Analyses de l’expression et de l’activité des protéines

La technique du western blot permet la détection et éventuellement une analyse semi-quantitative du taux d’expression d’une protéine dans un échantillon cellulaire. Tout d’abord, les extraits protéiques sont obtenus en lysant les cellules avec du CelLytic^® (50 µl/25 cm² ; Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Lorsque nous avons analysé l’expression de pFAK, nous avons ajouté 1mM d’orthovanadate sodique (Na₃VO₄, Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) au CelLytic^®. Ensuite, la concentration protéique est dosée à l’aide d’un test colorimétrique (BCA protein assay Kit, Pierce, Perbio Science, Aalst, Belgique). Il se base sur la capacité des

44 protéines à réduire en milieu alcalin le Cu²⁺ en Cu⁺. Le complexe formé par le Cu⁺ et l’acide bicinchonique (BCA) va donner une couleur pourpre. La densité optique des échantillons est mesurée à une longueur d’onde de 562 nm (Microplate Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique). Les mesures seront comparées à une courbe standard de concentrations connues d’albumine bovine (BSA). Lorsque la teneur en protéine est quantifiée, 10 à 40 µg d’échantillon protéique est déposé dans un gel d’électrophorèse, en présence de SDS (sodium dodecyl sulfate) qui dénature les protéines et leur confère une charge négative. La concentration en polyacrylamide du gel varie de 5 à 15% en fonction du poids moléculaire de la protéine d’intérêt. Dans chaque puits du gel, on charge la même quantité de protéines. Celles-ci sont au préalable mélangées à un tampon de charge (500 mM Tris-HCl à pH 6.8, 30% glycérol, 10% SDS, 0.012% bleu de bromophénol) et dénaturées en les chauffant à 95°C durant 5 minutes. Un marqueur de poids moléculaire, composé de différentes protéines de poids moléculaire connu, est placé dans un puits en parallèle ce qui permet d’identifier la protéine d’intérêt. Sous l’influence d’un courant électrique, les protéines chargées vont migrer dans le gel vers l’anode et sont ainsi séparées en fonction de leur poids moléculaire. La migration, réalisée sous une tension de 200 Volts, se fait dans un tampon de migration composé de 25 mM de Tris HCl, 192 mM de glycine et 0.1% de SDS. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de polyvinylidiène difluoride (PVDF) sous une tension de 100 Volts à 4°C pendant 90 minutes dans un tampon de transfert composé de 25 mM de Tris HCl, 192 mM de glycine et 20% de méthanol. Afin de limiter les liaisons aspécifiques des anticorps, la membrane est incubée pendant 1 heure sous agitation dans un tampon de blocage à pH 7.4 contenant une solution de TBS (20 mM Tris-HCl à pH 7.6, 137 mM NaCl), 0.2% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) et 5% de lait en poudre ou 5% de BSA (MP Biomedicals, Bruxelles, Belgique). La membrane est ensuite incubée une nuit à 4°C sous agitation en présence de l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt dilué dans le tampon de blocage utilisé. Après plusieurs rinçages avec le tampon TBS contenant 0.2% de Tween, la membrane est incubée 1 heure à température ambiante avec un anticorps secondaire, couplé à une péroxydase (Horse Radish peroxydase, HRP), reconnaissant l’anticorps primaire. La révélation est réalisée au moyen du Kit SuperSignal (Pierce, Perbio Science, Aalst, Belgique). Elle repose sur la libération de lumière émise suite à l’oxydation du luminol qui est catalysée par la réduction en milieu alcalin du péroxyde d’hydrogène par la péroxydase présente sur l’anticorps secondaire. L’analyseur d’image BioRad ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Nazareth Eke, Belgique) permet pour finir de quantifier le taux

Anticorps primaires Firme Dilution

Phosphorylated FAK R&D Systems 1/100

FAK R&D Systems 1/100

HIF-1α Abcam 1/200

CD-44 Abcam 1/2500

Nestin Abcam 1/60

PARP BD Pharmingen 1/250

KCa1.1 Alomone Labs 1/500

Tubulin Abcam 1/5000

Anticorps secondaires Firme Dilution

Souris Pierce 1/1000-1/10000

Lapin Pierce 1/1000-1/10000

Chèvre Pierce 1/1000

Table 5 : Dilution et origine des anticorps utilisé en western blot dans ce travail.

Anticorps primaires Firme Dilution

KCa1.1 Alomone Labs 1/50

GRP78 Santa Cruz Biotech 1/100

Anticorps secondaires Firme Dilution

Lapin Alexa Fluor Invitrogen 1/500

Souris Alexa Fluor Invitrogen 1/500

45 d’expression des protéines. Un contrôle d’expression protéique avec la tubuline est effectué dans chaque condition expérimentale. Les anticorps primaires et secondaires utilisés en western blot ainsi que leur origine et leur dilution sont décrits dans la Table 5.

1.2 La microscopie à fluorescence.

L’immunofluorescence permet de visualiser à l’aide d’un microscope à fluorescence l’expression ainsi que la localisation d’une protéine d’intérêt au sein des cellules. Les cellules sont cultivées en plaque 6 puits (Sarstedt, Essen, Belgique) dans lesquelles sont déposées des lamelles de verre de 18*18 mm qui ont été stérilisées (Menzel-Gläser, Braunschweig, Allemagne). Les cellules sont ensemencées à la concentration voulue dans 4 ml de milieu de culture. Après 24 heures ou un autre temps de traitement, le milieu de culture est retiré et les cellules sont rincées 2 fois au PBS (Lonza, Verviers, Belgique). Elles sont ensuite fixées avec une solution de formaldéhyde à 4% tamponnée à pH 7.4 pendant 20 minutes à 4°C. Après un rinçage au PBS, les cellules sont perméabilisées avec une solution de PBS contenant 0.2% de TritonX-100 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) durant 5 minutes. Une fois rincées au PBS, les cellules sont saturées avec un tampon de blocage (5% BSA dans du PBS) afin de limiter toutes liaisons aspécifiques éventuelles. Les lamelles sont ensuite successivement incubées 2 heures avec l’anticorps primaire dilué dans une solution PBS-BSA (5%), rincées au PBS puis incubées 1 heure à l’abri de la lumière avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorochrome spécifique de l’anticorps primaire. Cette étape peut être répétée si on souhaite observer plusieurs protéines d’intérêt en même temps. Pour finir, les lamelles sont montées sur des lames en verre avec 10 µl d’alcool polyvinylique associé à un réactif DABCO®

« antifading » (Fluka, Belgique). La lecture des lames s’effectue au moyen d’un microscope à fluorescence Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen, Germany) équipé d’une caméra AxioCam HRm et couplé à un système d’analyse d’image (AxioVision Rel 4.6). Les anticorps primaires et secondaires utilisés en immunofluorescence ainsi que leur origine et leur dilution sont décrits dans la Table 6. Le MitoTracker Green FM (100 nM, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) a été utilisé pour marquer les mitochondries des cellules vivantes et fixées tandis que l’ER-Tracker Blue-White DPX (1µM, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) n’a été utilisé que pour marquer le réticulum endoplasmique des cellules vivantes. Les cellules vivantes, ensemencées sur des lamelles en verre, sont incubées pendant 30 minutes avec ces marqueurs avant d’être visualisées par microscopie à fluorescence.

46 L’analyse de l’organisation du cytosquelette d’actine se fait également par microscopie à fluorescence. L’actine fibrillaire est marquée avec la phallacidine conjuguée à un fluorochrome Bodipy-FL^® (Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) tandis que l’actine globulaire est marquée avec de la DNase I couplée au Texas Red®

(Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgique). Après les mêmes étapes de culture, de fixation, de perméabilisation et de rinçage, les cellules sont incubées 2 heures à température ambiante dans l’obscurité avec un mélange de phallacidine et de DNase fluorescentes contenant du glycérol et de la BSA, avant d’être montées sur lames en verre.

1.3 Le test d’inhibition des protéines kinases.

La société ProQinase (Fribourg, Allemagne) a déterminé l’effet des terpénoïdes étudiés dans ce travail sur un éventail de 288 protéines kinases (Annexe I). Leur test repose sur un dosage radiométrique (³³PanQinase^® Activity Assay) réalisé en plaques 96 puits (FlashPlates, Perkin Elmer, Boston, USA). Les protéines kinases humaines recombinantes sont extraites à partir de cellules d’insectes de la lignée Sf9 ou d’Escherichia coli ; leur purification est obtenue par chromatographie d’affinité sur gel d’agarose (type GSH-agarose ou Ni-NTA-agarose). La société ProQinase vérifie par spectrométrie de masse l’identification de chaque protéine kinase.

L’activité d’une protéine kinase est mesurée en suivant la phosphorylation d’une protéine donnée ou substrat via le transfert d’un groupement phosphate provenant de l’ATP marqué. Plus précisément, 10 µl d’ATP solubilisé dans de l’eau, 25 µl d’un tampon contenant de l’ATP radioactif [γ-33P], 5 µl du produit testé et 10 µl du mélange enzyme/substrat sont déposés dans chaque puits. Les plaques sont placées dans un incubateur thermostatisé à 30°C durant 1 heure. La réaction est arrêtée avec 50 µl d’une solution d’H3PO4 2%. Après que les puits aient été rincés plusieurs fois avec 200 µl de NaCl 0.9%, la radioactivité (incorporation du ³³Pi) est déterminée grâce à un compteur de scintillation (Wallac Microbeta, Perkin Elmer, USA). Ces tests sont réalisés dans un système robotisé (Beckman Coulter Biomek 2000/SL robotic system, Allemagne).

Un « contrôle faible » et un « contrôle élevé » sont définis sur chaque plaque. Le « contrôle faible » correspond à la fixation non spécifique de la radioactivité en présence du substrat mais pas de la protéine kinase. Il se calcule en déterminant la valeur médiane du nombre de coups par minute (cpm) mesuré pour la colonne 1 (n=3) de la plaque 96 puits. Le

Figure 32 : Illustration du test colorimétrique MTT. Les cellules sont ensemencées dans une plaque 96 puits. Après 24 heures, des concentrations croissantes du produit à analyser sont mises en présence des cellules. Après 72 heures, le réactif MTT ajouté va être transformé en cristaux de formazan qui vont être solubilisés avec du diméthylsulfoxide. L’intensité de la coloration est mesurée par spectrométrie (créé d’après Stockert et coll., 2012).

47 « contrôle élevé » correspond, quant à lui, à l’activité totale mesurée en l’absence de tout inhibiteur potentiel. Il se calcule en déterminant la valeur médiane du nombre de cpm mesuré pour la colonne 2 (n=3) de la plaque. La différence entre ces deux contrôles équivaut à une activité de 100%. L’activité résiduelle de chaque puits est déterminée de la façon suivante :

Activité résiduelle (%) = [(cpm du composé étudié – contrôle faible)/(contrôle élevé – contrôle faible)] x 100

La fusicoccine A a été testée à une concentration finale de 50 µM tandis que l’ophioboline A a été testée à une concentration finale de 0.5 µM. Ces tests ont été réalisés en duplicat.