IV. Description des techniques utilisées
4. Analyses de la mort cellulaire
4.4 Analyses des flux ioniques
4.4.1 Mesure de la concentration intracellulaire du calcium.
L’évaluation de la concentration intracellulaire du calcium ([Ca2+
]i) a été réalisée dans le laboratoire de Physiologie cellulaire du Professeur P. Gailly (Institut des Neurosciences, Université Catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique). La sonde Fura-2 est utilisée sous la forme de son ester acétoxyméthylique, appelée Fura-2AM. Cet ester lipophile diffuse à travers la membrane plasmique et est hydrolysé par les estérases cytosoliques en Fura-2 qui va pouvoir ensuite se chélater aux ions calcium présents dans le cytosol. L’émission de fluorescence à 510 nm du Fura-2 est obtenue en réponse à une excitation à 340 nm (F340) et 380 nm (F380) en présence et en absence de Ca2+. Une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium se traduit par une augmentation de F340 et une diminution de F380.
Les cellules sont ensemencées sur des lamelles en verre rondes de 22 mm de diamètre dans une plaque 6 puits. Après traitement avec la molécule d’intérêt, les cellules sont incubées avec 1µM de Fura-2AM (Calbiochem, Camarillo, CA) dans un tampon Krebs-HEPES (10
Figure 36 : Schéma de l’installation du « patch clamp » utilisé dans le Laboratoire Nutrition Croissance Cancer du Professeur C. Vandier (Université de Tours, France). Le dispositif expérimental est placé sur une table à coussin d’air limitant les vibrations extérieures et est isolé de l’environnement électrique grâce à une cage de Faraday reliée à la terre. Les cellules cultivées dans une boite de Pétri sont placées sur un microscope inversé. Un micromanipulateur piézoélectrique permet d’approcher la micropipette d’une cellule d’intérêt tandis que la tête de perfusion est approchée à l’aide d’un micromanipulateur hydraulique. Ce système est relié à des capillaires dont l’ouverture peut être contrôlée mécaniquement par un système d’électrovannes. La pipette de patch sert d’électrode de mesure et d’électrode d’imposition du voltage ou du courant. Elle est remplie de milieu intra-pipette (MIP) et est reliée à la tête de l’amplificateur servant d’adaptateur d’impédance. Un fil d’argent chloruré, baignant dans le MIP, permet la liaison électrique de l’électrode à l’amplificateur. Afin de fermer le système électrique, une électrode de référence est plongée dans le bain environnant les cellules. Ces deux électrodes sont reliées à un amplificateur de patch clamp qui réalise la conversion courant‐tension avant de réaliser l’amplification du signal. Cet amplificateur est relié à une carte de conversion analogique/numérique‐numérique/analogique permettant la conversion du signal physique, la tension, en un signal numérique analysable par un ordinateur. L’enregistrement des données ainsi que le contrôle des protocoles se font à l’aide de ce dernier élément de la chaine d’acquisition (imposition des voltages/courants). Le logiciel pClamp 9.2 (Molecular Devices, USA) est employé pour l’imposition des protocoles et les enregistrements (Clampex) ainsi que pour l’analyse des signaux et des courants (Clampfit) ; A : ordinateur, B : carte de conversion analogique/numérique et numérique/analogique, C : amplificateur de patch clamp, D : microscope inversé, E : table anti‐vibration, F : micromanipulateurs, G : système de perfusion, H : cage de Faraday (d’après Girault A, 2011).
55 mM HEPES, 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM glucose, pH 7.4) pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, les lamelles sont montées dans une chambre de microscope et les cellules sont alternativement excitées (1Hz) à 340 et 380 nm en utilisant un Lambda DG-4 Ultra High Speed Wavelenght Switcher (Sutter Instrument, Novato, CA) couplé à un microscope inversé Zeiss Axiovert 200 M (Zeiss Belgium, Zaventem, Belgique). Les images sont acquises avec une caméra Zeiss Axiocam couplée à un filtre d’émission de 510 nm et analysées avec le logiciel Axiovision software. Lorsque le rapport des intensités de fluorescence est déterminé, la concentration calcique intracellulaire est calculée à l’aide la formule suivante :
[Ca2+]i = Kd [(R-Rmin) / (Rmax-R)] ß
où Kd est la constante d’affinité du complexe Fura-2/calcium (=227nm), R est le rapport des intensités de fluorescence, mesuré dans les conditions expérimentales et corrigé pour l’autofluorescence (Rrepos est défini en fin d’expérience après addition du Mn2+), Rmin est le rapport minimal des intensités de fluorescence calculé après addition de 5 µM d’ionomycine et lavage consécutif à l’EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, à 2mM, pour chélater le calcium restant), Rmax est le rapport maximal des intensités de fluorescence calculé après addition d’une concentration saturante de calcium (0.25 M de CaCl2) et ß est le rapport des valeurs de fluorescence obtenues en l’absence de calcium et à saturation de calcium pour l’excitation à 380 nm.
4.4.2 Le patch clamp : mesure de l’activité du canal BKCa.
La technique de patch clamp permet d’enregistrer les courants ioniques de cellules uniques en réponse à un stimulus chimique ou physique. Le dispositif expérimental est illustré dans la
Figure 36. Le principe de cette technique est d’approcher une micropipette en verre, dont le diamètre à la pointe est de l’ordre du micromètre, d’une cellule. Lorsque la pipette est en contact avec la cellule, une résistance importante va se créer suite aux propriétés d’adhérence et d’interaction du verre avec la bicouche lipidique. Le contact ainsi formé est appelé « Seal » et le morceau de membrane isolé sous la pointe de la pipette est désigné par le terme « Patch ». La qualité de ce scellement électrique est contrôlée par la valeur de la résistance qui doit être supérieure à 1GΩ. Ensuite, une pression négative brève avec un retour à la pression normale rapide est appliquée afin de rompre la membrane (configuration « whole cell »,
Figure 37 : Schéma de la configuration « whole cell » ou « cellule entière ». Afin de rompre la membrane, une pression négative brève avec un retour à la pression normale rapide est appliquée. Le milieu intracellulaire est ainsi dialysé par le MIP de composition connue permettant le contrôle du milieu intracellulaire. Cette configuration donne un accès électrique direct à l’intérieur de la cellule ce qui permet d’enregistrer les courants macroscopiques générés par l’ensemble des canaux ioniques présents à la membrane (d’après Girault A., 2011).