La fusicoccine A est un diterpénoïde tricyclique glycosylé extrait du champignon
Phomopsis amygdali. Dans un premier temps, nous avons démontré à l’aide du test colorimétrique MTT que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de cette molécule n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Ce test nous a également permis de mettre en évidence que la fusicoccine A possédait un indice de biosélectivité entre cellules normales et cellules cancéreuses supérieur à 10, indiquant que la cible de cette molécule est probablement surexprimée dans les cellules cancéreuses. Dans un second temps, la vidéomicroscopie quantitative a révélé que la fusicoccine A avait principalement des effets cytostatiques sur les cellules de glioblastome, notamment en augmentant la durée des divisions. En plus de ses effets sur la prolifération cellulaire, la fusicoccine A peut diminuer la migration des cellules de glioblastome dans des modèles de culture bidimensionnels (comme montré en vidéomicroscopie quantitative) et tridimensionnels (chambres d’invasion de Boyden) mais également leur adhésion. Les
69 modifications de l’organisation du cytosquelette d’actine induites par la fusicoccine A peuvent expliquer, au moins en partie, ces derniers résultats. Grâce aux tests proposés par la société ProQinase, nous avons pu montrer que la fusicoccine A inhibait de plus de 50 % l’activité résiduelle d’une dizaine de protéines kinases dont la plupart interviennent dans l’organisation du cytosquelette d’actine. Nous avons décidé de nous intéresser particulièrement à la kinase d’adhérence focale (FAK) pour les raisons que nous citerons ci-dessous. Nous avons observé par western blot que la fusicoccine A diminuait l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 (Y397) de la kinase FAK dans les cellules de glioblastome de manière dose-dépendante en conditions normoxiques et hypoxiques. Lorsque la fusicoccine A a été testée sur des cellules de glioblastome surexprimant cette kinase FAK, sa concentration d’inhibition de croissance IC50 a été doublée par rapport à celle obtenue sur des cellules contrôles. Ces résultats ont d confirmé que la kinase FAK était associée aux effets anticancéreux in vitro de la fusicoccine A. Cependant, nous n’avons pas encore pu identifier le site de liaison de notre molécule avec la kinase FAK. La fusicoccine A présente des effets anticancéreux similaires à ceux décrits pour le 1,2,4,5-benzene tetraamine tetrahydrocloride (Y15) (Golubovskaya et coll., 2008). En effet, comme la fusicoccine A, ce composé diminue la prolifération, l’invasion et l’adhésion des cellules cancéreuses et ce, en inhibant l’autophosphorylation de la kinase FAK et l’activité kinase de cette protéine. À l’aide d’une étude de liaison in silico (docking moléculaire), Golubovskaya et ses collaborateurs ont démontré qu’Y15 avait une affinité pour le site Y397 (Golubovskaya et coll., 2008). Nous envisageons de collaborer avec le Dr M. Prévost, spécialisée en docking moléculaire, (Laboratoire de Structure et Fonction des Membranes Biologiques, Centre de Biologie Structurelle et Bioinformatique, Faculté des Sciences, ULB) afin d’identifier le site de liaison de la fusicoccine A avec la protéine kinase FAK.
La protéine kinase FAK est une cible d’intérêt pour le traitement des
glioblastomes.
La kinase FAK est une protéine cytoplasmique jouant un rôle important au sein du complexe d’adhérence. Son activation par les intégrines ou les facteurs de croissance se manifeste par l’autophosphorylation du résidu tyrosine 397 libérant un site de liaison pour la protéine Src. Cette liaison entraine l’activation des protéines du complexe d’adhérence qui va aboutir à l’activation des voies de signalisation de PI3K/Akt, de ERK et de JNK (Cornillon et
coll., 2003 ; McLean et coll., 2005). La protéine FAK est surexprimée dans différentes lignées cellulaires cancéreuses dont des glioblastomes. La surexpression de la kinase FAK augmente la prolifération et la migration des cellules tumorales mais également les protège de l’apoptose. La surexpression de cette protéine est directement corrélée avec la progression tumorale et est donc associée à un pronostic clinique défavorable (Cornillon et coll., 2003 ; Natarajan et coll., 2003 ; McLean et coll., 2005 ; Siesser et Hanks, 2006).
De plus, Skuli et ses collaborateurs ont mis en évidence que les voies de signalisation de l’adhérence cellulaire pouvaient être modulées par les conditions d’oxygénation des cellules (Skuli et coll., 2009). Tout d’abord, ils ont démontré que dans les cellules de gliome U87 et SF763, l’hypoxie augmente la formation de points focaux d’adhérence impliquant les intégrines αVβ3 et αVβ5 et que cette augmentation était corrélée avec l’expression de la protéine FAK. Ils ont également montré que les voies d’adhérence cellulaire, via l’inhibition des intégrines et de la kinase FAK par des siRNA spécifiques, pouvaient réguler la réponse et l’adaptation des cellules à l’hypoxie en contrôlant le taux intracellulaire de la sous-unité HIF-1α. Dans les cellules U87 et SF763, l’inhibition des intégrines αVβ3 et αVβ5 et de la protéine FAK diminue l’expression du facteur HIF-1α. Ensuite, ces auteurs ont vérifié in vivo sur des xénogreffes de cellules U87 l’effet de l’inhibition des voies de l’adhérence cellulaire en injectant directement dans les tumeurs des siRNA ciblant l’intégrine αVβ3 et la kinase FAK. Ces expériences in vivo leur ont permis de mettre en évidence que l’inhibition de ces deux protéines entrainait une ré-oxygénation des xénogreffes corrélée avec une diminution de l’expression de HIF-1α et une normalisation de la vascularisation des tumeurs (Skuli et coll., 2009).
De par sa surexpression et sa capacité à réguler les différentes voies de signalisation impliquées dans le pronostic défavorable des glioblastomes, la kinase FAK représente une cible d’intérêt (Cornillon et coll., 2003 ; Gabarra-Niecko et coll., 2005 ; McLean et coll., 2005; Skuli et coll., 2009). La fusicoccine A est par conséquent un agent thérapeutique potentiel pour combattre les glioblastomes. Notre groupe de recherche a déjà montré auparavant que l’utilisation d’un agent anti-invasif pouvait améliorer la sensibilité des cellules de glioblastome in vitro et in vivo aux insultes cytotoxiques d’agents apoptotiques et pro-autophagiques (Mégalizzi et coll., 2007). Golubovskaya et ses collaborateurs ont récemment démontré qu’Y15, un inhibiteur de l’autophosphorylation de FAK, pouvait agir en synergie avec le témozolomide et ainsi bloquer totalement la croissance de la tumeur in vivo. Une dose
71 de 100 mg/kg d’Y15 a été administrée quotidiennement par voie orale à des souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes de glioblastome (Golubovskaya et coll., 2013). Alors qu’il faut 50 µM de fusicoccine A pour diminuer de 50 % l’invasion in vitro des cellules de glioblastome après 24 heures de traitement, ce groupe de recherche a montré qu’1 µM d’Y15 suffisait à obtenir ces mêmes résultats. Cette différence d’activité in vitro peut expliquer que n’avons pas observé de bénéfices thérapeutiques avec la fusicoccine A dans notre modèle in vivo, la dose de 80 mg/kg injectée 3 fois par semaine en intrapéritonéal étant probablement trop faible.