de ces cellules par paraptose en inhibant l’activité du canal ionique BKCa. Ces deux cibles sont intéressantes car en plus d’être surexprimées dans les glioblastomes, elles interviennent dans de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la migration et la survie cellulaire.
Pour finir, nous avons analysé le pouvoir anti-tumoral in vivo de ces deux terpénoïdes en utilisant un modèle murin de mélanome métastatique, couramment utilisé dans notre laboratoire. Seule l’ophioboline A, injectée en intrapéritonéal à 10 mg/kg, augmentait de manière significative la survie des souris traitées avec cette molécule par rapport aux souris contrôles. Dans ce premier modèle, nous n’avions pas déterminé les conditions optimales
pour l’évaluation in vivo de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. Lorsque celles-ci seront définies, des modèles de xénogreffes orthotopiques de glioblastomes humains implantées dans le cerveau de souris immunodéficientes seront utilisés.
En conclusion, l’ophioboline A, pouvant être produite en quantités industrielles par culture du champignon qui la synthétise, possédant un mécanisme d’action original et montrant déjà un début d’activité in vivo, pourrait représenter une molécule méritant des études plus approfondies en termes d’agent thérapeutique susceptible de combattre les glioblastomes.
INTRODUCTION
Figure 1 : Classification mondiale des cancers en fonction de leur incidence et de leur mortalité comprenant des individus des deux sexes et de tous âges (d’après International Agency for Research on Cancer (IARC), Globocan, 2008).
INTRODUCTION I. Le glioblastome.
1. Classification anatomo-pathologique.
Les gliomes, issus des cellules gliales, sont les plus communes des tumeurs cérébrales primaires, par opposition aux tumeurs cérébrales secondaires ou métastases. Chaque année, ils représentent 70 % des nouveaux cas de tumeurs malignes du système nerveux central diagnostiqués chez l’adulte (Lima et coll., 2012 ; Ricard et coll., 2012). Bien que les gliomes soient des cancers relativement rares (~2 % des tumeurs primaires), la mortalité associée à ce type de tumeur est très élevée dans le monde (Figure 1) (Furnari et coll., 2007 ; Van Meir et coll., 2010).
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) classe les gliomes en fonction de leur origine histologique en tumeurs astrocytaires (60-70 % des gliomes), oligodendrogliales (20-30 %), oligoastrocytaires (mixte) ou épendymaires (moins de 10 %) (Louis et coll., 2007). L’OMS distingue également 4 grades de malignité au sein de ces tumeurs gliales, le grade I correspondant aux tumeurs circonscrites et bénignes. Les gliomes malins, présentant la caractéristique d’infiltrer de façon diffuse le parenchyme cérébral, sont appelés gliomes
« diffus » et incluent les tumeurs de grade II à IV. La détermination de la malignité repose sur 6 caractéristiques biologiques: la différenciation de la tumeur, la densité cellulaire, l’atypie nucléaire, l’activité mitotique, la prolifération micro-vasculaire et la nécrose (Table 1) (Furnari et coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes principalement intéressés au glioblastome multiforme (GBM). Il représente le plus haut grade de malignité des gliomes d’origine astrocytaire (grade IV) et est associé à un pronostic défavorable (Table 1). La médiane de survie des patients diagnostiqués pour ce type de tumeur est de 15 mois et ce lorsqu’ils suivent le traitement de référence associant la résection chirurgicale maximale de la tumeur suivie d’une radiothérapie et d’un traitement concomitant de chimiothérapie avec le témozolomide (TMZ). Moins de 10% des patients sont en vie après 5 ans et aucun n’a pu être
guéri à ce jour (Louis et coll., 2007; Stupp et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012).
Table 1 :Classification histologique des gliomes diffus (malins) et leur médiane de survie. Le glioblastome correspond à l’astrocytome de grade 4 dans ce tableau (d’après Ricard et coll., 2012).
Les glioblastomes sont catégorisés en deux sous-types : les glioblastomes de novo ou primaires (~90 %) et les glioblastomes secondaires, dérivant de la transformation progressive des tumeurs astrocytaires de grade inférieur. Plus de 70 % des gliomes de grade II se transforment en grade III puis en grade IV dans les 5 à 10 ans suivant le diagnostic (Furnari et coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
2. Épidémiologie.
En Europe et aux États-Unis (USA), le glioblastome représente plus de 50 % des tumeurs gliales soit 3 à 4 nouveaux cas par an pour 100 000 habitants. Les glioblastomes secondaires apparaissent principalement chez des personnes âgées de moins de 45 ans tandis que les glioblastomes primaires surviennent dans la majorité des cas après 45 ans, avec un ratio homme-femme de ~1.5 (Huang et coll., 2004; Furnari et coll., 2007 ; Ricard et coll., 2012).
À l’exception de l’exposition à des rayonnements ionisants et de certains syndromes héréditaires tels que le syndrome de Li-Fraumeni et le syndrome de Cowden, peu de facteurs sont actuellement connus sur l’origine des tumeurs cérébrales primaires (Ricard et coll., 2012). Des altérations génétiques associées à des facteurs environnementaux encore inconnus prédisposeraient les individus à développer un glioblastome (Chen et coll., 2012a). Les signes cliniques des patients souffrant de cette tumeur ne sont pas spécifiques : ils traduisent l’augmentation de la pression intracrânienne due au développement de la masse tumorale (céphalées, nausées, vomissements et troubles de la vue). Dans un tiers des cas, ces symptômes seront associés à des crises d’épilepsie (Gladson et coll., 2010).
3. Tumorigenèse.
Le terme de glioblastome « multiforme » provient de l’hétérogénéité des cellules présentes au sein de la tumeur. Cette diversité a longtemps été expliquée par la présence de clones qui assimileraient au cours de la progression tumorale différentes mutations génétiques (Nowell, 1976). Soumis à des pressions sélectives, comme l’environnement tumoral ou la radio- et la chimiothérapie, seuls les clones agressifs et ayant acquis une résistance survivraient (Nowell, 1976; Bonavia et coll., 2011).
Actuellement, l’hypothèse « des cellules souches de glioblastome (CSGs) » semble être la plus probable pour expliquer cette hétérogénéité cellulaire. Selon cette théorie, les cellules
Figure 2 : Tumorigenèse des glioblastomes. Au cours de la différenciation normale du système nerveux central, les cellules souches neurales (CSNs) peuvent s’auto-renouveler et se différencier afin de donner les différentes cellules matures présentes dans le cerveau par l’intermédiaire des cellules progénitrices gliales et neuronales. Les cellules souches de glioblastome (CSGs), à l’origine du processus tumoral, pourraient provenir de la transformation des cellules CSNs, des cellules progénitrices gliales ou encore des astrocytes (créé d’après Hadjipanayis et Van Meir, 2009 et Chen et coll., 2012b).
Localisation Gène(s) Altérations génétiques
Chromosome 1 MDM4
(murine double minute 4) Amplification (7%)
Chromosome 2 IDH1
(isocitrate dehydrogenase 1) Mutation (11%) Chromosome 3 PI3KCA (phosphatidylinositol 3-
kinase catalytic subunit) Mutation (10%) Chromosome 4
PDGFR
(platelet-derived growth factor receptor)
Amplification (7.5%)
Chromosome 5
PI3KR1
(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit)
Mutation (8%)
Chromosome 7 EGFR
(epidermal growth factor receptor) Amplification, mutation (35%)
Chromosome 9 CDKN2A
(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) Délétion (50%)
Chromosome 10 PTEN
(phosphatase and tensin homolog) Mutation, délétion (30%) Chromosome 12
CDK4
(cyclin-dependent kinase 4) Amplification (18%) MDM2
(murine double minute 2) Amplification (14%)
Chromosome 13 RB1
(retinoblastoma 1) Délétion, mutation (12%)
Chromosome 17
NF1
(neurofribomatosis 1) Mutation (15%)
P53
(protein 53) Mutation (40%)
Table 2 : Modifications génétiques les plus fréquemment rencontrées dans les glioblastomes (créé d’après Parsons et coll., 2008 ; Belden et coll., 2011).
souches neurales (CSNs), les cellules progénitrices gliales ainsi que les cellules matures, suite à l’accumulation d’altérations génétiques, pourraient être à l’origine des cellules CSGs (Figure 2). Ces dernières possèdent des caractéristiques similaires aux cellules CSNs, à savoir la capacité de s’auto-renouveler, de proliférer et de se différencier en formant dès lors une masse tumorale hétérogène (Wen et coll., 2008 ; Hadjipanayis et Van Meir, 2009 ; Chen et coll., 2012b).
Les voies de signalisation de Sonic Hedgehog, de Notch, de Wnt ainsi que la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et du facteur de transcription d’oligodendrocyte 2 (Olig2), essentielles au développement et à la régulation positive des cellules CSNs, sont également actives dans les cellules CSGs (Van Meir et coll., 2010). Ces cellules CSGs peuvent être identifiées par des marqueurs communs aux cellules CSNs comme la nestine, Sox2, Olig2 ou encore par l’antigène de surface CD44 (Chen et coll., 2012b). Ces cellules CSGs, localisées dans des niches vasculaires ainsi que dans les régions hypoxiques, sont impliquées dans la résistance aux traitements radio-chimiothérapeutiques conventionnels que nous détaillerons dans la suite de ce travail (Van Meir et coll., 2010 ; Chen et coll., 2012a-b).
4. Caractéristiques génétiques.
4.1 Généralités.
Dans la plupart des cancers, la tumorigenèse résulte de l’accumulation de plusieurs évènements génétiques tels que des mutations, des amplifications ou des délétions (Table 2).
Dans le cas du glioblastome, les proto- et anti-oncogènes interviennent principalement dans 3 voies de signalisation : la voie des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTKs), la voie du gène suppresseur de tumeur p53 et la voie de la protéine du rétinoblastome (pRB). Plus récemment, il a été démontré que l’isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) pouvait être impliquée dans le processus de transformation des cellules gliales (Figure 3) (Van Meir et coll., 2010 ; Belden et coll., 2011; Chen et coll., 2012b ; Ricard et coll., 2012).
4.2 La voie des récepteurs à activité tyrosine kinase.
La liaison de ligands aux récepteurs membranaires tels qu’EGFR (epidermal growth factor receptor) et PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) entraine l’activation des voies de signalisation de PI3K et de Ras (rat sarcoma viral oncogene homolog). Il existe divers
Figure 3 : Voies principales de signalisation impliquées dans la tumorigenèse des glioblastomes ; AKT= V-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1, MAPK= mitogen- activated protein kinase, mTOR= mammalian target of rapamycin, Raf= V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog (créé d’après Belden et coll., 2011 et Ricard et coll., 2012).
régulateurs de ces voies : NF1 (neurofibromatosis 1) et PTEN (phosphatase and tensin homolog) (Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012).
L’amplification des récepteurs RTKs en même temps que l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur précédemment cités (PTEN et NF1) conduisent à une augmentation anormale de la prolifération, de la migration et de la survie cellulaire ainsi qu’à une augmentation de l’expression du facteur de transcription HIF-1α (hypoxia inducible factor 1 alpha) (Table 2 ; Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2007 et 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012). Le mutant le plus fréquent du récepteur EGFR, EGFRvIII (délétion des exons 2-7 de l’ARNm), peut également entrainer la sur-activation du récepteur EGFR en l’absence de ligand (Huang et coll., 1997; Mellinghoff et coll., 2005 ; Oghaki et Kleihues, 2009). Cette surexpression du récepteur EGFR est un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints de glioblastome (Nicolaidis, 2013).
4.3 La voie du gène suppresseur de tumeur p53.
Suite à l’exposition à des agents chimiques ou physiques, la protéine p53 peut soit stopper temporairement le cycle cellulaire pour permettre la réparation éventuelle de l’ADN soit induire l’apoptose des cellules lorsque les dommages sont trop importants (Van Meir et coll., 2010). Le mécanisme d’action de p53 passe tout d’abord par la transcription du gène codant pour la protéine p21. Cette dernière se lie et inhibe les protéines de la famille des cyclines D, impliquées dans la progression du cycle cellulaire en phase G1. D’un autre côté, p53 peut également contrôler la transcription de gènes pro-apoptotiques tels que Bax (Bcl-2–associated X protein) et Fas (Van Meir et coll., 2010).
La voie de signalisation de p53 est régulièrement altérée dans les glioblastomes et ce, de plusieurs façons : mutation/délétion de p53, surexpression des inhibiteurs de p53 tels que MDM2 (murine double minute 2) et MDM4 (murine double minute 4) ou délétion de CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), également appelé p16INK4a (Table 2 ; Figure 3) (Oghaki et Kleihues 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012). Les altérations de p53 sont associées à un mauvais pronostic pour les patients atteints de ce type de tumeur (Nicolaidis, 2013).
Figure 4 : Rôles de l’isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1) et de l’isocitrate déshydrogénase 2 (IDH2) dans les cellules de gliome. IDH1 dans le cytosol et IDH2 dans les mitochondries interviennent dans le cycle de Krebs. Ils catalysent la décarboxylation oxydative de l’isocitrate en α-cétoglutarate, réduisant le NADP+ en NADPH. Ce dernier est requis pour la synthèse du glutathion qui protège les cellules du stress oxydatif et confère la résistance à l’apoptose. De plus, le NADPH cytosolique sert de substrat aux NADPH oxydases, dont leur production en peroxyde d’hydrogène inhibe les tyrosine-phosphatases, favorisant l’activation des kinases impliquées dans la survie cellulaire. En plus de l’oxygène, les proline- hydroxylases, qui suppriment l’expression d’HIF-1α, requièrent l’α-cétoglutarate comme substrat (d’après Thompson, 2009).
4.4 La voie de la protéine du rétinoblastome.
Lorsqu’elle n’est pas phosphorylée par des complexes cyclines/CDK (cyclin-dependent kinase), la protéine du rétinoblastome (pRB) bloque l’entrée du cycle cellulaire en phase S via la séquestration du facteur de transcription nucléaire E2F (Sherr et Roberts, 1999 ; Oghaki et Kleihues, 2009 ; Van Meir et coll., 2010). La mutation de pRB, la dérégulation de CDK4 (cyclin-dependent kinase 4) directement suite à l’amplification du gène ou indirectement suite à la délétion de CDKN2A, sont des altérations fréquemment rencontrées dans les cellules de glioblastome (Table 2 ; Figure 3) (Oghaki et Kleihues, 2007 et 2009 ; Belden et coll., 2011 ; Ricard et coll., 2012).
4.5 Les isocitrate déshydrogénases.
IDH1 dans le cytosol et IDH2 (isocitrate déshydrogénase 2) dans les mitochondries interviennent dans le cycle de Krebs. Ces deux enzymes catalysent la décarboxylation oxydative de l’isocitrate en α-cétoglutarate, réduisant le NADP+ en NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate). La forme mutée d’IDH1, retrouvée principalement dans les glioblastomes secondaires, permet la conversion de l’α-cétoglutarate en D2-hydroxyglutarate.
Cette réaction diminue la formation de NADPH et donc la synthèse de glutathion qui est capable d’éliminer les espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Thompson, 2009 ; Singh S et coll., 2012). L’altération d’IDH1 va augmenter la sensibilité au stress oxydatif et par conséquent la sensibilité à la radio- et chimiothérapie (Chen et coll., 2012b). En effet, les radiations ionisantes entrainent la formation de radicaux libres ainsi que des lésions au niveau de l’ADN, induisant la mort des cellules (Verrelle, 1998). De plus, il a été démontré que le témozolomide pouvait également induire la production de ROS suite aux dommages de l’ADN (Zhang et coll., 2010 ; Oliva et coll., 2011). La mutation d’IDH1 est un facteur pronostic favorable à la survie des patients atteints de glioblastome (Ricard et coll., 2012).
Cependant, paradoxalement, cette mutation augmente l’expression d’HIF-1α, favorisant la glycolyse et stimulant l’angiogenèse (Figure 4) (Thompson, 2009 ; Zhao et coll., 2009).
Plus récemment, Verhaak et ses collaborateurs ont proposé une classification des glioblastomes en fonction de leur profil génétique. Elle distingue 4 sous-types : classique, mésenchymal, neural et proneural (Verhaak et coll., 2010). Bien que les différentes voies de signalisation dont nous venons de discuter soient altérées dans la majorité des glioblastomes,
Table 3 : Classification des glioblastomes basée sur leur profil génétique (d’après Belden et coll., 2011).
des altérations génétiques spécifiques peuvent être observées dans chacun des sous-types (Table 3). On retrouve par exemple préférentiellement les altérations d’EGFR, de NF1 et de PDGFR/IDH1 dans les sous-types classique, mésenchymal et proneural (Van Meir et coll., 2010 ; Verhaak et coll., 2010). Ces sous-types présentent des caractéristiques génétiques distinctes, expliquant la différence de survie et de sensibilité aux traitements observée chez les patients atteints de glioblastome (Van Meir et coll., 2010 ; Verhaak et coll., 2010). Cette classification ouvre la voie aux traitements personnalisés en fonction de la signature génétique de chacune des tumeurs (Verhaak et coll., 2010 ; Nicolaidis, 2013). Par exemple, le géfitinib (Iressa®), un inhibiteur du récepteur EGFR, pourrait être utilisé chez les patients atteints d’un glioblastome de sous-type classique tandis que l’imatinib (Glivec®), un inhibiteur du récepteur PDGFR pourrait être utilisé pour le sous-type proneural (Perry et coll., 2013).
5. Caractéristiques biologiques.
L’altération de la prolifération, la présence de zones nécrotiques, une angiogenèse imparfaite ainsi qu’une grande capacité d’invasion des glioblastomes sont des conséquences des altérations génétiques décrites précédemment. Ils sont des indicateurs de l’agressivité de la tumeur et permettent de distinguer les glioblastomes des tumeurs de grade inférieur (Furnari et coll., 2007).
5.1 Prolifération cellulaire.
Les gliomes de haut grade histologique se différencient des tumeurs de bas grade par une activité mitotique importante. En effet, la progression des gliomes de grade II en grade III ou IV est associée à l’accumulation d’évènements génétiques comme l’activation de la voie de signalisation des récepteurs RTKs ou l’inactivation des voies de signalisation impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire telles que la voie de p53 et celle de RB1 (Louis, 2006 ; Belden et coll., 2011).
5.2 Nécrose.
Les glioblastomes sont caractérisés par de larges zones nécrotiques liées à la croissance rapide des cellules et aux phénomènes micro-thrombotiques des vaisseaux adjacents (Louis, 2006). En effet, les cellules de glioblastome, de par leur prolifération rapide, s’éloignent des vaisseaux sanguins qui représentent la source d’oxygène et de nutriments nécessaires au
Figure 5 : Lien entre hypoxie, nécrose et angiogenèse dans les cellules gliales tumorales ; (a) L’hypoxie localisée suite à un manque d’oxygène et de nutriments entraine l’expression de gènes impliqués dans la migration, (b) conduisant les cellules à migrer hors de cette zone hypoxique. (c) S’ensuit l’apparition d’une zone nécrotique centrale autour de laquelle se trouvent les cellules pseudopalissadiques, (d) capables d’exprimer des facteurs angiogéniques tels que VEGF induisant de l’angiogénèse adjacente (d’après Louis, 2006).
développement tumoral. La diminution de l’apport en oxygène induit la formation de zones nécrotiques. Pour contrebalancer cet effet de l’hypoxie, les cellules tumorales surexpriment le facteur de transcription HIF-1α qui va induire l’expression des métalloprotéinases (MMPs) (Louis, 2006). Ces enzymes sont capables de remodeler la matrice extracellulaire facilitant la migration de certaines cellules hors de la zone nécrosée. Ces cellules situées en périphérie sont appelées «pseudopalissadiques » et forment le front de migration de la tumeur (Figure 5) (Brat et Van Meir, 2004 ; Louis, 2006 ; Rong et coll., 2006).
5.3 Angiogenèse.
De par leur prolifération importante, les cellules de glioblastome s’exposent à un stress hypoxique (Louis, 2006). Afin de survivre dans cet environnement appauvri en nutriments et en oxygène, les cellules pseudopalissadiques vont sécréter le facteur VEGF (vascular endothelial growth factor), qui est sous le contrôle d’HIF-1α. Le facteur VEGF en se liant à des récepteurs spécifiques au niveau de la surface des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, va inciter ces derniers à proliférer en direction du foyer tumoral. Cette « néo- angiogenèse adjacente », aussi appelée prolifération micro-vasculaire gloméruloïde, faisant référence à la forme anarchique de ces vaisseaux sanguins, est caractéristique des glioblastomes (Figure 5) (Brat et Van Meir, 2004 ; Louis, 2006 ; Rong et coll., 2006).
Les mutations de PTEN, d’IDH1 et d’EGFR peuvent également favoriser le phénomène de néo-angiogenèse en stabilisant HIF-1α comme nous l’avons vu précédemment (Belden et coll., 2011).
5.4 Invasion.
Les cellules tumorales gliales migrent dans le parenchyme cérébral préférentiellement le long de la lame basale des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses ainsi qu’autour des neurones et sous la pie-mère (Louis, 2006). L’invasion des cellules de glioblastome résulte de la coordination de plusieurs mécanismes cellulaires distincts. Dans un premier temps, l’activité des protéines d’adhésion cellulaire (CAMs) dont les cadhérines sera réprimée permettant le détachement de certaines cellules tumorales gliales de la masse tumorale (Belden et coll., 2011). Dans un second temps, les cellules de glioblastome vont s’attacher à la matrice extracellulaire par l’intermédiaire des intégrines capables d’activer la kinase FAK (focal adhesion kinase) ainsi que d’autres médiateurs de l’adhésion et de la migration
Figure 6 : Photographies d’un glioblastome lors d’une résection chirurgicale. (A) Illustration du glioblastome lorsque le microscope émet une lumière blanche. (B) Illustration après l’administration de 5-ALA qui va induire l’accumulation de la protoporphyrine IX. Suite à une excitation dans le bleue, cette dernière devient rouge fluorescente dans les cellules tumorales (d’après Colditz et coll., 2012).
Figure 7 : Mécanisme d’action du témozolomide (d’après Fukushima et coll.,2009).
cellulaire (Belden et coll., 2011). Le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC), nécessaire à l’établissement d’un microenvironnement favorable à l’expansion de la tumeur, se fait ensuite principalement grâce à la sécrétion de protéases telles que les MMPs et les cathepsines. Enfin, diverses voies de signalisation liées à des facteurs de croissance jouent également un rôle important dans la motilité cellulaire en activant, par exemple, les Rho- GTPases impliquées dans la réorganisation du cytosquelette d’actine (Nakada et coll., 2007 ; Belden et coll., 2011).
La dérégulation des cadhérines, la surexpression des intégrines αvβ1, αvβ3 et αvβ5 ainsi que la surexpression des protéases MMPs 2, 9 et 12, participent au phénotype invasif des glioblastomes (Maret et coll., 2010 ; Belden et coll., 2011).
6. Traitements.
6.1 Chirurgie.
Le traitement de première intention pour les patients atteints de glioblastome est la résection chirurgicale. Dans ce type de tumeur, la chirurgie n’est pas curative pour deux raisons. Tout d’abord, la localisation de la tumeur est un facteur limitant dont il faut tenir compte. Actuellement, la chirurgie éveillée avec électrostimulation intra-opérative permettant de cartographier les zones du cerveau impliquées dans les fonctions motrices, cognitives et du langage, est devenu un outil essentiel (Szelényi et coll., 2010 ; Moliterno et coll., 2012).
Ensuite, le caractère infiltrant des glioblastomes empêche la résection totale de la tumeur, qui récidivera quelques mois plus tard. Afin d’améliorer la visualisation de la tumeur lors d’une opération, la chirurgie, guidée par fluorescence avec l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA) commercialisé sous le nom de Gliolan®, peut être pratiquée : l’administration de 5-ALA va induire l’accumulation de la protoporphyrine IX fluorescente au sein des cellules tumorales (Figure 6) (Cortnum et Laursen, 2012 ; Moliterno et coll., 2012). Cette chirurgie cytoréductive permet de diminuer les symptômes liés à l’effet de masse de la tumeur. Elle permet aussi d’augmenter la réponse aux traitements adjuvants, améliorant la survie des patients (Moliterno et coll., 2012 ; Ricard et coll., 2012).
Figure 8 : Taux de survie des patients atteints de glioblastome traités par radiothérapie seule ou en combinaison avec le témozolomide (modifié d’après Stupp et coll., 2009).
Figure 9 : Agents chimiothérapiques de seconde ligne utilisés dans le traitement du glioblastome.
6.2 Radiothérapie et chimiothérapie standard.
Après la chirurgie, le témozolomide (TMZ, Temodal®) est utilisé comme traitement de référence de façon concomitante puis adjuvante à la radiothérapie (Stupp et coll., 2009). Le témozolomide est un agent alkylant de la famille des triazènes, caractérisé par une biodisponibilité orale élevée. De plus, ce composé est capable de passer la barrière hémato- encéphalique (Friedman et coll., 2000 ; Tentori et Graziani, 2009 ; Ricard et coll., 2012). À pH physiologique, le témozolomide est hydrolysé en 5-(3-méthyltriazène-1-yl) imidazole-4- carboxamide (MTIC) qui libère l’ion méthyldiazonium capable de méthyler les guanines en position O6 de l’ADN (Fukushima et coll., 2009). En cas de déficience de l’enzyme de réparation MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase), la guanine méthylée est incapable de se lier avec la cytosine durant la réplication de l’ADN engendrant un appariement incorrect (Figure 7) (Ochs et Kaina, 2000 ; Neidle et Thurston, 2005 ; Fukushima et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012). L’accumulation de mésappariements provoque un arrêt prolongé du cycle cellulaire en phase G2 et induit le processus d’autophagie qui sera suivi de mort par apoptose (Kanzawa et coll., 2004 ; Roos et coll., 2007).
Le témozolomide administré pendant (75 mg/m2 par jour) et après (150-200 mg/m2 par jour, 6 cycles de 5 jours espacés de 28 jours) la radiothérapie conventionnelle (60 Gy fractionnés en doses de 2 Gy délivrées 5 jours par semaine pendant 6 semaines) apporte un bénéfice thérapeutique réel pour les patients atteints de glioblastome. En effet, les taux de survie des patients traités par ce protocole thérapeutique sont augmentés par rapport à ceux
traités par radiothérapie seule (Figure 8) (Stupp et coll., 2009 ; Ricard et coll., 2012).
6.3 Chimiothérapie de seconde ligne.
Les chimiothérapies de seconde ligne peuvent être utilisées en cas d’échec du traitement de référence notamment en cas d’expression de l’enzyme de réparation MGMT. Les nitroso- urées telles que la carmustine et la lomustine, qui sont des agents alkylants de l’ADN, sont des alternatives couramment employées (Figure 9) (Johnson et Chang, 2012). Cependant, ces nitroso-urées n’apportent qu’un bénéfice modeste avec un taux de réponse inférieur à 10 % et un taux de survie sans progression à 6 mois de 15 % (Ricard et coll., 2012). Dans le cas d’un glioblastome récurrent, la lomustine est souvent utilisée en combinaison avec la procarbazine,
Figure 12 :Nouvelles thérapies ciblées utilisées dans le traitement du glioblastome. (Source : Perry et coll., Neurol Res Int, 2012)
Figure 10 :Nouvelles thérapies ciblées utilisées dans le traitement du glioblastome (d’après Perry et coll., 2012).
un autre agent alkylant de l’ADN et la vincristine (Vincrisin®), un inhibiteur de la polymérisation des microtubules, pour former le traitement connu sous le nom de PCV (procarbazine-lomustine-vincristine) (Figure 9) (Johnson et Chang, 2012 ; Ricard et coll., 2012).
6.4 Thérapies ciblées.
Actuellement, l’utilisation de molécules ciblant de manière spécifique certaines protéines altérées dans diverses voies de signalisation, responsables de la progression tumorale ou de la résistance aux traitements conventionnels est favorisée. Ces thérapies ciblées sont testées seule ou en combinaison avec d’autres traitements (Ricard et coll., 2012). Plus de 800 essais cliniques sont en cours pour le glioblastome (avril 2013, www.clinicaltrials.gov).
Les essais qui ont été les plus initiés dans le traitement des glioblastomes ciblent principalement les récepteurs RTKs, la voie de signalisation de PI3K/Akt ainsi que les facteurs angiogéniques (Figure 10) (Perry et coll., 2013). Le bevacizumab (Avastin®), un anticorps monoclonal humanisé anti-VEGF, est pressenti comme prometteur dans le traitement du glioblastome. Des études cliniques ont montré que le bevacizumab, administré seul ou en combinaison avec l’irinotecan (Campto® ; inhibiteur de la topoisomérase I), était associé à un taux de survie sans progression à 6 mois de 35 à 50 % dans le cas des glioblastomes récurrents (Friedman et coll., 2009).
D’autres approches sont en cours d’études notamment par le ciblage de la voie Notch (importante dans la biologie des cellules souches) ou par l’inhibition des mécanismes de réparation de l’ADN (Perry et coll., 2013). Le traitement par virus oncolytiques ainsi que l’immunothérapie sont également des voies explorées dans le traitement des glioblastomes (Hadjipanayis et Van Meir, 2009 ; Van Meir et coll., 2010 ; Perry et coll., 2013).
Rindopepimut, un vaccin dirigé contre l’oncogène EGFRvIII, est un exemple de ces nouveaux candidats thérapeutiques (Ricard et coll., 2012). Malgré le réel intérêt théorique de développer ce type de traitement, leur efficacité au niveau clinique s’est avérée décevante. L’optimisation de la distribution de ces thérapies ciblées en fonction du profil génétique des tumeurs sera un des défis majeurs dans les années à venir (Nicolaidis, 2013).
Figure 11 : Après la résection chirurgicale, le Gliadel® est implanté directement dans la cavité, permettant le relargage local de la carmustine (d’après Lesniak et Brem, 2004).
6.5 Thérapies locales.
Des traitements locaux ont été envisagés suite à la difficulté de la plupart des molécules administrées de manière systémique à passer la barrière hémato-encéphalique (BHE) (Lesniak et Brem, 2004). Le Gliadel®, constitué de gaufrettes imprégnées de carmustine est inséré dans la cavité chirurgicale formée après la résection tumorale (Figure 11) (Zhou et coll., 2012).
Une première étude clinique a pu mettre en évidence que ce système de relargage contrôlé était plus efficace que les thérapies standards dans le cas de glioblastomes récurrents (Brem et coll., 1995). Récemment, un système de délivrance par convection, utilisant des nanovecteurs tels que des liposomes, a également été testé sur des patients atteints de glioblastome (Zhou et coll., 2012). Soumis à un gradient de pression continu, les molécules chargées dans ces nanovecteurs, sont dispersées dans le cerveau via l’écoulement au travers d’une canule. Ce système de délivrance prometteur pourra être utilisé par exemple avec des agents de thérapie ciblée (Zhou et coll., 2012).
7. Chimiorésistance.
7.1 L’enzyme de réparation MGMT.
L’O6-méthylguanine DNA méthyltransférase (MGMT) est une enzyme de réparation de l’ADN qui élimine les groupements alkyles mutagéniques se fixant en position O6 de la méthylguanine (Hegi et coll., 2005). Le silence épigénétique du gène MGMT suite à la méthylation de son promoteur est fréquent dans les glioblastomes (~ 50 %). Il prédit une meilleure survie pour les patients atteints de ce type de tumeur, qui en association avec une radiothérapie, ont été traités avec des agents alkylants tels que le témozolomide (Hegi et coll., 2005). En effet, dans le cas d’une défaillance de l’enzyme MGMT, le système enzymatique MMR (mismatch repair), suite à l’accumulation de mésappariements dans l’ADN, peut induire l’apoptose des cellules tumorales (Allan et Travis, 2005 ; Hegi et coll., 2005 ; Oghaki et Kleihues, 2009 ; Stupp et coll., 2009).
7.2 Les pompes à efflux.
Les transporteurs à ATP-binding cassette (ABC), surexprimés dans les gliomes, sont impliqués dans la résistance « multi-drogue » en exportant les agents chimiothérapeutiques à l’extérieur de la cellule. La glycoprotéine-P (P-gp), la protéine de résistance multi-drogue 1
Figure 12 : Symbiose métabolique des cellules tumorales hypoxiques et normoxiques. Les cellules gliales tumorales ont la capacité de moduler leur métabolisme afin de s’adapter à un microenvironnement faible en oxygène. La surexpression d’HIF-1 en condition hypoxique induit l’expression de protéines qui favorisent la glycolyse (effet Warburg) conduisant à l’absorption du glucose par le transporteur GLUT1 (glucose transporter 1), à la conversion du glucose en pyruvate par les enzymes glycolytiques, à la génération de lactate et d’H+ par la LDHA (lactate dehydrogenase A) et à l’efflux de ces molécules hors de la cellule grâce à l’anhydrase carbonique IX (CA9), au MCT4 (monocarboxylate transporter 4) et à l’échangeur sodium-hydrogène (NHE1). L’acidification résultante va permettre l’expansion tumorale en créant un environnement hostile pour le tissu sain. Par ailleurs, les cellules tumorales en aérobie sont capables de récupérer le lactate grâce au transporteur MCT1 et de l’utiliser comme principal substrat pour la phosphorylation oxydative mitochondriale, permettant une symbiose métabolique entre les cellules tumorales hypoxiques et normoxiques (d’après Semenza,2008).
(MRP1) ainsi que la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) sont les principales protéines appartenant à cette famille de transporteurs (Yamada et Nakano, 2012). Dans les glioblastomes, la résistance au témozolomide est associée à l’expression du gène MDR1 (multidrug resistance 1) codant la protéine P-gp. De plus, similairement au statut MGMT, la survie des patients traités avec le témozolomide est directement corrélée à l’expression d’un variant génétique de ce gène (Schaich et coll., 2009). La protéine MRP1 serait, quant à elle, liée à la chimiorésistance dans les traitements à l’étoposide (Celltop® ; un inhibiteur des topoisomérases II) et à base de vincristine (Vincrisin®) dans les gliomes de haut grade (Benyahia et coll., 2004). De même, la distribution dans le cerveau des inhibiteurs du récepteur EGFR, tels que l’erlotinib (Tarceva®) et le géfitinib (Iressa®), est limitée par les protéines P-gp et BCRP (Agarwal et coll., 2010 ; de Vries et coll., 2010). Cette protéine BCRP, codée par le gène ABCG2 (ABC sub-family G member 2), ainsi que la protéine MRP1, codée par le gène ABCC1 (ABC sub-family C member 1), seraient également impliquées dans la chimiorésistance des cellules CSCs (Hirschmann et coll., 2004 ; Caldera et coll., 2012 ; Yamada et Nakano, 2012).
7.3 L’hypoxie.
Comme décrit précédemment, les glioblastomes sont caractérisés par de larges zones d’hypoxie (Haar et coll., 2012). Les facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF) sont des médiateurs clés de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Ils jouent un rôle crucial dans la progression des gliomes, le métabolisme, l’angiogenèse, la résistance à la radio- et chimiothérapie et le maintien du phénotype des cellules souches cancéreuses (CSCs) (Yang et coll., 2012). Par conséquent, l’hypoxie tumorale est un élément clé qui explique la faible réponse aux traitements actuels ainsi que le mauvais pronostic associés à ce type de tumeur (Yang et coll., 2012).
HIF-1 est un hétérodimère constitué de 2 sous-unités : HIF-1α et HIF-1β. Tandis qu’HIF- 1β est exprimé de manière constante dans les cellules, la sous-unité HIF-1α est rapidement dégradée par le protéasome en normoxie. Cependant, en condition hypoxique, HIF-1α n’est plus réprimée : le dimère HIF-1 peut ainsi se former et se lier à l’ADN des gènes cibles (Adams et coll., 2009).
En hypoxie, l’expression d’HIF-1α entraine la transcription de gènes conduisant les cellules gliales tumorales à privilégier la glycolyse (effet Warburg) (Figure 12) (Semenza, 2008).
Figure 13 : La niche vasculaire et la niche hypoxique des cellules souches de gliome. Les niches vasculaires sont importantes dans la croissance des gliomes, probablement grâce aux facteurs sécrétés par les cellules endothéliales (EC) présentes dans la niche ainsi qu’à l’apport en nutriments provenant des vaisseaux sanguins. D’autre part, les cellules souches de gliome (GSCs) maintiennent probablement leur caractère de cellules souches par l’activation de voies de signalisation liées à l’hypoxie. Les cellules GSCs peuvent également recruter les cellules endothéliales en sécrétant des facteurs angiogéniques ou en se différenciant directement en cellules de la lignée endothéliale, qui à son tour supporte la croissance des gliomes (d’après Chen et al., 2012b).
Figure 14 : IRM (imagerie par résonnance magnétique) d’un patient atteint d’un glioblastome. Malgré la résection chirurgicale de la tumeur suivie de chimiothérapie concomitante à la radiothérapie, le patient montre une récidive tumorale adjacente au premier foyer (d’après Nakada et coll., 2007).
Cette voie métabolique favorise la synthèse d’ATP (adénosine triphosphate) par la transformation du glucose en pyruvate au détriment de la phosphorylation oxydative consommatrice en oxygène. Malgré le faible rendement énergétique associé à la glycolyse (2 moles d’ATP/mole de glucose), cette voie permet de résister à un microenvironnement tumoral faiblement vascularisé (Figure 12) (DeBerardinis et coll., 2007 ; Semenza, 2008). De plus, l’acidification de la matrice suite au relargage du lactate et des ions H+, issus de la conversion du pyruvate, va créer un environnement hostile pour le tissu sain facilitant l’expansion tumorale (Mathupala et coll., 2010). Ce changement métabolique confère aux cellules de glioblastome un avantage au niveau de la résistance aux agents chimiothérapeutiques (Egler et coll., 2008 ; Oliva et coll., 2011). En effet, les cellules cancéreuses en condition normoxique favorisent la phosphorylation oxydative, produisant des niveaux élevés de ROS impliqués dans le stress oxydatif intrinsèque. Elles sont par conséquent plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques générant des ROS exogènes comme le témozolomide (Oliva et coll., 2011).
Malgré qu’HIF-1α puisse favoriser l’angiogenèse via la surexpression du facteur VEGF, le système vasculaire provenant d’une prolifération trop rapide, est souvent tortueux et mal organisé, ce qui diminue l’exposition des cellules gliales tumorales aux agents chimio- thérapeutiques (Bar, 2011 ; Haar et coll., 2012). L’activation de la voie de signalisation des récepteurs RTKs, diminuant l’activité de la protéine pro-apoptotique Bad (Bcl-2 antagonist of cell death) ainsi que l’activation des protéines P-gp, en condition hypoxique, contribuent également à la chimiorésistance des glioblastomes (Comerford et coll., 2002 ; Merighi et coll., 2007).
Les cellules souches de glioblastome (CSGs) résident dans des niches vasculaires afin de s’approvisionner en oxygène et nutriments et dans les régions d’hypoxie, afin de maintenir leur phénotype de cellules CSCs (Figure 13) (Bar, 2011 ; Chen et coll., 2012b ; Yang et coll., 2012). HIF-1α entraine l’activation de facteurs de transcription tels que Notch et Oct4 contrôlant la capacité d’auto-renouvelement et de multipotence de ces cellules (Yang et coll., 2012). Les cellules CSGs, en surexprimant l’enzyme MGMT et les transporteurs ABC, sont résistantes aux agents chimiothérapeutiques (Caldera et coll., 2012). De plus, les cellules CSGs possèdent la capacité de réduire les lésions de l’ADN induites par les radiations (Bao et coll., 2006 ; Pisollato et coll., 2010 ; Haar et coll., 2012).
Figure 15 : Dans la voie extrinsèque, l’activation des récepteurs de mort (DR, death receptor) (p.ex. TRAILR (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor), TRAMP (TNF-receptor- related apoptosis-mediated protein), TNFR (tumor necrosis factor receptor 1), FAS, CD95 par leurs ligands respectifs va entrainer leur trimérisation et le recrutement de la protéine FADD (Fas-associated protein with death domain). Ensuite, le domaine effecteur de mort de FADD permet d’attirer les caspases initiatrices 8 et 10 afin de former le complexe DISC (death inducing signal complex) dans lequel les caspases initiatrices sont activées par protéolyse. Les caspases 8 et 10 activées vont ensuite cliver la caspase effectrice 3 qui va à son tour entrainer l’activation des CADs (caspases activated DNase) conduisant à la fragmentation internucléosomale de l’ADN. La voie intrinsèque est, quant à elle, sollicitée en réponse à la privation de facteurs de croissance ou en réponse à un stress cellulaire (lésions de l’ADN pouvant être induites par radio- et chimiothérapie, hypoxie, privation de nutriments, troubles ioniques) et est contrôlée par des protéines de la famille de Bcl-2. La protéine p53 activée favorise l’apoptose en induisant l’expression de gènes pro-apoptotiques tels que PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis) et NOXA (en latin, lésion). L’activation des protéines BAX (Bcl-2–associated X) et BAK (Bcl-2 homologous antagonist/killer) conduit ensuite à la perméabilisation des membranes mitochondriales, libérantla protéine Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspases) / (direct IAP-binding protein with low pI) et le cytochrome C. Celui-ci se retrouve dans le cytoplasme où il est complexé avec Apaf- 1(apoptotic peptidase activating factor 1). Après le recrutement de la pro-caspase 9, on aboutit à la formation de l’apoptosome. L’activation subséquente de la caspase 9 conduit au clivage des caspases effectrices 3, 6 et 7. Smac/DIABLO favorise l’apoptose en bloquant l’activité des IAPs (inhibitors of apoptosis proteins). Il existe une communication entre les deux voies grâce à une protéine de la famille Bcl-2: BID. En effet, la voie extrinsèque peut activer la voie intrinsèque grâce à BID qui, clivée, va à la mitochondrie et amplifie le signal (d’après Kang et coll., 2012).
7.4 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose.
L’invasion des cellules tumorales dans le parenchyme cérébral explique aussi l’échec thérapeutique actuel. Plus de 90 % des patients atteints de glioblastome développent une tumeur récurrente après chirurgie et traitements radio- et chimiothérapeutiques, en général à quelques centimètres du site d’origine (Figure 14) (Furnari et coll., 2007 ; Nakada et coll., 2007).
Afin de privilégier la migration, les cellules tumorales gliales invasives voient diminuer leur capacité à proliférer (Giese et coll., 2003). De plus, ces cellules sont résistantes à l’apoptose afin de se protéger contre l’anoïkose (forme spécifique d’apoptose due à un défaut d’interaction entre la cellule et la matrice extracellulaire) pouvant survenir lors de la migration cellulaire (Taddei et coll., 2012). Or, la plupart des agents anticancéreux utilisés actuellement pour combattre les glioblastomes sont des agents pro-apoptotiques (Giese et coll., 2003 ; Furnari et coll., 2007 ; Belden et coll., 2011). Plusieurs mécanismes moléculaires confèrent aux cellules tumorales gliales migrantes cette résistance à l’apoptose (Krakstad et Chekenya, 2010).
L’apoptose peut être déclenchée par deux voies de signalisation, la voie extrinsèque ou « des récepteurs de mort » et intrinsèque dite « mitochondriale » (Figure 15). Tout d’abord, trois changements moléculaires majeurs, intervenant dans ces deux voies, augmentent le phénotype anti-apoptotique des glioblastomes:
(a) la diminution de l’efficacité des facteurs extracellulaires de l’apoptose. Par exemple, la protéine DcR3 (decoy receptor 3), dont l’expression est augmentée dans les gliomes de haut grade, est capable de se lier et d’inactiver le ligand de mort CD95L (Roth et coll., 2001 ; Furnari et coll., 2007),
(b) la diminution de l’activité des récepteurs de mort (Aggarwal, 2003 ; Furnari et coll., 2007), et
(c) la diminution de l’activité des protéines pro-apoptotiques (Bax, caspases, p53) ainsi que la surexpression des protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) et Bcl-XL (B-cell lymphoma-extra large) (Giese et coll., 2003 ; Krakstad et Chekenya, 2010 ; Belden et coll., 2011 ; Squatrito et Holland, 2011, Kang et coll., 2013).
Ensuite, la sur-activation de la voie de signalisation de PI3K en aval des intégrines et des récepteurs RTKs, peut également être impliquée dans la résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. PI3K en activant Akt, va entrainer l’inhibition de la cascade apoptotique engendrée par BAD ainsi que l’activation de NFƘB (nuclear factor-kappa B), responsable de l’augmentation des protéines inhibitrices de l’apoptose (IAPs) (Belden et coll., 2011 ; Cartier et coll., 2012). Celles-ci, en conduisant à l’inhibition du clivage de la pro-caspase 3, protègent les cellules de l’apoptose. De plus, la mutation du gène PTEN favorise l’activation d’Akt, un inhibiteur de la protéine pro-apoptotique BAD (Belden et coll., 2011 ; Cartier et coll., 2012 ; Kang et coll., 2013).
II. La paraptose : une mort cellulaire non-apoptotique.
L’induction d’une mort cellulaire non-apoptotique représente une alternative thérapeutique dans le traitement des glioblastomes afin de court-circuiter leur résistance intrinsèque à l’apoptose. Nous nous sommes principalement intéressés, dans le cadre de ce travail, à la paraptose récemment mise en évidence par Sperandio et ses collaborateurs (Sperandio et coll., 2000). Nous décrirons dans un premier temps les principaux types de mort cellulaire ainsi que leurs caractéristiques biochimiques et morphologiques avant de détailler les spécificités de la paraptose au niveau de ces divers types de mort cellulaire.
1. Les principaux types de mort cellulaire.
1.1 L’apoptose.
L’apoptose, également appelée « mort cellulaire programmée de type I », est le processus physiologique par lequel l’organisme élimine les cellules non désirées, endommagées ou infectées. Elle joue un rôle crucial dans le développement des organismes pluricellulaires et le maintien de l’homéostasie cellulaire (Kerr et coll., 1972 ; Rudel et coll., 2010). Le nom apoptose fait référence à la chute des feuilles à l’automne : apo pour « éloignement » et ptôsis pour « chute ». Ce processus de mort cellulaire est activé par de nombreux stimuli physiologiques ou pathologiques, comprenant par exemple : l’activation des récepteurs de mort, une carence en facteurs trophiques, une infection virale, un stress oxydatif ou encore des agents génotoxiques (Rudel et coll., 2010 ; Kang et coll., 2012). En fonction des signaux pro- apoptotiques, deux voies sont susceptibles d’engendrer cette mort cellulaire : la voie des récepteurs de mort ou la voie mitochondriale (Figure 15). Malgré que ces voies de signalisation soient différentes, elles aboutissent toutes deux à l’activation des protéines à cystéine appelées caspases (Rudel et coll., 2010 ; Kang et coll., 2012). Celles-ci vont ensuite activer l’endonucléase CAD (caspase activated DNAse), une enzyme capable de cliver l’ADN entre les nucléosomes, engendrant des fragments d’environ 200 paires de base (pB) ou multiples de cette longueur (Saraste et Pulkki, 2000). La protéine PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase 1) est une enzyme nucléaire de 113kD impliquée dans la réparation de l’ADN. Au cours du processus d’apoptose, PARP est clivée par les caspases effectrices 3 et 7 en fragments de 89kD et 24kD (D’Amours et coll., 2001). L’externalisation de la
Figure 16 : Changements morphologiques apparaissant au cours du processus d’apoptose.
Tout d’abord, la cellule rétrécit, la chromatine se condense et la membrane plasmique bourgeonne. Il y a ensuite formation de corps apoptotiques qui vont être phagocytés (modifié d’après Gewies, 2003).
