IV. Description des techniques utilisées
2. Analyses de la croissance cellulaire
2.1 Le test colorimétrique MTT.
La croissance globale d’une population cellulaire peut être évaluée indirectement grâce au test colorimétrique MTT. Le principe de ce test repose sur le fait que la succinate déshydrogénase, présente dans les mitochondries des cellules métaboliquement actives, réduit le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) de couleur jaunâtre en cristaux de formazan. Ces cristaux de couleur violacée sont ensuite dissouts dans du diméthylsulfoxide (DMSO). L’intensité de la coloration, mesurée par un spectromètre, est proportionnelle au nombre de cellules vivantes à la fin de l’expérience. Les cellules sont ensemencées au jour 0 dans des plaques 96 puits (Sarstedt, Essen, Belgique). Le taux d’ensemencement des différentes lignées cellulaires utilisées est déterminé sur base de leur courbe de croissance respective afin d’effectuer le test dans leur phase de croissance exponentielle. À J1, les cellules sont mises en présence de doses croissantes du produit à analyser, ces doses s’échelonnant en général de 10-8
M à 10-4M (Figure 32). Chaque condition expérimentale est réalisée en sextuplicat. Après 72 heures de traitement correspondant à J4, le milieu de culture est remplacé par du milieu RPMI blanc dans lequel est dilué le réactif MTT (0.5 mg/ml ; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique). Après 3 à 5 heures d’incubation à 37°C, les plaques 96 puits sont centrifugées à 1000 tours/minute durant 8 minutes afin de fixer les cristaux de formazan dans le fond des puits. La solution de MTT est alors retirée et remplacée par du DMSO (Merck, Darmstadt, Allemagne) qui solubilise les
Figure 33 : La vidéomicroscopie quantitative. (A) Les boites de culture sont déposées sous un microscope à contraste de phase, muni d’une caméra et placées dans une enceinte en plexiglass thermostatisé à 37°C. (B) La caméra, via un programme d’acquisition, prend une image toutes les 4 minutes pendant 72 heures et les envoie à un ordinateur qui les numérise. (C) Le logiciel d’analyse permet de suivre la trajectoire de chaque cellule au cours de cette période. (D) Le logiciel permet ensuite de calculer la variable MRDO (Maximal Relative Distance to the Origin) qui correspond à la distance maximale, par rapport à l’origine, parcourue par une cellule au cours du temps.
48 cristaux. Après une agitation légère, l’intensité de la coloration violette est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm avec une longueur d’onde de référence de 655 nm (Microplate Reader, Bio-Rad, Nazareth Eke, Belgique). La moyenne d’intensité de chaque concentration est calculée. Ensuite, une valeur d’IC50 par plaque MTT est déterminée à partir d’une droite de régression. À l’aide du test colorimétrique MTT, on a également mesuré après combien de temps les effets d’une molécule sont irréversibles.
2.2 La vidéomicroscopie quantitative : croissance et division cellulaire.
La croissance globale d’une population cellulaire peut être évaluée de manière directe à l’aide de la vidéomicroscopie assistée par ordinateur. Elle est associée à un logiciel d’analyse d’images développé par le Dr O. Debeir en collaboration avec le Dr C. Decaestecker (Laboratoire de l’Image : Synthèse et Analyse (LISA), Faculté des Sciences Appliquées, ULB) (Debeir et coll., 2005 et 2008).
Les cellules sont ensemencées 24 heures avant le début de l’expérience dans des boites de culture de 25 cm2 à des concentrations cellulaires variables suivant la lignée étudiée. Le jour du lancement du test, le milieu est renouvelé et le traitement avec la molécule d’intérêt est ajouté ou non (contrôles). Les boites de culture cellulaire sont ensuite placées pendant 72 heures sous un microscope à contraste de phase (grossissement 100X, Olympus, Anvers, Belgique) dans une enceinte en plexiglass maintenue à 37°C par un système contrôlé de manière électronique (Figure 33). La vidéomicroscopie est basée sur la prise d’image d’un champ cellulaire toutes les 4 minutes pendant la durée de l’expérience par une caméra reliée au microscope. Par la suite, les images sont récupérées et trois paramètres de la croissance cellulaire peuvent être déterminés : le nombre de divisions cellulaires et leur durée ainsi que la croissance globale, qui correspond au rapport entre le nombre de cellules présentes dans la dernière image sur celui dans la première image pour chaque condition expérimentale. Le ratio global de la croissance cellulaire est le rapport de croissance de la condition traitée divisée par le rapport de la condition contrôle. À titre d’exemple, si l’on dénombre 200 cellules dans la dernière image numérisée (1080ème image) en fin d’expérience et 20 cellules dans la première image de la condition contrôle, le rapport de croissance dans cette condition est de 10. Si ce rapport est de 5 dans la condition traitée, le ratio global de croissance est de 0.5 (5/10) ce qui signifie qu’il y a 50% de cellules en moins dans la condition traitée par rapport à la condition contrôle.
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2.3 La cytométrie de flux : analyse du cycle cellulaire.
L’analyse du cycle cellulaire s’effectue par marquage de l’ADN à l’iodure de propidium en cytométrie de flux. La propriété de l’iodure de propidium est de s’intercaler entre les bases de l’ADN. Lorsqu’il est soumis à une longueur d’onde d’excitation de 530 nm, il émet une longueur d’onde de 617 nm. Ce marquage est proportionnel à la quantité d’ADN présente dans la cellule ce qui permet de déterminer la proportion de cellule dans chacune des phases du cycle cellulaire (G0/G1, S, G2/M) en fonction de la réplication de leur ADN.
Les cellules sont cultivées en présence de la molécule d’intérêt. Après les temps d’analyse souhaités, les cellules sont détachées de leur support de culture (boîtes de 25 cm²) par trypsinisation et rincées deux fois au PBS avec entre chaque rinçage une étape de centrifugation à 1000 tours/min. Elles sont ensuite fixées et perméabilisées par incubation pendant au moins une nuit à -20°C dans de l’éthanol à 70%. Le jour de l’analyse, les suspensions cellulaires sont rincées deux fois dans du PBS et mises en suspension dans une solution d’iodure de propidium à 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgique) avec de la RNAse également à 1 mg/ml (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) pendant 30 minutes dans l’obscurité. Pour chacune des mesures, 10 000 cellules sont analysées. L’ensemble des mesures est faite avec un cytomètre de flux de type Quanta SC flow (Beckman Coulter Analis, Suarlée, Belgique).