III. Description des modèles expérimentaux
1. Les modèles in vitro
1.1 Lignées cellulaires établies.
Les lignées cellulaires cancéreuses établies utilisées dans ce travail proviennent de l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA) et de la Deutsche Sammlung
40 von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany) et sont référencées de la manière suivante :
-U373-MG, glioblastome, code ATCC: HTB-17 -T98G, glioblastome, code ATCC : CRL-1690
-Hs683, oligodendrogliome de grade III, code ATCC : HTB-138
-A549, carcinome du poumon non à petites cellules (NSCLC), code DSMZ : ACC107 -SKMEL28, mélanome, code ATCC : HTB-72
-B16F10, mélanome murin, code ATCC : CRL-6475.
1.2 Primocultures.
La primoculture de glioblastome humain GL19 nous a été fournie par le Professeur Walter Berger (Department of Medicine I, Comprehensive Cancer Center and Institute of Cancer Research, Medical University Vienna, Vienna, Austria). Elle a été établie dans le Département de Neurochirurgie de l’Hôpital Wagner-Jauregg situé à Linz en Autriche comme décrit précédemment (Berger et coll., 2001). Cette primoculture a été utilisée entre le troisième et le dixième passage afin d’éviter toute déviance de la culture.
Les lignées cellulaires de kératinocytes sont issues du laboratoire du Professeur Y. Poumay (Laboratoire Cellules et Tissus, URPHYM, Faculté Universitaire Notre-Dame-de-la-Paix (FUNDP), Namur, Belgique) et proviennent de la résection chirurgicale de peau pratiquée par le Dr B. Bienfait (Clinique Saint-Luc Bouge, Namur, Belgique) sur des adultes humains.
Les astrocytes murins proviennent du laboratoire du Professeur B. Rogister (Laboratoire de Neurobiologie du Développement, GIGA-Neurosciences, Université de Liège, Sart-Tilman B, Belgique).
1.3 Lignées cellulaires multi-drogues résistantes.
La lignée cellulaire HL60 issue de leucémie pro-myéloïde ainsi que ses sous-lignées résistantes à l’adriamycine (surexprimant MRP1, gène ABCC1), à la vincristine (surexprimant P-gp, gène ABCB1) et à la mitoxantrone (surexprimant BCRP, gène ABCG2), ont été fournies par le Dr M. Center (Kansas State University, Manhattan, USA) au Professeur W. Berger (McGrath et Center, 1988 ; Heffeter et coll., 2005). La lignée cellulaire A2780 de carcinome d’ovaire et sa variante résistante au cisplatine ont été obtenues auprès de
Sigma-41 Aldrich. La lignée cellulaire GLC4 de carcinome de poumon à petites cellules ainsi que sa sous-lignée résistante à l’adriamycine, surexprimant MRP1 et LRP, ont été données par le Dr EG. de Vries (Groningen, Pays-Bas) au Prof. W. Berger (Zijlstra et coll., 1987 ; Heffeter et coll., 2007). La lignée cellulaire HCT116 du cancer du côlon exprimant la protéine p53 et son clone dans lequel la protéine p53 est délétée, ont été fournis par le Dr B. Vogelstein (John Hopkins University, Baltimore, USA) au Prof W. Berger. La surexpression des transporteurs ABC et la délétion de p53 ont été vérifiées par western blot au sein de l’équipe du Prof. W. Berger.
1.4 Milieux et conditions de culture.
Toutes les lignées cellulaires cancéreuses sont cultivées dans des incubateurs thermostatisés à 37°C sous atmosphère contrôlée à 21% d’O2, 5% de CO2 et saturée en eau. Une chambre à hypoxie contenant 1% d’O2 a également été utilisée pour la culture des cellules lors de certaines expériences. Le milieu de culture cellulaire RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) est complémenté avec de la glutamine (0.6 mg/ml), un mélange de pénicilline et de streptomycine (200 UI/ml) et de la gentamycine (0.1 mg/ml) (Lonza, Verviers, Belgique). Ce milieu est aussi enrichi avec 10% de sérum fœtal de veau (FBS), qui est préalablement décomplémenté pendant 1 heure à 56°C (Lonza, Verviers, Belgique). Dans le cas des lignées multi-drogues résistantes, l’agent chimiothérapeutique en question est ajouté dans le milieu comme détaillé précédemment (Heffeter et coll., 2005 et 2007).
Ces lignées cellulaires adhérentes sont cultivées en monocouche dans des boîtes de culture en plastique (Sarstedt, Essen, Belgique). En fonction de la vitesse de croissance des lignées, le milieu de culture est changé 1 à 2 fois par semaine. Lors du repiquage des lignées cellulaires, le milieu est retiré et les cellules sont rincées rapidement avec de la trypsine-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (Lonza, Verviers, Belgique). Elles sont ensuite incubées avec cette solution durant 3 à 5 minutes à 37°C. Lorsque les cellules sont détachées de leur support, la trypsine est neutralisée par ajout d’un volume double de milieu contenant du sérum FBS. Les cellules peuvent alors être ensemencées à des taux variables en fonction de la lignée considérée et des expériences prévues.
Pour l’obtention des astrocytes, le cortex d’une souris néonatale, haché en petits morceaux avec des micro-ciseaux, est mis en suspension dans du milieu MEM dans lequel sont ajoutés
42 du glucose (6 g/l) et 10% de FBS (Invitrogen, Merelbeke, Belgique). La suspension cellulaire filtrée est ensuite étalée dans une boîte de culture de 25 cm2 pendant 72 heures avant que le milieu ne soit changé.
Après leur prélèvement, les kératinocytes sont placés dans du milieu de culture KGM-2 (keratinocyte growth medium) (BioWhittakerTM, Lonza, Verviers, Belgique). Ensuite, les kératinocytes sont maintenus sous-confluents dans du milieu Epilife complémenté avec des antibiotiques, des facteurs de croissance ainsi que des hormones (Cascade Biologics, Portland, USA). Lorsque le pourcentage de confluence dépasse 40%, les facteurs de croissance sont enlevés du milieu afin de permettre aux kératinocytes de se multiplier en condition autocrine (Atanasova et coll., 2005).
1.5 Transfection.
Afin d’augmenter spécifiquement et stablement l’expression de la kinase d’adhérence focale (FAK), les cellules U373-MG ont été transfectées avec le plasmide pCMV6-PTK2 (OriGene, Rockville, USA). Celui-ci permet le transfert d’un gène (ADNc ; acide désoxyribonucléique complémentaire) codant pour la protéine d’intérêt ainsi que le transfert d’un gène de résistance à l’antibiotique G418. Le plasmide pCMV6-XL4 (OriGene, Rockville, USA) a été utilisé comme contrôle. Un jour avant la transfection (J-1), les cellules sont ensemencées dans des plaques 6 puits de 9.6 cm2 de façon à ce que la confluence soit de 60-70% le jour de la transfection (J0). À J0, le milieu de culture est remplacé par 4 ml de milieu DMEM GlutaMAX (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, Merelbeke, Belgique) sans sérum et sans antibiotiques. La solution de transfection contenant 4µg d’ADN, 600µl de milieu et 6 µl d’agent TurboFect®
(Fermentas, Waltham, USA) est incubée pendant 20 minutes à température ambiante. Avant que les cellules ne soient placées dans des incubateurs à 37°C, 400µl de la solution de transfection est ajouté dans chaque puits au milieu de culture. Le lendemain (J1), les cellules sont rincées avec du milieu DMEM GlutaMAX complémenté avec 10% de FBS et un mélange de pénicilline et de streptomycine (200 UI/ml). Des concentrations croissantes de G418 (Geneticin® ; Invitrogen, Merelbeke, Belgique) allant jusqu’à 300 µg/ml ont été ajoutées au milieu pendant 30 jours afin de sélectionner les clones exprimant la protéine d’intérêt.
Figure 31 : Exemples macroscopique et microscopique des poumons d’une souris présentant des métastases. (A) Poumons d’une souris qui a développé des nodules tumoraux pulmonaires (noir) 23 jours après l’injection de 2.5 x 105 cellules B16F10 de mélanome dans la veine de la queue. (B) Histologie typique d’une telle tumeur, représentée à un grossissement optique de 40X (d’après Wauthoz et coll., 2010).
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